LAB 1.

I – Extração de DNA

1. Crescer as bactérias em 50 mL de meio LB com 50 µL de ampicilina (100 mg mL-1 ), durante a noite.

2. Centrifugar 2 mL da cultura durante 2 min a 4 C, a 10000 rpm e descartar o sobrenadante.
3. Ressuspender muito bem as bactérias em 100 µL de solução I (LAB A, ver LAB D).

4. Deixar 5 min à temperatura ambiente.

5. Adicionar 200 µL de solução II (preparar, LAB B), misturar bem por inversão do tubo (6-8x).

Soluções “stock”:
50x TAE 0,5 M EDTA pH8,0 5 M NaOH
1 M Tris-HCl pH8,0 10 mg mL-1 RNase 10% SDS

6. Adicionar 150 µL de solução III (LAB C), frio, misturar bem por inversão e incubar a 0C, 5-10 min.

7. Centrifugar a 4 C e 13000 rpm durante 5 min.

8. Recolher a fase aquosa ( 450 µL) para um tubo de microcentrífuga (1,5 mL)
(ter o cuidado para não apanhar sedimentos ou partículas em suspensão).
Se necessário centrifugar novamente.
9. Adicionar 0,7 volumes de isopropanol (à temperatura ambiente) ao sobrenadante e agitar com vigor.
10. Colocar os tubos na centrífuga, com orientação definida.

11. Centrifugar durante 5 min a 4 C e 13000 rpm. Descartar o sobrenadante.

12. Lavar o sedimento com etanol a 70%.
13. Secar o sedimento e dissolver em 30µL de água estéril ou TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).

14. Identificar o tubo. → _____________

LAB 1.II – Avaliação do DNA extraído

1. Prepare um gel de agarose ______% como indicado em LAB E.

Gel de agarose ____ %

1. Pesar ____ g de agarose.
2. Adicionar a _____ mL de tampão TAE 1x (40 mM Tris-acetato pH 8, 1 mM EDTA).
3. Aquecer no micro-ondas até dissolver a agarose. Tenha cuidado para não sobreaquecer.
4. Adicionar ____ µL de brometo de etídio (10mg mL-1) para uma concentração final 0,5 µg mL-1.
5. Deixar arrefecer até ~55 C.
6. Deitar no suporte do gel, colocar o pente e deixar solidificar (> 20min).
7. Retirar o pente.
8. Adicionar o tampão de corrida (TAE 1x) antes de aplicar a amostra.
2. Avalie 3 L de DNA, por eletroforese (LAB F).

Eletroforese
1.Colocar uma microgota de tampão de amostra (LAB G) numa tira de Parafilm.

Tampão de amostra (6x):

0,2% azul de bromofenol; 0,2 % xileno cianol; 60 mM EDTA;60% glicerol

2. Retirar ___ µL da amostra de DNA extraído e ressuspender na microgota de tampão de amostra.

3. Aplicar a totalidade desta mistura em um poço do gel de agarose.
4. Ligar a fonte de alimentação e selecionar a corrente adequada (ex. 70-90V).
5. Desligar a fonte.
6. Retirar o gel e colocar num tabuleiro de transporte.
7. Fotografar sob luz UV.

3. Desligue a fonte quando a frente do azul de bromofenol atingir ~2cm (~20-30min).

4. Estime a concentração da solução de DNA (LAB H) e a quantidade de DNA extraído.

Quantificação do DNA por densitometria

1. Faça o download do programa Image J, de acesso livre.
2. Em File, escolha Open para abrir a imagem pretendida.
3. Com a ferramenta retangular selecione a área que inclua a(s) banda(s) de DNA a quantificar.
4. Em Analyze escolha a opção Gels e Select First Lane, em seguida Plot Lanes.
5. A ferramenta Straight permite delimitar a área de cada uma das bandas.
6. Use a ferramenta Wand para determinar a área de cada banda.
7. Exporte para uma folha de Excel as áreas obtidas.
8. Calcule a concentração de DNA da amostra usando o padrão de concentração como referência.

5. Determine a concentração da solução de DNA por espectrofotometria (LAB I).

Quantificação do DNA por espectrofotometria

1. Colocar 198 µL de água destilada estéril em um microtubo.
2. Adicionar 2 µL da amostra de DNA.
3. Homogeneizar e centrifugar 3’’.
4. Colocar a solução numa cuvete de quartzo e ler a absorvância a 260 e 280 nm. Usar como branco_____.
5. Registar os valores.
6. Determinar a concentração de DNA (µg µL-1) na amostra e o seu grau de pureza.