2.

Experimental

2.1. Reagentes e materiais vegetais

Reagentes de grau analítico foram usados no desenvolvimento deste estudo e todas as soluções foram
preparadas usando água de alta pureza obtida de um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore,
Bedford, EUA).

Tudo o material de laboratório foi descontaminado a 10% (v v−1) Banho de solução de HNO3 por 24 h
e enxaguado com água de alta pureza. Posteriormente, todos os materiais foram secos em condições
de ar limpo à temperatura ambiente.

Todos os solventes e reagentes foram dos mais altos disponíveis comercialmente

grau de pureza. Catequina (lote Sigma-Aldrich® C1251: BCBH43V atribuiu purezas de 98,9), foram
utilizados os ácidos clorogênico e vanílico (Sigma-Aldrich®).

Metanol e ácido acético grau HPLC foram obtidos da Vetec.

Tudo os produtos químicos utilizados eram de grau analítico sem purificação adicional.

O ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Quimex® (Merck, Brasil).

As soluções foram preparadas a partir de soluções estoque de referência (1000,0 μg mL −1

), a partir de taxas e diluições apropriadas necessárias para preparar soluções de referência com
concentração final variando de 1,0 a 50,0 μg mL−1

. As soluções foram armazenadas em frascos de polietileno previamente descontaminados.

As amostras de medicamentos fitoterápicos, disponíveis comercialmente na forma

de cápsulas de gelatina (Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss e Ptychopetalum uncinatum) e comprimidos

(Cynara scolymus L.) “Globe alcachofra” contendo o extrato seco, foram adquiridos em drogarias locais
de Salvador, Bahia, Brasil. As formulações não continham excipientes, conforme o rótulo. Drogas
vegetais (Cynara scolymus L. “Globe alcachofra” e

Ptychopetalum uncinatum) foram adquiridos em feiras em Salvador, Bahia, Brasil. Todas as amostras
foram originalmente armazenadas em recipientes plásticos fechados até análise.

2.2. Preparação de amostra

Os extratos foram preparados em triplicata adicionando 30 mL de metanol acidificado com 100 μL de

ácido clorídrico concentrado a 0,5 g de massa de fitoterápico e agitação por 30 min em mesa agitadora
(QUIMIS Q-225-M) a 100 rpm. Os extratos foram filtrados e concentrados em

Evaporador rotativo (IKA RV 10) a 40 °C e 40 ambar. O material resultante foi solubilizado em 1,5 mL
de metanol, armazenado a -20 °C e filtrado através de um filtro de seringa de PTFE (0,45 μm) antes de
HPLC e determinações espectroscópicas.

2.3. Instrumentos cromatográficos e condições

A análise LC-DAD foi realizada em um sistema de cromatografia líquida Shimadzu (Shimadzu Scientific
Instruments, Japão), consistindo de um bomba quaternária de alta pressão (LC-20 CE, Shimadzu);
Desgaseificador a vácuo; Válvula de injeção manual de alta pressão (loop de injeção de 20 μL) e um
sistema de detecção de matriz de fotodiodos (PDA) (SPD-20A, Shimadzu). o

o cromatógrafo líquido foi equipado com uma coluna “Licrhospher®” RP 18 (Agilent), 5 μm, 4,6 × 250
mm, controlada pelo LC-System

Programas.
A separação por LC foi realizada a 40°C com solventes analíticos, constituindo uma mistura de eluição
binária consistindo em metanol (grau HPLC), com (A) 1,0% de ácido acético (v v−1) e (B) (metanol).
Cromatografia foi realizado por 40 min a uma taxa de fluxo constante de 1,0 mL min -1

. o programa de gradiente foi o seguinte: 0-10 min, 100% A; 10–20 min, 70% A;

20–30 min, 10% A; 30–37 min, 70% A e 37–40 min, 100% A.

As plantas produzem vários produtos químicos e alguns podem ser usados como

marcadores. A partir dos dados obtidos na literatura científica, um metabólito foi estudado por
fitoterapia: ácido clorogênico (CGA) em Cynara scolymus; Ácido vanílico (VA) em Ptychopetalum
uncinatum e catequina em Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss. Em uma preliminar qualitativa

análise, eles foram testados em diferentes comprimentos de onda (nm), de acordo com a literatura. A
detecção de UV foi realizada em 260 nm para vanillic

ácido; 280 nm para (+)-catequina e 330 nm para ácido clorogênico. A identificação e as análises
qualitativas foram realizadas por comparação com

espectros padrão em cada tempo de retenção (Tr) [26].

2.3.1. Validação de condições cromatográficas

Todas as amostras e padrões foram analisados em triplicata e precisão foi avaliada pela realização de
ensaios intra-dia e inter-dia por seis injeções replicadas das soluções padrão. Limites de detecção

(LOD) e quantificação (LOQ), detectado como a concentração de injeção forneceu alturas de pico 3 e
10 vezes a relação sinal-ruído (s/n), foram adquiridos. O método analítico para a quantificação da
catequina, ácidos clorogênico e vanílico foi validado por HPLC, de acordo com

Diretrizes da Anvisa [27,28] e ICH [29]. Para demonstrar se o método era adequado, ele foi validado
por meio da análise de parâmetros de estabilidade, linearidade, precisão e exatidão.

2.3.1.1. Estabilidade e especificidade. A estabilidade de soluções e amostras de catequina, ácidos

clorogênico e vanílico foi avaliado por 24 h em ambiente

temperatura, mantida a 37 °C por 2 h em 0,01 e 0,1 mol L-1 HCl, por verificação de alterações no sinal
analítico após análise por HPLC-DAD.

A especificidade foi determinada analisando o perfil cromatográfico (tempo de retenção) de

compostos padrão a 0,1 mol L-1 HCl (em branco), para verificar a presença de interferência. As
formulações não continham excipientes.

2.3.1.2. Linearidade. Alíquotas de 1000,0 μg mL−1 soluções de referência de cat echin, ácidos
clorogênico e vanílico, pr

foram transferidos para frascos volumétricos para obter as concentrações finais

de 1,0; 5,0; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0 e 50,0 μg mL−1

. Cada solução

foi preparado em triplicado. A linearidade foi avaliada por regressão linear,

que foi calculado pelo método de regressão dos mínimos quadrados. Uma boa linearidade foi obtida
para todas as linhas observadas (r = 0,9995–0,9999).
2.3.1.3. Precisão e exatidão. Repetibilidade e precisão intermediária

foram usados para avaliar a precisão do método. A repetibilidade foi avaliada através do desvio padrão
relativo (RSD) dos dados de recuperação

no nível de 100% [30] em dois dias diferentes, e precisão intermediária

por meio de RSD inter-dia, usando HPLC-DAD.

Um estudo de recuperação foi realizado adicionando quantidades conhecidas (5 μg) de

cada solução de referência de catequina, ácidos clorogênico e vanílico a um amostra. A recuperação

dos dados foi realizada em triplicata.

2.3.1.4. Limites de detecção e quantificação. As figuras de mérito de cada procedimento foram

avaliados com base nos limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) sob condições robustas de
HPLC-UV–Vis/PDA. O os limites de detecção do método (LOD) foram calculados usando o critério 3σ,
que

é, a concentração equivalente a três vezes o desvio padrão (3σ) do sinal (n = 10) da solução em branco
do reagente
reações de escurecimento oxidativo [37]. As folhas de Cynara scolymus L.

A “alcachofra do globo” é reconhecida desde os tempos antigos por sua

efeitos benéficos e terapêuticos (promoção da circulação sanguínea,

mobilização de reservas de energia, indução de colerese, inibição de

biossíntese de colesterol e oxidação de LDL, além de atividades antibacterianas, antifúngicas e

antioxidantes significativas, além de fortes efeitos hepatoprotetores). Essas ações podem estar
estritamente relacionadas com a

fração polifenólica [38].

Fratianni et al. [38] avaliaram o teor total de fenol (clorogênico

ácido cumárico, ácido ferúlico, apigenina, luteolina e cinarina) em

Cynara scolymus L. “Globe alcachofra” na Itália por HPLC. Os autores

encontraram uma quantidade significativa de ácido clorogênico (5,50 a 8,14 μM g−1

).

A fase móvel incluiu água de grau HPLC (contendo 0,1%

ácido trifluoroacético; solvente A) e 95% de acetonitrila (contendo 0,1%

ácido trifluoroacético; solvente B). Lutz et ai. [10] comparou a química

composição e propriedades antioxidantes de alcachofras maduras e baby,

cru e após o cozimento. O teor de ácido clorogênico foi determinado

por HPLC. A fase móvel era uma mistura de (A): H2O ajustado para pH 2,4

com 99% de ácido acético, e (B): acetonitrila. A faixa de 112,73 a

456,30 mg/100 g foi encontrado para o ácido clorogênico.

O método deste estudo propõe o uso de metanol e água como

solventes, reduzindo a toxicidade, de acordo com os princípios de

Química verde. O intervalo foi de 71,28 a 925,99 mg g-1 clorogênico

ácido para "Globe alcachoke" (comprimido) e Globe alcachoke (droga vegetal), respectivamente, e
41,50 a 60,09 mg g−1 para Ptychopetalum olacoides,

comercializados na Bahia-Brasil. Esta planta é cultivada em todo o mundo e numerosos

variedades comerciais e locais adaptadas a diferentes ambientes, podem

diferem na composição química, especialmente da fração polifenólica,

e, portanto, exibem diferentes nutracêuticos e farmacológicos

propriedades.

4. Conclusões

Nas últimas décadas, o consumo de Plantas Medicinais e Ervas

Os medicamentos vêm aumentando, e a necessidade de maior controle

sua qualidade pela Indústria Farmacêutica, torna-se relevante para garantir segurança e eficácia.

O método proposto atende aos requisitos da química verde e sustentável, utilizando solventes menos
tóxicos a um custo menor. A análise

desempenho mostrou que o método foi satisfatório, considerando

as figuras de mérito e os parâmetros que avaliam a separação

eficiência. Os bioativos fenólicos foram separados em b13 min e os

os resultados indicam que Cynara scolymus L. Alcachofra “Globe alcachofra”,

Ptychopetalum olacoides “Marapuama” e Maytenus ilicifolia Martius

ex Reissek “Espinheira Santa”, comercializado em Salvador-Bahia-Brasil

(plantas e fitoterápicos), são fontes de espécies antioxidantes.

Os resultados mostraram que as amostras analisadas apresentaram variaes

níveis de ácido clorogênico, catequina e ácido vanílico, que podem representar

um risco para a terapia do paciente.

Reconhecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro recebido da

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq). Grupo de Pesquisa: “Biofarmacêutica e Fármacos”, Universidade Estadual da Bahia (UNEB).

Mais sobre o texto originalÉ necessário fornecer o texto original para ver mais informações sobre a
tradução

Enviar feedback

Painéis laterais

3 Resultados e discussão

Desenvolver o método e identificar os picos (catequina, clorogênico,e ácidos vanílicos), 20 μL de

solução padrão (1000 μg mL−1)

foram injetados no sistema HPLC. O metanol foi então usado como solvente orgânico e o pico era
simétrico, com tempo de retenção livre das interferências. No programa gradiente escolhido,
compostos fenólicos bioativos eluiram a 9,86; 10,60 e 12,46 min para catequina, clorogênico e
vanílico

ácidos, respectivamente. O espectro UV deste pico mostra bandas em diferentes comprimentos de

onda: 260 nm para ácido vanílico; 280 nm para ácido gálico e

(+)-catequina e 330 nm para ácido clorogênico. Esses dados de retenção

tempo e espectro UV foram usados para identificar e confirmar esses picos fenólicos bioativos nas
amostras.

3.1. Desempenho analítico

Na faixa de concentração escolhida (de 1 a 50 μg mL −1 bioativo

fenólicos), a linearidade foi mantida com r = 0,9996. O limite de quantificação no extrato final foi
estimado através do desvio padrão do coeficiente linear. Os limites de detecção (LOD) e quantificação
(LOQ)

obtidos para os ácidos clorogênico e vanílico e (+)-catequina foram

0,020; 0,025 e 0,031 μg g−1

, respectivamente. Nos ensaios de precisão, todos os desvios padrão ficaram abaixo da média de 0,5%
em três alíquotas. Intra (RSD

b 6%) e precisão inter-dias (RSD b 10%). As curvas de calibração desenvolvidas foram consideradas
estáveis, uma vez que o padrão relativo

os valores de derivação (RSD) da inclinação foram todos inferiores a 2,0%.

Neste método de extração, um padrão de adição foi usado para fenólicos bioativos em medicamentos
fitoterápicos. Primeiramente, 5 μg de cada composto fenólico bioativo (catequina, ácidos clorogênico
e vanílico) foram adicionados a um

amostra, que foi previamente analisada e não tinha fenólicos bioativos quantificáveis, uma solução
padrão e, em seguida, a extração foi realizada

Fora; a análise foi realizada usando HPLC. Essa análise mostra que o

foi eficiente para extrair fenólicos bioativos desse tipo de

matriz (Fig. 1). Para garantir que não haja conteúdo de fenólicos bioativos nas amostras após a
extração, o resíduo sólido da primeira

tratamento foi retratado com 100 μL de solução clorídrica concentrada

ácido e solubilizado em 1,5 mL de metanol, injetado no sistema HPLC e nenhum pico em 4,5 min foi
detectado. A recuperação média obtida

ficou na faixa de 95,2 a 100,9% para fenólicos bioativos, o que indicou a boa acurácia do método.

Todas as amostras apresentaram alguns fenólicos bioativos, conforme mostrado na Tabela 1. O

O maior teor de ácido clorogênico foi obtido para (Cynara scolymus

L.) “Alcachofra globo” (droga vegetal). Os níveis deste fenólico bioativo

em Ptychopetalum uncinatum foram ligeiramente maiores nas cápsulas. O

os teores de ácido vanílico foram maiores para (Cynara scolymus L.) “Globe ar tichoke” (comprimido) e
semelhantes para Ptychopetalum uncinatum (cápsula de gelatina e fármaco vegetal). As cápsulas de
gelatina, contendo Maytenus ilicifolia
Mart ex Reiss, apresentou teores de catequinas abaixo dos encontrados por

Cipriani et ai. [31].

Cada um dos extratos analisados apresentou uma cromatografia semelhante.

perfil, revelando vários componentes principais e uma série de pequenas

picos. A Fig. 2 mostra os perfis cromatográficos (espectro UV/DAD)

para catequina, ácidos clorogênico e vanílico, na análise de fitoterápicos medicamentos.

Os fenólicos bioativos são um objeto de interesse em plantas. Na literatura, foi possível encontrar
trabalhos onde bioativos em Ptychopetalum olacoides foram analisados. Colombo et ai. [32]
desenvolveram um método para

a determinação de ácido vanílico em extratos comerciais de

Ptychopetalum olacoides (pó seco solúvel em água comercial, fluido comercial e extrato seco
comercial). Eles usaram um Phenomenex

coluna de fenil-hexil Luna e uma fase móvel consistindo de 1% de

ácido acético-acetonitrila, com eluição gradiente linear de 5 a 100% ace-tonitrila em 40 min, a uma
taxa de fluxo de 1,0 mL·min−1

. O método é baseado

sobre a utilização de acetonitrilo em vez de metanol que, infelizmente, é

não é a melhor ideia. Neste estudo, a novidade do método baseia-se na

o uso do metanol, pois é mais barato e menos tóxico que o acetonitrila.

A faixa obtida para o ácido vanílico foi de 0,02 a 4,90 (mg ácido/g de extrato) em um comprimento de
onda de 261 nm. Neste estudo, obteve-se um intervalo entre 17,35 e 19,21 (mg ácido vanílico/g
extrato). O a análise das substâncias ativas é essencial para avaliar a segurança e a eficácia do uso de
fitoterápicos; no entanto, a composição química podem variar devido às condições climáticas e
agronômicas de cultivo, como como órgão vegetal, condições de armazenamento, localização
geográfica, impacto do ar poluição e processos de produção de alimentos [33].

Vistuba e cols. [34] avaliaram o perfil qualitativo de diferentes flavonoides em um extrato de Maytenus
ilicifolia Martius ex Reissek por HPLC-MS/

MS e observou que a maioria dos taninos eram derivados de catequinas

e epicatequinas. Portanto, a determinação do teor de catequinas

em extratos secos de Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek é uma alternativa para avaliar o perfil
qualitativo dos compostos tânicos presentes

na amostra. Cipriani et ai. [31] identificaram catequina e epicatequina em

folhas de Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek por GC–MS, quantificado

por HPLC, e encontrou 1,6 e 1,7% em peso seco, respectivamente. Nisso

estudo, os níveis de catequina foram encontrados na faixa de 0,3937 a

0,7489 mg g-1

, correspondendo a cerca de 0,1%. Este fato representa a

necessidade de estender os testes de controle de qualidade para determinação de catequinas no

amostras analisadas, uma vez que os laboratórios não declararam o teor do ingrediente ativo no
rótulo.

Os resultados para a determinação de catequina nas formulações

contendo Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek, mostrou que a catequina

conteúdo nas cápsulas de gelatina de três laboratórios diferentes

grande variação. O fitoterápico A apresentou maior concentração de

catequina, em comparação com os outros produtos à base de plantas. Baggio et ai. [17] relataram que
extratos enriquecidos com flavonóides e caracterizados pela

a presença de (2%) catequina, (3,1%) epicatequina e (27%) galactitol apresentou melhor redução da
secreção gástrica. Esses dados mostram a importância da determinação desses marcadores, uma vez
que os medicamentos fitoterápicos à base de

Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek são indicados para o tratamento

de distúrbios estomacais, como úlceras e gastrite [35].

O consumo de Plantas Medicinais e Fitoterápicos tem sido

crescente, e a necessidade de maior controle de sua qualidade pela Indústria Farmacêutica, torna-se
um fator relevante para garantir sua segurança

e eficácia. No Brasil, em 2006, o Ministério da Saúde aprovou a Política Nacional de Práticas

Integrativas e Complementares (PNPIC), em

Sistema Único de Saúde (SUS) e incluiu Maytenus ilicifolia

Martius ex Reissek “Espinheira santa” para o tratamento de distúrbios estomacais (gastrite e úlcera) e
outras atividades farmacológicas (anti-inflamatório, antiespasmódico, antiácido e cicatrizante) [36].

Muitos estudos se concentraram em sua saúde e propriedades antioxidantes

relacionados com a fração polifenólica como antioxidantes e substratos para