Componente Curricular: Cultura Celular Prof. Dra. Ana Carolina Tramontina Acadmica: Thaise Sutil
Relatrio de Aula Prtica de Cultura Celular 1) Descreva como foi realizado o procedimento assptico de cultivo celular. Para conduzir o procedimento assptico de cultivo celular foi ligada a capela de fluxo laminar horizontal 15 minutos antes de ser utilizada, os materiais que seriam utilizados foram previamente esterilizado e separados e colocados dentro da capela de fluxo laminar, a sala de cultura foi fechado e a luz ultravioleta foi ligada e desligada aps 20 minutos. No biotrio se retirou um rato de 30, que posteriormente foi sacrificado por decapitao, o crebro foi colocado em uma placa de petri e levado para a sala de cultura onde foi realizada a remoo das estruturas cerebrais de interesse (hipocampos) e atravs dissociao mecnica com a utilizao de uma pipeta de Pasteur e um tubo de falcon em soluo tampo DPBS, aps foi adicionada tripsina e DNAse para a realizao de uma dissociao enzimtica e colocada na estufa por 15 minutos a 37C, a tripsina aps os 15 minutos foi retirada, retirou se o sobrenadante com o auxlio de uma pipeta, que foi depositado em outro tubo, este foi levado a centrifuga a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as clulas novamente suspensas em meio DMEM contendo 10% de SFB. A dissoluo do meio contendo as clulas e retirado 1 l de soluo com o auxlio de uma pipeta automtica e foi colocado em uma Cmara de Neubauer e assim contadas as clulas utilizando um microscpio de alta resoluo. Aps foi semeada em uma 24 poos utilizando uma pipeta automtica, com a densidade ficando em torno e 200 a 300 mil clulas por poo, os poos foram completados com meio de cultura, chegando a aproximadamente 500 l por poo.
2) Por que chamamos a cultura realizada de cultura primria? Qual a diferena para a cultura secundria e cultura de linhagem? A cultura realizada chamada de cultura primria porque as clulas cultivadas foram retiradas diretamente do tecido do hipocampo atravs de processos de dissociao. A principal diferena entre cultura primria e a cultura secundria que na cultura primria as clulas cultivadas foram retiradas diretamente do tecido do hipotlamo, j a cultura secundria feita a partir de clulas originadas de uma cultura primria, ou seja, aps uma passagem de clulas de uma cultura primria e para a linhagem de clulas se deve ao fato que culturas primrias so limitadas permitindo poucas divises (passagens) e as secundrias se proliferam por um nmero finito, aps as quais iro morrer, a cultura de linhagem ao contrrio permite um nmero infinito de passagem, assim como a sua proliferao infinita, pois essas clulas sofreram mutaes espontneas ou foram tratadas com mutagnicos sofrendo uma transformao ou tambm conhecido como imortalizao, que est frequentemente associada a tumorigenicidade ou sofrem modificaes genticas adicionais. 3) Descreve como foi realizado o procedimento de contagem de clulas.
Para realizar o processo de contagem de clulas foi utilizada a cmara de Neubauer, foi realizada dissoluo de certa quantidade de meio de cultura contendo as clulas, foi retirado 1 l de meio diludo e foi colocado na cmara de Neubauer, esta cmara levada at um microscpio eletrnico de alta resoluo e foi feita observao e contagem de clulas contidas em um dos quadrantes, levando em considerao as linhas superior e da direta.
4) Diferencie os processos de dissociao mecnica e enzimtica realizados. Como o mecanismo de ao da tripsina?
O processo de dissociao mecnica como o prprio nome j diz ocorre atravs de processos mecnicos, ocasionando a degradao da monocamada fisicamente que relizada com o auxlio de uma pipeta Pasteur, atravs da movimentos leves de suco da soluo tampo de DPBS contendo o tecido, mantendo a ponta da pipeta no fundo do tudo de falcon, a repetio do movimento foi realizada diversas at que fosse observado a dissociao do tecido. O processo enzimtico onde ocorre a digesto das protenas de adeso por proteases especificas ou pode ser realizado atravs da adio da enzima tripsina no meio contendo as clulas do tecido do hipocampo. A tripsina uma enzima proteoltica inespecfica que hidrolisa cadeias polipeptdicas nos radicais lisil-arginil formando terminaes de clivagem, ster e amida. Essa reao desestrutura a matriz, impossibilitando a ligao dos receptores da superfcie celular, ligados ao citoesqueleto e matriz, obrigando as clulas a rearranjarem seu citoesqueleto.