1º Ciclo em BIOQUÍMICA

Química Analítica

Sebenta das Aulas Práticas

Drª Rosa Perestrelo

Prof. Dr. José S. Câmara (Regente)

2023/2024

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Trabalho 1. Determinação do teor total de compostos fenólicos e

atividade antioxidante por espectroscopia UV-Vis em resíduos

agroindustriais

OBJETIVO

O objetivo deste trabalho é utilizar a espectroscopia de UV/Vis para a determinação do

teor de compostos fenólicos totais e da capacidade antioxidante em resíduos

agroindustriais.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Preparação dos extratos hidroalcoólico

Macerar 2 g de resíduo agroindustriais em 20 mL de uma solução hidroalcoólica (1:1 v/v,

etanol: H2O). Colocar a mistura num banho de ultrassons por 20 min e posteriormente

procedeu-se à filtração à vácuo. Usar o extrato hidroalcoólico obtido na determinação do

teor de fenólicos totais e atividade antioxidante.

Teor de total de compostos fenólicos (TPC)

Num eppendorf adicionar 0,6 mL de extrato hidroalcoólico devidamente diluído, 3 mL

da solução de Folin-Ciocalteu (1:10 v/v), 2,4 mL de carbonato de sódio a 7.5% (p/v) agitar

por 10 s no vórtex. Deixar a mistura repousar por 30 min à temperatura ambiente (na

ausência da luz). Durante o tempo de espera, ligar o espectrofotómetro, selecionar o

comprimento de onda adequado (765 nm) e efetuar o auto zero.

Anotar os valores de absorbância (Abs) para cada amostra e realizar os cálculos para

determinar a concentração de ácido gálico equivalente (AGE) no extrato. Para tal, é

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necessário construir uma cuva de calibração usando o ácido gálico como padrão de

referência (gama de concentração 10 a 150 mg/L). Todos os ensaios foram realizados em

triplicado.

Teor total de flavonoides (TFC)

Preparar uma solução de cloreto de alumínio (AlCl3) em metanol com uma concentração

de 2%. Num falcon, adicionar a 3 mL de extrato hidroalcoólico devidamente diluídos e 3

mL de solução de cloreto de alumínio. Agitar no vórtex durante 10s. Deixar reagir 10 min

e efetuar a medição a 330 nm num espectrofotómetro UV-VIS, usando o metanol como

branco. Traçou-se uma reta de calibração usando uma solução padrão de ácido gálico, em

diferentes concentrações (5 - 80 mg/L). Expressar o teor de flavonoides totais em mg de

equivalentes de ácido gálico por L de extrato. Efetuar todos ensaios em triplicado.

Avaliação da Atividade antioxidante

Ensaio DPPH

Preparar uma solução-mãe de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) através da dissolução

de 24 mg em 100 mL de metanol. Efetuar a diluição da solução mãe com metanol até

obter uma absorvância de 0,900. Conservar a solução de DPPH ao abrigo da luz.

Colocar num eppendorf, 50 μL de extrato hidroalcoólico devidamente diluído e 3,95 mL

da solução de trabalho de DPPH. Deixar reagir durante 30 min e efetuar a medição da

absorvância aos 515 nm. Construir uma curva de calibração, usando como padrão o trolox

na gama de concentração 50 a 1000 µg/mL. Expressar os resultados em µg equivalente

de trolox por mL de extrato. Efetuar todos ensaios em triplicado.

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Ensaio ABTS

Preparar uma solução-mãe de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) catião

radical (ABTS) (20 mM) em 50 mL de tampão fosfato-salino (PBS, pH 7,4) e adicionar 200

μL de solução persulfato de potássio (70 mM) à solução de ABTS. Armazenar a mistura ao

abrigo da luz e à temperatura ambiente por 16 horas. Diluir a solução de ABTS com PBS até

obter uma absorvância de 0,900. Colocar num falcon, 3 mL de solução ABTS diluída e 12 μL

de extrato hidroalcoólico devidamente diluído. Após 20 minutos (ao abrigo da luz e à

temperatura ambiente) efetuar a medição da absorvância a 734 nm. Construir uma curva de

calibração, usando como padrão o trolox na gama de concentração 100 a 1500 µg/mL.

Expressar os resultados em µg equivalente de trolox por mL de extrato. Efetuar todos

ensaios em triplicado.

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Trabalho 2. Estabelecer o perfil de compostos fenólicos de resíduos

agroindustriais por UHPLC-PDA

OBJETIVO

O objetivo deste trabalho é estabelecer o perfil dos compostos fenólicos presentes em

resíduos agroindustriais através da miniaturização da técnica extrativa QuEChERS

combinada com a cromatografia em fase líquida de ultra eficiência e sistema de deteção

por fotodíodos (µQuEChERS/UHPLC-PDA).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Extração por µ-Quechers

Num falcon de 5 mL, adicionar 0,5 g de amostra e 0,4 g da mistura de sais μ-QuEChERS na

proporção de 4:1:1:0,5 (sulfato de magnésio, cloreto de sódio, citrato trissódico dihidratado e

hidrogenocitrato de sódio sesquihidratado, respetivamente) 2 mL de acetonitrilo e acetato de etilo

(1:1 v/v) acidificado com 0,1% de ácido fórmico (FA). Agitar o falcon num vortex durante 15s e

proceder a agitação ultrassónica por 10 min. Em seguida, centrifugar a mistura durante 5 min a

5000 rpm. Transferir uma alíquota (1,4 mL) da parte superior do extrato para um tubo de clean-

up de 2 mL contendo 150 mg de sulfato de magnésio e 25 mg de amina primária e secundária

(PSA). Agitar a mistura no vórtex durante 30 s e centrifugar a 5000 rpm por 5 min. Filtrar o

sobrenadante (1 mL) do extrato purificado através de uma membrana de 0,22 μm PTFE

(politetrafluoretileno) e evaporar sob uma corrente suave de nitrogénio até a secura. Reconstituir

o resíduo com 100 μL de metanol para posterior análise no sistema UHPLC-PDA. Efetuar o

processo extrativo em triplicado.

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Condições instrumentais UHPLC-PDA

Utilizar uma Acquity HSS T3 coluna analítica empacotada com uma fase alquil C18

trifuncional (2,1 mm × 100 mm, tamanho de partícula de 1,8 µm) a 40 ◦C para efetuar a

separação dos compostos fenólicos extraídos. A fase móvel será: água ultrapura acidifica

com 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e acetonitrilo (solvente B). As condições de

gradiente serão: 80% A (0 min), 60% A (3 min), 55% A (6 min), 30% A (8–10 min) e 80%

A (12–14 min), seguido de um reequilíbrio de 2 min para as condições iniciais antes da

próxima injeção, tempo total de análise 16 min. Usar um fluxo de 0,250 mL/min e um

volume de injeção de 2 μL. Definir o comprimento de onda de deteção UV para o máximo

de absorvância dos compostos fenólicos. Identificar os compostos fenólicos por

comparação dos tempos de retenção e espectros de UV obtidos para cada amostra com os

padrões puros nas mesmas condições cromatográficas.

Análise e tratamento dos resultados

Quantificação dos compostos fenólicos identificados. Curva de calibração.

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Trabalho 3. Perfil volátil de resíduos agroindustriais por HS-

SPME/GC-MS

OBJETIVO

O objetivo deste trabalho é estabelecer o perfil volátil de resíduos agroindustriais através

da microextração em fase sólida combinada com a cromatografia em fase gasosa-

espectrometria de massa (HS-SPME/GC-MS).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Extração SPME/GC-MS

Limpar a fibra divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS, 50/30

μm) durante 10 min no injetor do GC, por desorção. Em seguida, colocar 2 g de amostra,

0,5 g de cloreto de sódio (NaCl, efeito salting-out), 5 μL de 3-octanol (padrão interno,

250 μg/L) e 5 mL de H2O num frasco de vidro de 20 mL. Fechar o frasco e colocar num

banho termostático a 40 °C e inserir a fibra DVB/CAR/PDMS durante 45 min, modo

headspace. Após esse tempo, recolher a fibra e remover a fibra do frasco de extração e

proceder a dessorção térmica dos compostos voláteis no GC (6 min). A extração deverá

ser efetuada em triplicado.

Condições GC-MS

Efetuar a separação cromatográfica dos compostos voláteis num sistema de cromatografia

em fase gasosa Agilent 6890 N (Palo Alto, CA, EUA) equipado com coluna capilar de

sílica fundida BP-20 (30 m × 0,25 mm de diâmetro interno × 0,25 μm de espessura). Usar

hélio como gás de arraste com um fluxo de 1 mL/min. A temperatura do injetor, da

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interface GC-qMS e do detetor quadrupolo será de 250, 180 e 220 °C, respetivamente. O

gradiente de temperatura do GC para análise irá iniciar aos 45 °C (1 min), aumentando

para 100 °C a 2 °C/min (3 min), seguido de um aumento para 130 °C a 5 °C/min (5 min)

atingindo uma temperatura final de 220 °C a 7 °C/min (15 min), sendo o tempo de corrida

total de 70,35 min. O MS a utilizar na presente aula será um detetor seletivo de massa

inerte quadrupolo Agilent 5975, que opera por impacto de eletrões (EI) a 70 eV, mantendo

a temperatura da fonte em 180 °C. A gama massa a adquirir será de 30 a 300 m/z, a

velocidade 1,9 espectro/s, em modo full scan. Os compostos voláteis serão identificados

por comparação dos tempos de retenção (RT), e espectros de massa do GC com os do

padrão, quando disponíveis; e por comparação de seus espectros de massa disponíveis na

base de dados NIST com uma probabilidade de correspondência superior a 80 %.

Análise e tratamento dos resultados