UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E EVOLUÇÃO

RELATÓRIO LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

AULA 4: TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE AMINOÁCIDOS

Discentes:
Grupo 4
Ana Caroline Reis de Camargo; RA: 770438
Caroline Santos de Oliveira; RA: 790987
Gabriela Siviero Erra; RA: 800807
Giovana Martins Campos Simioni; RA: 801049
Isabella Vitória Alonso; RA: 794824
Letícia Piazentin Dantas; RA: 791005
Natália Ribeiro Crispim; RA: 790706

Docentes:
Profa. Dra. Andrea S. da C. Fuentes
Prof. Dr. Iran Malavazi

São Carlos
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................ 3
2. OBJETIVOS..................................................................................................................... 5
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................ 6
3.1. Materiais.................................................................................................................. 6
3.2. Métodos.................................................................................................................... 6
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................7
4.1. Titulação de glicina................................................................................................. 7
4.2. Titulação de histidina..............................................................................................9
4.3. Glutamato.............................................................................................................. 12
5. CONCLUSÃO................................................................................................................ 14
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 14

2
1. INTRODUÇÃO
Os aminoácidos desempenham um papel crucial na formação das proteínas, que são as
macromoléculas mais abundantes nos seres vivos e desempenham uma ampla variedade de
funções biológicas. Cada aminoácido consiste em um carbono α (alfa) central, ao qual estão
ligados um átomo de hidrogênio, um grupo amina (NH2), um grupo carboxílico (COOH) e
uma cadeia lateral única chamada de grupo "R". A diversidade nas cadeias laterais é o que
confere características distintas a cada aminoácido, influenciando propriedades como
estrutura, tamanho, carga elétrica e solubilidade em água.
Essas diferenças nas cadeias laterais não apenas conferem propriedades
físico-químicas específicas a cada aminoácido, mas também desempenham um papel
fundamental na manutenção das estruturas tridimensionais das proteínas. Isso ocorre devido a
interações fracas, como ligações de hidrogênio, forças hidrofóbicas e interações eletrostáticas,
que contribuem para a conformação específica das proteínas.
É importante destacar que, apesar da ampla diversidade de funções e estruturas que as
proteínas podem desempenhar, todas elas são compostas a partir de um conjunto limitado de
20 aminoácidos. Essa limitação é compartilhada em todos os seres vivos e é fundamental para
a complexidade e variedade das proteínas encontradas na natureza. Além disso, esses
aminoácidos podem ser classificados em cinco categorias principais com base nas
propriedades de suas cadeias laterais, bem como em três tipos principais com base em sua
essencialidade na dieta e capacidade de síntese pelo organismo.
Os aminoácidos alifáticos apresentam o grupo R apolar e hidrofóbico. Esta classe
engloba os aminoácidos alanina, valina, leucina, isoleucina, glicina, metionina e prolina,
sendo que as cadeias laterais da alanina, valina, leucina e isoleucina apresentam alta
capacidade de realizar interações hidrofóbicas, fazendo com que estas se agrupem no interior
de proteínas. As outras, apesar de sua característica apolar, não apresentam este mesmo
comportamento (Nelson, 2014).
Os aminoácidos aromáticos apresentam em sua cadeia lateral um anel aromático e
possuem capacidade de participar em interações hidrofóbicas, uma vez que a presença do anel
aromático faz com que estes aminoácidos sejam relativamente apolares. Fazem parte da classe
dos aromáticos a fenilalanina, o triptofano e a tirosina, sendo o grupo hidroxila presente nesta
última, capaz de realizar ligações de hidrogênio, podendo ser um importante grupo funcional
de enzimas (Nelson, 2014).
Os aminoácidos não carregados são moléculas que apresentam grupo R polar, com
maior solubilidade em água e hidrofilia do que os demais aminoácidos que possuem
3
apolaridade, fator que se dá pela presença de grupos funcionais capazes de realizarem
ligações de hidrogênio com a água. Esta classe de aminoácidos é composta pela serina,
treonina, cisteína, asparagina e glutamina. Apesar de sua polaridade, o aminoácido cisteína é
capaz de formar um aminoácido chamado cistina, que é composto por duas moléculas ou
resíduos de cisteína ligados por uma ligação dissulfeto, em uma relação apolar e hidrofóbica
(Nelson, 2014).
Os aminoácidos carregados positivamente possuem seu grupo R hidrofílico e
apresentam natureza básica, com uma carga positiva significativa quando em um pH 7,0. É
uma classe composta pela lisina, arginina e histidina, sendo esta última capaz de não
apresentar carga ou apresentar carga positiva quando em pH 7,0, uma vez que apresenta uma
cadeira lateral ionizável com pKa quase neutro (Nelson, 2014).
Os aminoácidos carregados negativamente são moléculas com cadeia lateral com
carga negativa final quando em pH 7,0, apresentando caráter ácido dado o seu grupo carboxila
a mais. Esta classe é composta pelo aspartato e pelo glutamato (Nelson, 2014).

Figura 1. Representação estrutural e classificação dos 20 aminoácidos. Fonte: Lehninger

4
 Ao analisar os grupos ionizáveis, é possível observar que, ao formar uma base
conjugada, a forma ácida libera um próton, enquanto que, para realizar a situação oposta, a
forma básica se liga a um próton para a formação do ácido. O valor de Ka, que representa a
constante de dissociação ácida, é possível de ser definido ao analisar a capacidade de
dissociação do ácido. Geralmente, os valores de Ka são muito baixos, tornando necessário o
uso da ferramenta matemática logarítmica para melhor manuseio de dados. Ao utilizarmos o
valor negativo do logaritmo de Ka, obtemos um valor denominado pKa. O valor do pKa pode
variar de acordo com condições ambientais, como polaridade, ausência ou presença de água e
potencial de formação de pontes de hidrogênio. Os aminoácidos lisina e arginina são
considerados básicos, uma vez que possuem átomos de nitrogênio em seu grupo R,
apresentando um valor alto de pKa e atuam como base no pH do organismo. Os aminoácidos
que possuem outro grupo carboxílico em sua cadeia lateral são denominados aminoácidos
acídicos, com um valor de pKa relativamente baixo e com facilidade de perda de prótons
(Devlin, 2006).
Para monitorar o progresso de uma titulação ácido base e determinar o ponto de
equivalência da reação, é realizada a titulação potenciométrica. Esta é uma técnica que
permite determinar os valores de pK e pKa dos grupos ácidos e básicos presentes nos
aminoácidos. Isso pode ser alcançado medindo a variação do potencial elétrico em relação ao
pH durante uma titulação. O pKa é o valor de pH no qual metade do grupo funcional está
ionizado, e o Ka descreve a facilidade com que um grupo funcional perde um próton. Os
valores de pK e pKa específicos para os grupos amino e carboxila de cada aminoácido
fornecem informações sobre como esses grupos funcionais reagem em diferentes ambientes
de pH (Pereira et al., 2011).
Ademais, a determinação dos pontos isoelétricos (pI) dos aminoácidos é essencial para
a caracterização das propriedades de carga dos aminoácidos, além disso, podem ser utilizados
em aplicações de separação e purificação de aminoácidos. O pI é o valor de pH no qual a
carga líquida de uma molécula de aminoácido é igual a zero. Isso ocorre porque, neste pH, os
grupos ácidos e básicos dos aminoácidos estão em equilíbrio, resultando na formação de
"zwitterions" processo que ocorre quando uma molécula de aminoácido se torna eletricamente
neutra (Nelson, 2014).

2. OBJETIVOS
O presente experimento teve como objetivo a identificação de aminoácido
monoamínico monocarboxílico (glicina) e aminoácido diamínico e monocarboxílico
5
carregado positivamente (histidina) por meio de seu potencial de dissociação (pKa),
utilizando a técnica de titulação ácido base. Com o intuito de analisar as propriedades
químicas e iônicas dos aminoácidos.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
- pipeta p100
- barra magnética
- glicina (0,1 mol/L)
- histidina (0,1 mol/L)
- béquer
- potenciômetro
- pHmetro
- agitador magnético
- ácido clorídrico
- bureta
- NaOH

3.2. Métodos
Inicialmente, a primeira titulação foi realizada com o aminoácido glicina.
Primeiramente, com auxílio de uma pipeta, foi adicionado 50 ml do aminoácido em um
béquer, e inserido uma barra magnética. Em seguida, realizou-se a calibração do
potenciômetro com solução tampão de pH 4,0 e 7,0. O béquer foi posto sob o agitador
magnético, no qual foi ajustado a sua agitação. Posteriormente, inseriu-se o eletrodo do
pHmetro, sendo medido e anotado o valor inicial da solução de aminoácido. Com auxílio
de um conta gotas a solução foi protonada com HCl, vagarosamente, até atingir o pH de
1,6. Após, foi iniciado a titulação com NaOH 0,5 mol/L, anotando os valores medidos a
cada 0,5 ml de NaOH. Essa titulação foi realizada até a solução atingir um pH,
aproximadamente, 12. O processo foi repetido para a histidina.
Após confeccionou-se gráficos relacionando o pH e o volume de NaOH, e
analisou-se regiões de tamponamento e as propriedades químicas.

6
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Titulação de glicina
O primeiro aminoácido a ser realizado a titulação foi a glicina, um aminoácido
monoamínico e monocarboxílico, conhecido por apresentar a cadeia lateral mais simples
pois é composta apenas por um H. Sendo seus valores de pk1, pk2 e pI respectivamente:
2,34, 9,6 e 5,97, a mesma apresenta uma curva de titulação com duas fases de
tamponamento bem definidas. Na imagem abaixo (figura 2) é possível observar sua
conformação em cada uma das etapas que compõem o processo de titulação.

Figura 2: Na conformação da direita, é possível observar a estrutura da glicina em sua forma

protonada, ela será apresentada em pH ácido (abaixo do seu pk1). Em pH próximo de 6,00 a estrutura
apresentada será a do meio, em sua forma neutra. Já em pH ácido (acima do seu pk2) a glicina se encontrará
em sua forma desprotonada. Fonte: Lehninger.

Seguindo as etapas descritas na metodologia foram utilizados 50 mL de glicina

(0,1 mol/L), apresentando um pH inicial de 6,55. Foi necessário protonar o aminoácido
através da adição de HCl ao meio, para que fosse possível observar com clareza a curva de
titulação passar pelos pontos de pK1 e pI. Posteriormente ocorreu a titulação por meio da
adição de NaOH. Os dados coletados durante o processo estão apresentados na tabela a
seguir.

Tabela 1: valores de pH obtidos a partir da titulação de glicina com NaOH, a cada 0,5 mL de base
adicionados. Fonte: autoria própria

NaOH (mL) pH NaOH (mL) pH NaOH (mL) pH NaOH (mL) pH

0 1,6 8,5 2,4 17 7,66 25,5 9,93
0,5 1,62 9 2,47 17,5 8,23 26 10
1 1,65 9,5 2,53 18 8,63 26,5 10,08
1,5 1,7 10 2,58 18,5 8,83 27 10,15
2 1,73 10,5 2,64 19 8,98 27,5 10,25
2,5 1,77 11 2,7 19,5 9,09 28 10,34
3 1,81 11,5 2,76 20 9,2 28,5 10,44

7
 3,5 1,86 12 2,83 20,5 9,29 29 10,56
4 1,92 12,5 2,91 21 9,37 29,5 10,71
4,5 1,96 13 2,98 21,5 9,44 30 10,92
5 2,02 13,5 3,07 22 9,5 30,5 11,18
5,5 2,08 14 3,18 22,5 9,58 31 11,43
6 2,12 14,5 3,3 23 9,64 31,5 11,65
6,5 2,18 15 3,44 23,5 9,7 32 11,8
7 2,24 15,5 3,62 24 9,76 32,5 11,9
7,5 2,3 16 4 24,5 9,83 33 12
8 2,36 16,5 5,14 25 9,88 33,5

Tais valores foram plotados em um gráfico para que fosse possível se obter a curva
de titulação apresentada pelo aminoácido.

Gráfico 1- Curva de titulação da glicina a partir dos dados obtidos. Fonte: autoria própria

Ao observar o gráfico gerado e os valores de pK1, pK2 e pI apresentados pela

literatura, é possível concluir que os resultados em geral foram satisfatórios. As pequenas
diferenças, gerando curvas mais espaçadas, podem ter ocorrido em decorrência de algum
erro durante a adição de NaOH. Porém, ainda assim, é possível observar as duas fases de
tamponamento bem definidas.

8
4.2. Titulação de histidina
Diferentemente da glicina, a histidina é um aminoácido monocarboxílico e diamínico,
ou seja, além dos grupamentos alfa carboxílico e alfa amínico, a histidina apresenta uma
cadeia lateral composta por um grupo imidazol, que lhe confere a característica de um
aminoácido positivamente carregado. Sua titulação teve como objetivo comparar as
diferenças nas curvas de pH apresentadas por aminoácidos sem cadeia lateral ionizável e com
diferentes cargas, a fim de entender a possibilidade de identificar aminoácidos através de seus
pKas, ou seja, a medida da tendência de um grupo funcional doar um próton.
De início, a histidina em solução aquosa apresentou um pH de 4,08, e em comparação
com o pH inicial da glicina, a histidina apresenta um pH mais baixo, fator que será explicado
adiante. Ainda assim, para que fosse possível observar sua curva de titulação, inicialmente
aplicou-se HCl para que o pH ficasse próximo do valor de 1,6, como explicado no item 3.2,
de modo que todas as moléculas de histidina estivessem em seu estado total de protonação.
Este processo foi realizado para que fosse possível observar todos os pontos importantes da
titulação, como será também explicado a seguir.
Na tabela 2, estão apresentados os dados da titulação, com o respectivo pH da solução
de acordo com o volume adicionado de NaOH. Além disso, mostra-se também um gráfico
construído a partir dos valores obtidos na titulação.

Tabela 2. Dados obtidos da titulação da histidina com NaOH, a cada 0,5 mL de base adicionados.

NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH

(mL) pH (mL) pH (mL) pH (mL) pH (mL) pH
0 1,61 8,5 2,4 17 6,15 25,5 8,62 34 10,17
0,5 1,64 9 2,47 17,5 6,22 26 8,73 34,5 10,36
1 1,67 9,5 2,56 18 6,3 26,5 8,84 35 10,63
1,5 1,71 10 2,66 18,5 6,38 27 8,92 35,5 11,04
2 1,74 10,5 2,82 19 6,46 27,5 9,02 36 11,42
2,5 1,78 11 3 19,5 6,54 28 9,1 36,5 11,65
3 1,82 11,5 3,3 20 6,62 28,5 9,18 37 11,79
3,5 1,85 12 3,92 20,5 6,71 29 9,24 37,5 11,9
4 1,9 12,5 4,9 21 6,82 29,5 9,32 38 12
4,5 1,95 13 5,23 21,5 6,94 30 9,39 38,5
5 2 13,5 5,42 22 7,1 30,5 9,46 39
5,5 2,04 14 5,58 22,5 7,26 31 9,54 39,5
6 2,07 14,5 5,7 23 7,48 31,5 9,62 40

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 6,5 2,14 15 5,82 23,5 7,82 32 9,71 40,5
7 2,2 15,5 5,9 24 8,12 32,5 9,8 41
7,5 2,26 16 5,99 24,5 8,34 33 9,9 41,5
8 2,32 16,5 6,06 25 8,5 33,5 10,04 42

Gráfico 2. Curva de titulação da histidina a partir dos dados obtidos. Fonte: autoria própria.

Por apresentar cargas provindas dos grupos monocarboxílico e diamínicos, a titulação

da histidina com uma base forte apresenta três pontos principais, caracterizados pelo pK1, que
representa a desprotonação do grupo carboxílico de 50% das moléculas presentes no meio; o
pKr, que representa a desprotonação da cadeia lateral de 50% das moléculas presentes no
meio, neste caso, o grupamento imidazol; e o pK2, que representa a desprotonação do
grupamento amino em 50% das moléculas presentes no meio. Estes pontos aparecem
gradativamente, conforme adiciona-se o NaOH, já que este processo aumenta o pH do meio, e
cada um desses grupos deve perder o próton de acordo com as características químicas do
meio.
De acordo com a literatura, o grupo carboxílico é o primeiro a se desprotonar, o que
acontece por volta do pH de 1,82 (pK1), uma vez que as interações intramoleculares pela
presença dos grupos diamínicos facilitam a saída do próton da carboxila . Já a cadeia lateral se
desprotona em seguida, a um pH em torno de 6 (pKr), pois o oxigênio eletronegativo da
carboxila “puxa” os elétrons para longe deste grupamento. Por fim, com a elevação contínua
do pH e a maior presença de OH- no meio, o grupo amino perde seu próton em um pH em
torno de de 9,17 (pK2).
10
 Com isso, é possível entender os pontos mencionados anteriormente sobre o pH inicial
da histidina, e o motivo de ter-se adicionado HCl para abaixar mais o pH antes da titulação.
Por possuir uma cadeia lateral ionizável, cujo pKr equivale a 6, quando em pH neutro da água
(0,1M), o grupo imidazol já está com uma alta porcentagem de desprotonação, e apenas 10%
das moléculas de histidina estarão com o grupo R protonado. Portanto, a molécula é capaz de
capturar os prótons livres em solução, o que faz com que o pH do meio fiquei mais baixo, por
exemplo, que o pH inicial da glicina, que não apresenta cadeia lateral ionizável. Apesar dessa
diminuição, tal valor inicial ainda era mais alto que o pK1, e caso a titulação iniciasse sem a
protonação total com HCl, não seria possível observar este ponto de pK1, e o aprendizado
sobre a prática seria incompleto.
A figura abaixo apresenta a estrutura molecular da histidina ao longo do processo de
desprotonação de seus grupos funcionais, explicado acima.

Figura 3. Desprotonação da histidina ao longo da curva de titulação. Fonte: Lehninger.

Outro tópico importante a ser mencionado é o ponto de inflexão conhecido como

ponto isoelétrico, que no caso da histidina, acontece em um pH de 7,59. Neste ponto,
encontra-se um equilíbrio de cargas, de modo que o meio está eletricamente neutro, uma vez
que as formas protonadas e desprotonadas do aminoácido estão em perfeita compensação de
cargas. Por ser um aminoácido monocarboxilício e diamínico, a forma eletricamente neutra da
histidina ocorre em um valor de pH equidistante dos valores de pKa dos dois grupamentos
básicos do aminoácido, ou seja, é uma média aritmética entre o pKr (grupo imidazol) e o pK2
(grupo amino), que resulta em 7,59.
Além disso, no gráfico 2 é possível observar três regiões destacadas que se estendem
em 1 unidade acima e abaixo do valor pK1, pKr e do pK2, que são as regiões tamponantes
deste aminoácido. Nestas regiões as formas doadoras e aceptoras de prótons estão em
concentrações quase iguais, o que gera um equilíbrio e faz com que a alteração de pH do meio

11
seja mínima, mesmo com a adição de H+ ou OH-, devido a pequenas mudanças na razão das
concentrações dos ácidos fracos e suas bases conjugadas.
Dadas essas informações, é possível então comparar os resultados obtidos na tabela 2
e plotados no gráfico 2 com os dados encontrados na literatura sobre a curva de titulação da
histidina. Os valores obtidos estão coerentes com os dados informados na literatura, quanto
aos valores de pK1, pKr, pK2 e pI.

4.3. Glutamato
O glutamato é um aminoácido cujo radical R é identificado como
dicarboxílico-monoamino, atribuído devido à presença de um grupo carboxila em sua
estrutura lateral (figura 4). Sua característica de possuir um segundo grupo carboxila em
sua estrutura resulta em uma carga final negativa, corroborada pela desprotonação
observada em um ambiente com pH 7,0 (NELSON & COX, 2014).

Figura 4. Estrutura química do Glutamato. Fonte: NELSON & COX, 2014.

O glutamato exibe uma curva de titulação mais complexa devido à presença de um

grupo R ionizável em sua estrutura, em comparação com a curva de titulação da glicina.
Esta curva de titulação possui três estágios distintos, correspondentes às três possíveis
etapas de ionização (Figura 5). Dada essa complexidade, o glutamato apresenta três valores
de pKa.
Em condições de pH extremamente baixo, o aminoácido se encontra
completamente protonado, resultando em uma carga líquida de +1. No primeiro estágio da
titulação, quando o pH da solução atinge o valor de pK1, medido em 2,19, ocorre a

12
desprotonação do grupo carboxila ligado ao carbono alfa, levando a uma carga líquida
igual a zero. Com o aumento do pH, atinge-se o valor de pKr, correspondente a 4,25,
momento em que o grupo carboxila da cadeia lateral também sofre desprotonação,
resultando em uma carga líquida negativa, ou -1. Finalmente, ao continuar a titulação e
alcançar um pK2 de 9,67, o grupo amino sofre desprotonação, levando a uma carga líquida
de -2.

Figura 5. Desprotonação a cada pKa, carga final líquida e curva de titulação do glutamato. Fonte: NELSON &
COX, 2014.

Caso o glutamato fosse utilizado no experimento, quando o pH da reação estivesse

igual a 1,5, o aminoácido estaria totalmente protonado. Conforme a adição de NaOH, a
solução ficaria cada vez mais básica e passaria pelo pK1, pKr e pK2, desprotonando
totalmente o aminoácido e lhe conferindo a carga líquida final de -2.
O pI do glutamato é igual a 3,22, conforme indicado na figura 5. Comparando o pI
do glutamato com o pI da glicina e histidina, ambos utilizados no experimento, nota-se que
o pI do glutamato é menor. Isso ocorre porque para se realizar o cálculo do pI é necessário
13
utilizar o pKa mais próximos da carga líquida igual a zero, e, no caso do glutamato, é o
pK1, que é igual a 2,19. No caso da histidina, o pK2, que é igual a 9,17, está mais próximo
do pKr, e ao realizar o cálculo do pI, chega-se ao valor de 6,0. Como a glicina possui
apenas um hidrogênio em sua cadeia lateral, não possui um pKr. Sendo assim, o pI é
calculado com a média do pK1 e pK2, conferindo um valor de 5,97 ao pI.

5. CONCLUSÃO
Com os extensos estudos sobre proteínas realizados ao longo dos anos, sabe-se que
as curvas de titulação dos aminoácidos já são bem definidas, com informações sobre seu
pK1, pKr, pK2 e pI. Assim, em experimentos realizados como os desta aula prática, é
possível comparar os resultados obtidos, a fim de entender as propriedades específicas de
cada aminoácido, que dependem de suas estruturas, especialmente de suas cadeias laterais.
Desta forma, é possível identificar os aminoácidos a partir de dados obtidos por meio de
titulações, além de entender algumas de suas propriedades físico-químicas. O exemplo
disto está na diferença entre as curvas obtidas, especialmente do aminoácido glicina e
histidina, uma vez que a glicina não apresenta cadeia lateral ionizável, enquanto a histidina
é um aminoácido carregado positivamente, o que fica evidente em suas curvas.
Portanto, é possível confirmar que o objetivo da aula prática foi atingido, uma vez
que diversos conceitos básicos sobre proteínas e seu pKa foram relembrados e aplicados.
Os dados apresentados nas tabelas e gráficos correspondem com o esperado, e pequenas
variações podem ter sido apresentadas devido a manipulação imprecisa no momento da
titulação, que, entretanto, não alteraram o resultado final esperado.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DEVLIN, T.M. Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas, 2a ed.. Editora Blücher, 2006

FRANCISCO JUNIOR, W. E. & FRANCISCO, W. Proteínas: Hidrólise, precipitação e um tema para

o ensino de Química. Química Nova na Escola, v. 12, 2006.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2014.

PEREIRA, Airton Vicente et al. Determinação da constante de dissociação (Ka) do captopril e da

nimesulida: experimentos de química analítica para o curso de farmácia. Química Nova, [S.L.], v.
34, n. 9, p. 1656-1660, set. 2011.

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