Universidade Federal do Rio

Grande Escola de Química e

Alimentos
Laboratório de Engenharia de
Bioprocessos Disciplina Bioquímica
Industrial II

Questionário
Coloração de Gram Questões

Nome: Nathália Machado do Amaral (131942)

1. Explique por que a composição da parede celular das bactérias permite a diferenciação entre
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

A parede da célula Gram-negativa é constituída por estruturas de múltiplas camadas bastante complexas, que não
retêm o corante quando submetidas a solventes nos quais o corante é solúvel, sendo descoloradas e, quando
acrescentado outro corante, adquirem a nova coloração. Já a parede da célula Gram-positiva consiste de única
camada que retém o corante aplicado, não adquirindo a coloração do segundo corante. Nas bactérias Gram-
negativas, a parede celular está composta por uma camada de peptidioglicano, e uma membrana externa contendo
90% de lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo. Como componente da parede celular das células
Gram-positivas está o peptidioglicano, cuja contagem é 40% da massa das células, ligado de modo covalente ao
ácido lipoteicoico. Este é composto por polímeros de fosfoglicerol com glicolipídeo no final, sendo potente
modificador da resposta biológica. O glicolipídeo e o ácido lipoteicóico se ligam às membranas celulares,
particularmente de linfócitos e macrófagos, resultando em ativação celular. São capazes, também, de ativar a
cascata do complemento, induzindo a inflamação pulpar e periapical. Já que as células bacterianas Gram-
positivas, possui uma parede celular que consiste várias camadas de peptidioglicano (cerca de 90% da parede) e
não possuem a membrana externa das células Gram-negativas (Poucas camadas de peptidioglicano cerca de
10%). Portanto, pode-se observar a coloração das bactérias Gram-positivas são aquele cujas parede celulares não
perdem a cor azul quando submetidas a um processo de descoloração depois de terem sido coloridos pela violeta
de genciana, as que assumem a cor vermelha quando submetidas ao mesmo processo são Gram-negativas. A
coloração das bactérias Gram-positivas devido ao fato da sua parede celular que apresenta a maior
impermeabilidade, sendo mais espessa quando comparada a parde celular das bactérias Gram-negativas, assim
contendo o corante e permanecendo na cor violenta. Sendo assim, as bactérias Gram-negativas por possuirem
uma parede celular mais finas do que as paredes celulares de bactérias Gram-positivas, que não retem o cristal
violenta (pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas) durante o processo de descoloração,
recebem a cor vermelho no processo de coloração final.

2. Após aplicar-se a técnica de coloração de Gram, qual a coloração apresentada pelas bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas? Explique a função do corante violeta, do lugol, da solução
álcool-acetona e da fucsina na técnica empregada.

As bactérias Gram-positivas apresentam a coloração violeta e as bactérias Gram-negativas apresentam a

coloração vermelha. O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em
meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o
lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o
fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em
seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente
dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo
é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias
gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o
corante primário é retido e as células permanecem coradas. As células bacterianas possuem cargas negativas e o
corante de violeta possui cargas positivas, sendo assim o corante é atraído pela célula e a mesma o absorve.
Todas as estruturas celulares são coradas pelo corante cristal violeta. Todas as células absorvem o corante, desta
maneira o que houver de amostra microorganismo a ser analisado, irá ficar violenta, que a função do corante, de
aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. O lugol é uma solução que contém iodeto, o composto é
absorvido e se liga no corante Com a adição do mordente (Lugol), ocorre a formação do complexo iodo-
pararosanilina, que fixa o corante primário nas estruturas coradas. O álcool-acetona extrai os lipídeos,
aumentando a porosidade/permeabilidade da parede celular das bactérias Gram-negativas. O complexo cristal
violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias
gram-positivas, em virtude de sua composição, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a
porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído. O lugol é uma solução
que contém iodeto, assim este composto é absorvido e se liga no corante violeta formando o complexo CV-I que
é mais estável, e as células continuam na coloração violeta. A amostra é tratada com um corante secundário, a
fucsina básica. Ao microscópio, as células gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as gram-
negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias gram-positivas, células velhas, mortas ou com
envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra
bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como gram-negativas. Há a adição da solução de álcool-
acetona, onde ocorre a diferenciação das células bacterianas, sendo assim as Gram-positivas permanecem violeta,
devido a sua camada espessa de peptidoglicano, onde a solução não consegue fazer nenhuma alteração nessa
parede celular. A bactéria permanece impermeável a este solvente, sendo que o peptideoglicano não é
desestabilizado pela presença do álcool-cetona, pelo contrário, a tendência é a remoção da água e a diminuição
dos poros na célula bacteriana, evitando que o corante saia. Tratando, os dois grupos , com contra-corantes
(safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram positivos) não são afetadas e
permanecem azuis ou violetas; enquanto que para o outro (Gram negativos), as células absorvem o contra-
corante, tornado-as vermelhas. As Gram-negativas por terem uma parede rica em lipossacarídeo são solúveis em
álcool-acetona, portanto parte da parede celular é removida, assim a parede fica porosa e o corante pode sair. Na
última etapa do método, adiciona-se a fucsina na intenção de colorir as células Gram-negativas de vermelho, pois
estas células bacterianas estão permeáveis devido a remoção de suas paredes da etapa anterior, assim a mesma
absorve o corante. As Gram-positivas permanecem violeta por sua parede não se alterar, sendo impossível o
corante conseguir entrar na célula. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do
tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

3. Cite 5 exemplos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e sua importância.

As bactérias Gram-positivas possui na importância nos estudos no ramo da medicina e até mesmo no ramo
industrial, e como exemplos desse tipo de célula bacteriana: Streptomyces, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Lactobacillus, Propionibacterium acnes.

Streptomyces: é considerado de grande importancia industriais devido á sua capacidade de produzir muitos
metabólicos secudários, respondendo por 80% dos antibióticos utilizados atualmente. São responsáveis pela
produção do antibiótico chamado de estreptomicina e ácido clavulânico. Também produzem antifúngicos, como a
anfotericina, antiparasitários como ivermectina e antineoplásicos como bleomicina e antivirais como boromicina.

Enterococcus faecalis: são bactérias Gram-positivas, podem ser móveis, facultativamente anaeróbicas, com
temperatura de crescimento entre 10°C a 45°C e pH alcalino em torno de 9,6. E. faecalis constituem 85 a 90%
das espécies de Enterococcus identificados nos humanos. Esta bactéria é um microrganismo comensal que habita
a cavidade oral e o trato gastrointestinal em humanos, mas podem agir como patógenos oportunistas causando
infecções severas do trato urinário, bacteremia e endocardite bacteriana.

Staphylococcus aureus: é uma bactéria do grupo dos cocos gram-positivos que faz parte da microbiota humana,
mas que pode provocar doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e furúnculos, até as mais
graves, como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico e septicemia, entre outras.
Lactobacillus: é um grande gênero de bactérias com uma série de aplicações interessantes. As bactérias deste
gênero são geralmente benignas, e algumas são realmente benéficas, levando as pessoas a utilizá-las em
preparações probióticas, projetadas para promover a saúde. Alguns usos convencionais comuns de
bactérias Lactobacillus incluem restauração da flora intestinal após infecções graves e no tratamento de vaginose
bacteriana.

Propionibacterium acnes: é uma espécie de bactéria Gram-positiva, anaeróbia, que consome as secreções
produzidas pelas glândulas sebáceas e, quando entra em contato com os póros cutâneos, leva à inflamação dos
folículos pilosos, resultando em lesões popularmente chamadas de espinhas ou acnes. O uso indiscriminado de
antibióticos para o tratamento da acne vulgar pode causar o desenvolvimento de resistência bacteriana. Este
artigo tem a intenção de fornecer ao dermatologista os dados mais atuais desde sua classificação até os
mecanismos fisiopatogênicos envolvidos na resistência bacteriana do P. acnes e suas possíveis implicações
clínicas. É utilizada como modificadora de resposta biológica sob a forma de imunoestimulante que age no
sistema imunologico, favorecendo ativação de mecanismos de defesa inespecíficos, celulares e humorais.

As bactérias Gram-negativas possui a importância nos estudos de doenças, por se tratarem de bactérias
patogênicas, as quais promovem infecções, devido o seu comportamento característico de conseguirem resistir
mais a ação dos antibióticos; que vai definir a eficácia dos agentes físicos e químicos utilizados para eliminar,
controlar ou aumentar o crescimento das bactérias conforme a necessidade e e como exemplos desse tipo de
célula bacteriana: Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus, Bacteroides
thetaiotaomicron.

Escherichia coli: Pertencente à família Enterobacteriaceae é uma bactéria bacilar Gram-negativa, anaeróbica
facultativa, não esporulada, temperatura ótima de crescimento a 37°C, variando entre 18°C a 44°C que se encontra
normalmente no trato gastrointestinal de animais e humanos. A maioria das estirpes de E. coli são comensais, mas
algumas podem causar graves infecções alimentares nos seres humanos, e são ocasionalmente responsáveis pela
recolha de produtos alimentícios devido à sua contaminação. A presença da E.coli em análises microbiológicas de
produtos alimentícios sugere um indicador de contaminação fecal, devido a sua presença no trato intestinal e nas
fezes. Em humanos a sua transmissão é através da ingestão de alimentos contaminados, como por exemplo, carnes
cruas ou má cocção, leite e vegetais crus.

Salmonella enterica: O gênero Salmonella é pertencente à família Enterobacteriaceae, sendo uma bactéria Gram-
negativa, não esporulada, anaeróbica facultativa, maioria móveis e em forma de bacilos. A Salmonella é um gênero
heterogêneo, composto por 3 espécies, a Salmonella subterranea, Salmonella bongori e Salmonella enterica. Dentre
as de maior importância para a saúde humana, destacam-se a Salmonella Typhi (Salmonella enterica sorovar
Typhi), que causa infeções sistêmicas e febre tifoide e a Salmonella Typhimurium (Salmonella entérica sorovar
Typhimurium), um dos agentes causadores das gastrenterites. A sua transmissão por alimentos ocorre
principalmente através da ingestão de produtos de origem animal contaminado, destacando ovos e carne de aves. O
tratamento térmico é imprescindível como método de prevenção para evitar o consumo de alimentos contaminados
por Salmonella.

Pseudomonas aeruginosa: é uma bactéria gram-negativa, baciliforme (característica morfotintorial) e aeróbia. Seu

ambiente de origem é o solo, mas sendo capaz de viver mesmo em ambientes hostis, sua ocorrência é comum em
outros ambientes. É um patogênico oportunista, ou seja, que raramente causa doenças em um sistema
imunológico saudável, que causa infecções no trato urinário e respiratório, dermatites, bacteremias e infecções
sistêmicas, particularmente em pacientes imunocomprometidos. P. aeruginosa usualmente possui fatores de
virulência associados, tais como habilidade de produzir citotoxinas, hemolisinas e proteases, e assim apresentam
habilidade invasiva e mas explora eventuais fraquezas do organismo para estabelecer um quadro de infecção. Essa
característica, associada à sua resistência natural a um grande número de antibióticos e antissépticos a torna uma
importante causa de infecções hospitalares.

Haemophilus: é um gênero de bactérias cocobacilares, pleomórficas, Gram-negativas, aeróbio ou anaeróbicos

facultativos, imóveis, que pertencem à família Pasteurellaceae. O gênero inclui organismos que são flora normal de
humanos e algumas espécies patogênicas significativas, tais como H. influenzae que
causa septicemia e meningite bacteriana em crianças e o H. ducreyi que causa cancroide.[1] Podem possuir cápsula
de polissacarídeos e possuem tamanho de cerca de 1um (micrometro)

Bacteroides thetaiotaomicron: é uma espécie de bactéria do gênero Bacteroides . É um anaeróbio

obrigatório gram-negativo . É uma das bactérias mais comuns encontradas na microbiota intestinal humana e
também é um patógeno oportunista . Seu genoma contém numerosos genes especializados na digestão
de polissacarídeos . É frequentemente usado em pesquisas como um organismo modelo para estudos funcionais
da microbiota humana. É uma bactéria encontrada no lúmen do intestino grosso, sua importância é devido a sua
especialização na degradação de polissacarídeos complexos. Entretanto, a B. thetaiotaomicron produz muitas
enzimas que não são codificadas pelo genoma humano, e assim este microorganismo amplia drasticamente a
quantidade de polímeros vegetais que podem ser degradados no trato digestório humano.

4. Na pasteurização do leite, quais bactérias (Gram-positivas ou Gram-negativas) são mais

resistentes a este tratamento térmico? Explique.

Os que resistem à pasteurização do leite com alta taxa de sobrevivência pertencem aos gêneros

Bacillus, Paenibacillus, Micrococcus e Mycobacterium e, com baixa taxa de sobrevivência alguns Enterococcus
e Streptococcus , algumas vezes, a outros gêneros Gram positivos. Nas bactérias mais resistentes este tratamento
térmico são as Gram-positivas. O comportamento se difere nas células bacterianas devido a composição de suas
paredes celulares, onde as Gram positivas possui uma estrutura mais espessa, constituída de 90% de
peptideoglicano, e as Gram negativas uma camada mais fina, composta majoritariamente por lipossacarídeos. As
enterobactérias e as bactérias psicrotróficas Gram-negativas não deveriam ser encontrados no leite pasteurizado,
pois os dois grupos são muito termolábeis e portanto destruídas durante o tratamento térmico. Caso haja a
contaminação do leite após o processo de pasteurização, essas bactérias podem ser encontradas e por se tratar de
microrganismos psicrotróficos são os que têm maior possibilidade de se proliferar durante o armazenamento e
portanto causar alteração no produto. No tratamento térmico UHT (ultra high temperature - ultra alta
temperatura), o leite é aquecido a temperaturas entre 130 e 150 °C, por 2 a 4 segundos, resultando em um
produto com vida útil de quatro meses ou mais, conforme a qualidade da matéria-prima, embalagem e condições
de estocagem.

5. Como se explica a importância da coloração de Gram em segurança de alimentos?

A segurança dos alimentos trata da garantia de que os alimentos não causarão doenças ao consumidor, quando
preparados e ou consumidos de acordo com o uso a que se destinam. Para tal, preconiza-se um controle de
qualidade efetivo de toda a cadeia alimentar, desde a produção, armazenagem, distribuição até o consumo do
alimento in natura ao processo, bem como os processos de manipulação que se fizerem necessários. A segurança
do alimento do objetivo de exercer práticas de manipulação para garantir a qualidade do alimento, desde a
produção até o consumo. Desta maneira, para que o alimento tenha boa e otima qualidade e não pode haver
contaminantes químicos, biológicos e físicos. Refletindo assim, os males das condições de higiene-sanitária,
aliada à falta de treinamento dos vendedores e até mesmos dos consumidores, que podem representar risco a
saúde, devido a fácil contaminação por micro-organismos. Pois, a coloração de Gram auxilia na detecção de
contaminantes biológicos (microorganismos), a fim de que logo após possa ser feito a averiguação da
necessidade ou não, de eliminar ou reduzir as bactérias a quantidades aceitáveis.