Universidade Estadual de Feira de Santana

Departamento de ciências biológicas

Disciplina – Bio 465 Bioquímica B (Prática2)
Professor – Dr. Luiz Carlos Alcântara
Aluno – Raimundo Mário Silva Rodrigues dos Santos

Relatório sobrecaracterização de aminoácidos e proteínas

Racional teórico

Proteínas são formadas por subunidades monoméricas chamadas aminoácidos

unidos covalentemente em sequencias. Todos os organismos vivos possuem os mesmos
tipos de aminoácidos. Os aminoácidos possuem características, exclusivas, mas o
padrão básico de sua estrutura é um átomo de carbono central ligado a um grupo
carboxílico, uma cadeia lateral R que varia em estrutura tornando a carga elétrica e
influenciando na sua solubilidade em água de acordo com o pH, um grupo amina e um
átomo de hidrogênio. Os aminoácidos em soluções aquosas estão ionizados e podem
agir como ácidos ou bases a depender se eles doam ou recebem um próton de
hidrogênio (H+). Quando um aminoácido é dissolvido em água ele pode existir na
solução como um íon dipolar chamado Zwitterion que é um tipo de α-aminoácido que
tem um único grupo amino e um único grupo carboxila que se cristaliza em soluções
aquosas neutras podendo doar ou receber prótons, sendo esses aminoácidos chamados
anfóteros. Todo aminoácido pode se tornar um Zwitterion quando o pH de sua carga
líquida se iguala à zero(0). Existem duas subdivisões de aminoácidos: polares e não
polares. Os não polares podem ser alifáticos e aromáticose os polares neutros, positivos
e negativos. Na classe dos aminoácidos polares e alifáticos, os seus grupos R são
hidrocarbonetos e os aminoácidos são hidrofóbicos e não polares. As volumosas cadeias
de alanina, valina, leucina e isoleucina são importantes na formação de interações
hidrofóbicas no interior das estruturas protéicas. A glicina é o aminoácido de estrutura
mais simples e está presente em uma proteína. A sua restrição estérica é mínima,
permitindo uma flexibilidade estrutural muito maior do que a dos outros aminoácidos.
No caso da prolina, que é o único aminoácido que não possui carbono α,que é o centro
quiral dos aminoácidos e que confere propriedades opticas à eles. Seu grupo amino
secundário(imino) é mantido em uma conformação rígida que reduz a flexibilidade
estrutural neste ponto da cadeia protéica.
A fenilalanina, a tirosina e o triptofano, com suas cadeias laterais aromáticas são
hidrofóbicas (não-polares). O grupo hidroxila da tirosina pode formar pontes de
hidrogênio e isso atua como um grupo funcional importante na atividade de algumas
enzimas. A tirosina e o triptofano são mais polares que a fenilalanina devido ao grupo
hidroxila da tirosina e o nitrogênio do anel indol do triptofano. Esses três aminoácidos
(a fenilalanina em maior extensão) absorvem luz na região ultravioleta do espectro.
Os aminoácidos com grupo R carregados e não polares são solúveis (devido aos
seus grupos R) em água por serem polares. São eles a glutamina, asparagina, serina,
treonina, cisteína e metionina. A polaridade da serina e da treosina é devida aos seus
respectivos grupos hidroxila; a das cisteína e da metionina aos seus respectivos átomos
de enxofre e a da asparagina e da glutamina aos seus grupos amida. Asparagina e
glutamina são amidas de dois outros aminoácidos também encontrados em proteínas,
aspartato e glutamato, respectivamente, e em virtude disso, a asparagina e a glutamina
são facilmente hidrolisadas por ácidos ou bases. A cisteína tem um grupo R(um grupo
tiol) que é aproximadamente tão acido quanto o grupo hidroxila da tirosina. A cisteína é
facilmente oxidada para formar um aminoácido unido covalentemente por ponte de
dissulfeto. Esse tipo de ponte ocorre em muitas proteínas e são estabilizadoras de suas
estruturas.
Os aminoácidos com o grupo R carregados negativamente são o aspartato e o
glutamato. Sua cadeia lateral possui carga líquida negativa com o pH 7,0. São
compostos originários da asparagina e da glutamina, respectivamente. Cada um deles
possui um segundo grupo carboxila em suas moléculas.
Os aminoácidos que possuem o grupo lateral R carregados positivamente e com
o pH 7,0 são a lisina, que tem um segundo grupo amônia(NH3) na sua cadeia alifática, a
arginina que tem um grupo guanidina carregado positivamente e a histidina que contém
um grupo imidazol, este último o único aminoácido que possui uma cadeia lateral com
pKa próximo à neutralidade.
Outros tipos de aminoácidos são modificados no interior das proteínas. Outros
existem nos organismos fora das proteínas. Aminoácidos, assim como outras moléculas
podem existir em duas formas chamadas respectivamente de D(de “dextrogiro”, ou
direita) e L(“levogiro, ou esquerda) que formam imagens especulares como um espelho
chamadas estereoisômeros ou enantiômeros. À luz polarizada os estereoisômeros giram
em rotações diferentes. Todos os aminoácidos das proteínas são do tipo L.
As proteínas formadas pelos aminoácidos se subdividem conforme a sua
estrutura em primárias, secundárias e terciárias. As proteínas primárias são todas que
incluem ligações covalentes. As secundárias são as α-hélices e as β-pregueadas as
proteínas que possuem conformação tridimensional, o que lhes conferem capacidades
variadas. Em humanos pode haver dezenas de milhares de tipos de proteínas que são um
dos grupos de macromoléculas responsáveis pela preservação da identidade de cada
organismo. O conjunto de proteínas que compõem os organismos são constantemente
sintetizados e desmontados por reações químicas contínuas, envolvendo um fluxo
constante de massa e energia.

Objetivos gerais
 Identificar qualitativamente os aminoácidos e proteínas em soluções líquidas por
meio de reações clássicas. Também conhecer o potencial elétrico das proteínas e
analisar a influencia do pH sobre essas cargas e a relação da distribuição dessas cargas
com a solubilidades das proteínas e como substancias variadas interferem nessa
solubilidade além de entender como funcionam as interações proteína-proteína e
proteínas com outras substancias a partir da maneira como elas se precipitam ou não em
um recipiente aquoso.

Objetivos específicos

Reconhecer a presença de aminoácidos como glicina, arginina e tirosina, dentre

outras em soluções protéicas através dos testes de reações de Sakaguchi, Xantoproteica,
com reagente de Ninidrina e o de reação com Biureto, bem como identificar pelos
métodos de “salting-in” e “salting-out” como determinados sais neutros interferem na
solubilidade da proteína albumina quando em meio aquoso e sob condições variadas.

Metodologia

A turma foi dividida em quatro grupos sendo que cada grupo utilizou um
reagente de coloração diferente para identificar variados tipos de aminoácidos. Os
métodos empregados foram o Teste com Biureto utilizado para detectar a presença de
peptídeos com mais de três resíduos de aminoácidos, Teste com Reagente de Ninidrina
(realizado pela equipe ao qual eu fiz parte) para reconhecimento de aminas primárias na
solução, Teste de Reação de Sakaguchi utilizado para detectar a presença do
aminoácido arginina e Reação Xantoproteica. Também foram realizados testes de
reações de precipitação proteínas sem que elas estejam desnaturadas utilizando sulfato
de amônio [(NH4.)2SO4] para precipitação da proteína (salting-in) e NaCl e água
destilada para a dissolução do precipitado(salting-out).

Resultados

Uma das equipes encarregadas de realizar o teste de reação com Biureto colocou
0,5 mL de solução de albumina e acrescentou mais 0,5 mL do reagente de Biureto. A
mistura adquiriu uma tonalidade violeta devido a presença de grupos amino livres.

A segunda equipe rotulou dois tubos de ensaios sendo que no tubo 1

adicionaram 1 mL de solução do aminoácido tirosina e no tubo 2 1 mL de
aminoácido glicina. Em ambos os tubos foram adicionados 0,5 mL de ácido nítrico
concentrado e em seguida fervidos em banho Maria por 2 minutos até a mistura de
ambos os tubos adquirirem uma coloração amarelada. Em seguida foi acrescentado
em outro tubo 0,5 mL da solução de albumina mais 0,5 mL de ácido nítrico Houve
formação de um precipitado branco devido à ação do HNO3 e após agitado a solução
adquiriu uma tonalidade amarelo escuro.

A equipe ao qual fiz parte colocou em um tubo de ensaio 2,0 mL da solução de

ovo albumina. Em seguida acrescentamos 3 a 5 gotas do reagente de Ninidrina e
deixamos ferver por 2 minutos. Após isso houve a formação de um complexo azul
violeta. Repetimos a mesma operação em um segundo tubo contendo uma solução de
ácido glutâmico e o resultado foi o mesmo.

A ultima equipe realizou a reação de Sakaguchi, experimento realizado para

detectar a presença do aminoácido arginina em substâncias. Primeiramente
colocaram em um tubo de ensaio 0,5mL da solução protéica de ovoalbumina e em
seguida foi acrescentado duas gotas de solução alcoólica de α-naftol, duas gotas de
hipoclorito de sódio e 2 gotas de solução de hidróxido de sódio a 10%. Adquirindo a
coloração avermelhada, o que indicou a presença da arginina na proteína. O mesmo
experimento foi realizado utilizando dessa vez ao invés de albumina uma solução de
arginina pura. O tubo adquiriu a cor avermelhada confirmando assim o resultado do
primeiro experimento.

Em seguida todas as equipes realizaram os testes de reação de precipitação de

proteínas sem estarem desnaturadas “salting-in” e “salting-out”. Primeiramente foi
colocado em um tubo de ensaio 3,0 mL de solução de ovoalbumina e em seguida
acrescentou-se a esse tubo 2,0 mL de solução de sulfato de amônia. O conteúdo foi
misturado e constatou-se que houve formação de um precipitado esbranquiçado de
natureza protéica. O conteúdo foi dividido em três tubos diferentes. Em seguida foi
acrescentada uma solução de cloreto de sódio gota a gota em um dos tubos até que
todo o precipitado foi dissolvido. Constatou-se que a solução no tubo contendo a
solução de ovoalbumina com NaCl se solubilizou mais do que a solução albumina e
sulfato de amônio.

Discussão

Os experimentos demonstraram que aminoácidos variados podem ser

identificados nas soluções através dos diferentes métodos empregados assim como
seus grupos de amina primárias livres (no caso do teste com Ninidrina) de acordo
com a coloração que cada solução apresentou e também que a capacidade de
solubilidade das proteínas varia de acordo com a sua carga e como elas interagem
quando suas moléculas estão em contato com outras substancias como os sais
neutros. No caso do teste de precipitação, o sulfato de amônia não possui força
suficiente para dissociar as interações proteína-proteína e por isso elas permaneceram
unidas formando um agregado esbranquiçado de natureza protéica. Já quando a
 proteína interage com o NaCl ocorre o contrário. Há um aumento da força iônica
quando as moléculas do cloreto de sódio se dissociam em um ânion (Cl-) e um cátion
(Na+) que irão interagir com as pontes de hidrogênios presentes nas proteínas
rompendo as ligações proteína-proteína e impedindo que essas moléculas interajam
entre si fazendo com que elas se separem e conseqüentemente aumentando as
interações proteína-água ocorrendo assim um aumento da solubilidade das proteínas
no meio aquoso. No teste com Biureto, proteínas e peptídeos reagiram com o
Biureto formando um complexo violeta que indica a presença de polipeptídios com
mais de três resíduos de aminoácidos devido ao fato de que nessa reação, o NaOH
conduz a cadeia polipeptídica do aminoácido causando um desarranjo em suas
estrutura. Os íons Cu2+ presente na solução originados do sulfato de cobre interage
com os átomos de nitrogênio da cadeia peptídica formando um complexo. No caso
da Reação de Sakaguchi foi possível identificar a presença do aminoácido Arginina
em soluções protéicas devido ao fato de que o grupamento guanidina presente nesse
aminoácido reagir em meio alcalino com o α-naftol e o hipoclorito de sódio e na
reação Xantoproteica o benzeno reagiu com o ácido nítrico formando o nitrobenzeno.
Essa reação foi acelerada com o aquecimento e assim os aminoácidos que
apresentam anel benzênico na sua cadeia lateral reagiram com o ácido nítrico
originando o composto de cor amarelada podendo ser identificados por meio desse
experimento. No teste de ração com Nihinidrina, a solução contendo a ovoalbumina
com a nihinidrina ao ser aquecida teve as interações tridimensionais da proteína
desestabelecidas fazendo com que seus grupamentos amina (que são positivo)
reagissem com a Ninidrina formando um complexo violeta.

Referencias

LEHNINGER, David. & COX, Michael M. Princípios de bioquímica de

lehninger. Traduzido por Ana Beatriz Gorini da Veiga (et al.) 6ª ed. Porto Alegre: Artmed,
2014.
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