Fundamentos de Toxicologia Experimental

EXTRAO E IDENTIFICAO DE AFLATOXINAS EM AMENDOIM POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

1. Finalidade Realizar a determinao e quantificao de aflatoxinas em amostras de amendoim ou paoca (derivada de amendoim) pela tcnica de cromatografia em camada delgada.

2. Fundamentos dos Mtodos O conhecimento dos nveis de aflatoxinas em produtos naturalmente contaminados por essas micotoxinas s pode ser observado por meio de mtodos de anlise adequados. Tais mtodos so necessrios para fiscalizao, o controle da qualidade, a monitorizao e a pesquisa nos seus vrios aspectos, seja anlise de sementes, gros, alimentos e raes, estudos epidemiolgicos, estudo da produo de micotoxinas e do metabolismo dos fungos toxignicos, verificao da estabilidade durante o processamento de alimentos, condies de armazenamento ou descontaminao. As aflatoxinas so extradas com metanol/cloreto de potssio da matriz usada para anlise. Posteriormente realizada a etapa de limpeza, com a precipitao de protenas com agentes clarificantes, sulfato de cobre ou sulfato de amnia. As aflatoxinas so re-extradas com clorofrmio por partio lquido-lquido e separadas dos componentes do extrato por cromatografia em camada delgada (CCD). A CCD uma tcnica de separao de misturas e identificao de seus componentes. Esta separao depende da diferena entre o comportamento dos analitos entre a fase mvel e a fase estacionria. A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciada por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e especficos efeitos de afinidade e solubilidade. A deteco e a quantificao das aflatoxinas podem ser realizadas por anlise visual sob luz ultravioleta (ex=366nm) ou por outras tcnicas mais avanadas e precisas, porm tambm de maior custo.

3. Fluxograma dos Mtodos

Pesagem de 50g de paoca Mindy

Adio ao bquer da paoca macerada

Adicionar 270 mL de metanol e 30 mL de soluo KCl 4% (Bquer)

Agitao por 2 min. Transferir 150 ml do filtrado anterior para um funil de separao com 150 ml de gua (homogeneizar)

Descrito na figura:

Misture 150 mL do extrato filtrado com 150 mL de clarificante (Soluo de CuSO4 10%) e mais 5g de Celite. Depois filtrar

Com auxlio de um papel de filtro, filtrar a mistura

Adio de 10 mL de clorofrmio (homogeneizar por 5 min.)

Extrao da fase orgnica (coletada em um erlenmeyer)

Fazer novamente a lavagem da soluo com clorofrmio para a segunda extrao

Aps a evaporao do solvente, observou-se um resduo slido

O total coletado foi adicionado em um erlenmeyer e foi colocado em uma chapa de aquecimento

Extrao da fase orgnica (Coletada no mesmo erlenmeyer da outra extrao)

Ento foram adicionados 500 L de

clorofrmio para redissoluo

Aplicao de 10 L da amostra
em uma placa de slica em gel atravs de um capilar (1 cm)

Feita a cromatografia em camada delgada (tolueno: acetato de etila: cido frmico 60:30:10) (

Realizada a leitura em cuba com lmpada UV (=366nm)

4. Resultados e Discusso Depois de realizada a tcnica, a placa que continha a amostra foi lida na cuba com luz UV e notou-se a ausncia de fluorescncia que corresponde com a fluorescncia de uma placa com os padres de aflatoxinas B1, B2, G1, G2. Entretanto a quantidade de aflatoxinas foi calculada para uma amostra contamina que continha as aflatoxinas e com florescncia compara com os padres de certa quantidade, como mostra a Tabela 1:
Tabela 1 - Dados da amostra contamina que j se encontrava no laboratrio.

Aflatoxinas B1 B2 G1 G2

Volume do padro correspondente 3,5 L 5,0 L 3,5 L 5,0 L

Atravs da equao abaixo, calculamos a quantidade em g/Kg de aflatoxinas.

Onde: S = L da aflatoxina padro, de fluorescncia e Rf igual amostra; Y = concentrao de aflatoxina padro, em g/mL usada na cromatografia; V = L de solvente requerido para diluir o extrato final; W = gramas de amostra contida no extrato final. A partir dos clculos obtemos a quantidade de aflatoxinas na amostra contaminada, como mostra a Tabela 2.
Tabela 2 - Quantidade de aflatoxinas na amostra contaminada.

Aflatoxinas B1 B2 G1

Quantidade (g/Kg) 33,6 48,0 33,6

G2 TOTAL

48,0 163,2

5. Laudo frente ao resultado Para a amostra da paoca Mindy encontradas no mercado, por est tcnicas no foi observado nenhum dos tipos de aflatoxinas presente. Na amostra contamina encontrou-se um total de 163,2 g/Kg de aflatoxinas, e como o limite mximo tolervel de 20 g/Kg de aflatoxinas totais, est amostra inadequada para consumo.

6. Referncias Bibliogrficas CALDAS, E.D; SILVA, S.C; OLIVEIRA, J.N. Aflatoxinas e ocratoxina A em alimentos e riscos para a sade humana. Rev Sade Pblica, v. 36(3), p. 31923, 2002.

SEGAWA, K.A do A; MACHINSKI, M.J. Mtodos analticos para determinao de aflatoxinas em milhos seus derivados: Uma reviso. Revista Analytica, v. 24, 2006.

MORAN, E.F; SIQUEIRA, C.A.C. Toxicologia Analtica. Aflatoxinas: Anlise em amendoim por cromatografia em camada delgada (Cap. 21). Texto de MACHINSKI, M.J.

ANEXO A Clculos da quantidade de aflatoxinas na amostra contaminada.