UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ

Curso: Biotecnologia – 4o período Professora: Maria Luiza F. Rodrigues Disciplina : Microbiologia Industrial

AULA PRÁTICA 03, 04, 05 E 06: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA E INDICADORES

Amostragem :Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado. TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS): Inocule uma série de três tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de água. Incube a 37ºC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o número de testes positivos. TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: Transfira 1,0 mL de todos os tubos do teste presuntivo que deram resultado positivo para tubos contendo 9 ml do meio E.C (Escherichia coli). Incube os tubos na estufa a 44,5 oC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran indica teste positivo. Anote os números de tubos positivos. DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME: Inocule através da alça de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as placas invertidas de 24-48 horas á 37 0C. Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico. Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa. Colete uma colônia da placa e faça uma coloração de Gram.

1

........ SSA: este meio é seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella de alimentos ou outras fontes........................5g Fosfato de potássio dibásico......1000ml PH final = 6..... Os microrganismos gram positivos e os coliformes são inibidos pela ação dos sais biliares........... Aspecto das colônias: Qualquer organismo capaz de fermentar a lactose com a produção de ácidos............................ 2 .........COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ANÁLISE DE ÁGUAS Meio Caldo Lauryl Triptose Triptose...................................................................... devido à viragem do indicador em pH baixo.. McConkey agar: este meio é seletivo para bactérias gram negativas e serve para o isolamento de coliformes.............. com o centro amarreonzado.......................1g Água destilada........................5g Sacarose ......................20g Lactose.........5g Cloreto de sódio.....4g Fosfato de potássio monobásico...75g Cloreto de sódio.....0...5g Fosfato de potássio dibásico........... Salmonella e Shigella de alimentos e outras fontes...........1000ml PH final = 6...8 Meio EC Triptose...................................10g Lactose.....0......................2........ com brilho metálico e geralmente com centro mais escuro..1......2.....9 EMB Agar peptona....75g Fosfato de potássio monobásico.. Enterobacter sp e Proteus sp: apresentam colônias de cor rosa...................2g Eosina ......5g Fosfato de potássio dibásico.......5g Azul de metileno...1000ml PH final = 6..5g Água destilada.........................065g Agar ............ creme ou branca......................20g Lactose........ Aspecto das colônias: Salmonella e Shigella: organismos não fermentadores da lactose presentam colônias incolores e transparentes...............13.........2g Água destilada.8 EMB agar: este meio é utilizado para a diferenciação de E...... forma colônias vermelhas em meio agar McConkey (agar vermelho neutro-sais biliares)..5g Sais biliares. Enterobacter aerogenes: colônias com aspecto mucóide.............. coli e Enterobacter aerogenes........ Patógenos que não fermentam a lactose: colônias transparentes............5g Lauryl sulfato de sódio..... Aspecto das colônias: Escherichia coli: colônias esverdeadas..... Escherichia coli: apresentam colônias de cor vermelha.......

de cor Colônias verde metálico brilhante redondas de cor rósea avermelhada fermentam a lactose Enterobacter aerogenes Colônias cor rosa escuro grandes.Resultados Após o crescimento das colônias nos meios seletivos descritos acima (48 horas). de cremoso de cor rósea avermelhada fermentam a lactose Salmonella sp Colônias pequenas e Colônias transparentes Colônias transparentes ou que podem apresentar amareladas preta pois não núcleo central de cor fermentam a lactose transparentes Klebsiella sp Colônias grandes. Colônias de aspecto Colônias de cor rosapois nucleadas e espalhadas.Introdução 3 . Colônias com núcleo central escuro espalhadas. Colônias com transparentes leitosas e Colônias podem ter pequenas. gomosas. SSA e MacConkey Microrganismo Escherichia coli Meio EMB Meio SSA Meio MacConkey pequenas Colônias de cor rosapois Colônias pequenas. Resultados obtidos após 48 horas de crescimento em meio seletivo Meios seletivos EMB SSA McConkey Aspecto das colônias Observações Características dos microrganismos nos meios EMB. cresciemnto espalhado Proteus morgani Colônias pequenas transparentes transparentes mais escuro COLORAÇÃO DE GRAM 1 . roxo azuladas. Colônias de de cor rosapois cor avermelhada fermentam a lactose rósea a alaranjado Serratia marcerans Colônia gomosas. Colônias transparentes ou ou amareladas pois não fermentam a lactose espalhadas Colônias transparentes ou que amareladas o pois não núcleo fermentam a lactose planas. que se espalham na placa gomosas. faça a coloração de gram com as culturas para notar as formas celulares e anote na tabela abaixo as suas observações.

com um corante primário. A retenção ou não do corante primário é. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. insolúvel. o que facilita a comparação de espécimes clínicos. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. A etapa da descoloração é crítica. seguido de tratamento com um fixador. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas. a amostra é tratada 4 . A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido.1838). o cristal violeta.A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 . em 1884. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. o lugol. em seus citoplasmas. densidade.Descrição da técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina. o etanol-acetona (1:1 v:v). Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. com os reagentes cristal violeta. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano. podendo produzir resultados falsos. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Por outro lado. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação. sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. tornando-as impermeáveis ao complexo. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. portanto. descorando as células. etanol-acetona e fucsina básica. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. fixado pelo calor. Em seguida. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. lugol. porosidade e integridade. 2 .

5 . Células de bactérias Gram-positivas.2 .Preparo do esfregaço Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0. fixá-lo com calor. sobre uma lâmina de microscópio. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. espalhando a gota. a fucsina básica. Portanto. Ao microscópio. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. O corante cristal violeta pode ser substituído. o uso de material fresco é importante. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. A técnica da coloração de Gram não é infalível e podese fazer o teste do hidróxido de potássio (KOH). Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa. 3 . com os mesmos resultados. com auxílio de um conta-gotas. Em uma lâmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%.Procedimentos 3. Remover o fixador da lâmina com água destilada. Com o auxílio de uma alça de semeadura coletase uma colônia isolada da bactéria e mistura-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos.3 .com um corante secundário.85%. células velhas. 3. Se a bactéria for Grampositiva não haverá a formação de fios. 3.Aplicação do corante primário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta. em seguida. Deixar o material secar e. deixar em repouso por um minuto. Por outro lado. Remover o corante da lâmina com água destilada. deixar em repouso por um minuto. com auxílio de um contagotas. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos.1 . que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos. flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.Aplicação do fixador Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol.

Aplicação do corante secundário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica (safranina).Microscopia Examinar a amostra ao microscópio óptico. e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.Descoloração Com a lâmina inclinada.4 .5 .3. despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. deixar em repouso por um minuto.6 . Este procedimento deve ser realizado até o momento que não desprenda mais a cor violeta do esfregaço. 6 . Enxaguar a lâmina com água. 3. 3. com auxílio de um contagotas.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful