COLORAO DE GRAM

Texto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao

RESUMO
A coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de
microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A
partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e
consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas,
respectivamente.
A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a
etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua
fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta
adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa
diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de
Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao
considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de
Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas.
Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos
aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a
laminas padrao.
INTRODUO
Em geral, sao necessarias coloracoes biologicas para a visualizacao de
bacterias de modo adequado e demonstracao dos detalhes finos das suas
estruturas.
O advento da coloracao representa, em grande parte, o fundamento dos
principais avancos produzidos em microbiologia clnica e em outros campos da
microscopia diagnostica durante os ltimos 100 anos.

A maioria das coloracoes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o

diagnostico presuntivo rapido do processo infeccioso e tambem a previa avaliacao
da qualidade da amostra.
A coloracao de Gram e o metodo bacterioscopico mais importante e mais
utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade e a classificacao de
microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e
arranjo celular.
As bacterias sao classificadas basicamente em dois grandes grupos: Grampositivas e Gram-negativas. No que diz respeito as caractersticas tintoriais, as
bacterias Gram-positivas coram-se de roxo e as bacterias Gram-negativas coram-se
de rosa.
A deteccao de microrganismos na amostra e de suma importancia, uma vez
que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de
patogenos e, tambem, a necessidade da realizacao de cultura com finalidade
diagnostica e/ou epidemiologica.
A tecnica de coloracao de Gram geralmente respeita um protocolo de acoes
que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos
tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas
etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse
sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e
lavagens a partir de protocolos especficos refletem em alguma alteracao na
interpretacao dos resultados da coloracao de Gram.
FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloracao de Gram e as
variacoes na sua execucao. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.

Texto 2. Tcnica de Coloracao de GRAM

INTRODUO
O metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de
Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico
presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca
importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente
Transmissveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de
resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em
carater de pronto atendimento em nvel local.
Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos
diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica
requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com
disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um
bico de Busen, eventualmente substitudo por uma lamparina ou espiriteira.
Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a
coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou
por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto.
Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio
treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho.
A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor,
o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que
as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.
Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram
chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gramnegativas.
Apos descricao do metodo, inmeras propostas de modificacao foram feitas.
Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a

correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de

Doencas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministerio da Sade.

Como funciona a coloracao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com
pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao.
Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como:
1.

existencia

de

um

substrato

Gram-positivo

especfico;

2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam

diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e
3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos
Gram-positivos e Gram-negativos.
Este ltimo e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de celular,
quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, diametro do poro,
parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela
violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado
de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a
propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas
perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como
alcool etlico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a
cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.
As

bacterias

que

tem

parede

celular

composta

por

murena

(peptdeoglicano - peptdeo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de

descoloracao com alcool etlico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular
composta

predominantemente

por

acidos

graxos

(lipopolissacardeos

lipoprotenas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante

de fundo.

Brasilia: Ministerio da Sade, Tecnica de Coloracao de Gram. Programa

Nacional de Doencas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Serie
TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissveis e
AIDS,

(Brasil).

II.

Serie

TELELAB.

Disponvel

em:

http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out

2014.

TEXTO 3. Coloracao de Gram (Tortora)

A coloracao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarques

Hans Christian Gram. Ela e um dos procedimentos de coloracao mais teis, pois
classifica as bacterias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.
Neste procedimento (Figura 3.12a),
1. Um esfregaco fixado pelo calor e recoberto com um corante basico prpura,
geralmente o cristal violeta. Uma vez que a co- loracao prpura impregna
todas as celulas, ela e denominada coloracao primria.
2. Apos um curto perodo de tempo, o corante prpura e lavado, e o esfregaco e
recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo e lavado, ambas as
bacterias gram-positivas e gram-nega- tivas aparecem em cor violeta escuro
ou prpura.
3. A seguir, a lamina e lavada com alcool ou uma solucao de alcool-acetona.
Essa solucao e um agente descolorante, que remove o prpura das celulas
de algumas especies, mas nao de outras.
4. O alcool e lavado, e a lamina e entao corada com safranina, um corante
basico vermelho. O esfregaco e lavado novamente, seco com papel e
examinado microscopicamente.
O corante prpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bacteria,
corando-a de violeta escuro ou prpura. As bacte- rias que retem essa cor apos a
tentativa de descolori-las com alcool sao classificadas como gram-positivas; as
bacterias que perdem a cor violeta escuro ou prpura apos a descoloracao sao
classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bacterias gram-

-negativas sao incolores apos a lavagem com alcool, elas nao sao mais visveis.
por isso que o corante basico safranina e aplica- do; ele cora a bacterias gramnegativas de rosa.
Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a
coloracao primaria, sao denominados contracorantes. Como as bacterias grampositivas retem a cor prpura original, nao sao afetadas pelo contracorante
safranina.
Como voce vera no Captulo 4, os diferentes tipos de bacterias reagem de
modo distinto a coloracao de Gram, pois diferencas es- truturais em suas paredes
celulares afetam a retencao ou a liberacao de uma combinacao de cristal violeta e
iodo, denominada comple- xo cristal violeta-iodo (CV-I).
Entre outras diferencas, as bacterias gram-positivas possuem uma parede
celular de peptideoglicano mais espessa (dissacardeos e aminoacidos) que as
bacterias gram- -negativas. Alem disso, as bacterias gram-negativas contem uma
camada de lipopolissacardeo (lipdeos e polissacardeos) como parte de sua parede
celular (veja a Figura 4.13, pagina 86).
Quando aplicados a celulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal violeta e o iodo penetram facilmente nas celulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e
o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo e maior que a molecula de
cristal violeta que penetrou na celula e, devido a seu tamanho, nao pode ser
removido da camada intacta de peptideoglicano das celulas gram-positivas pelo
alcool. Consequentemente, as celulas gram-positivas retem a cor do co- rante cristal
violeta.
Nas celulas gram-negativas, contudo, a lava- gem com alcool rompe a
camada externa de lipopolissacardeo, e o complexo CV-I e removido atraves da
camada delgada de peptide- oglicano. Como resultado, as celulas gram-negativas
permanecem incolores ate serem contracoradas com a safranina, quando adquirem a cor rosa.
Em resumo, as celulas gram-positivas retem o corante e per- manecem com a
cor prpura. As celulas gram-negativas nao retem o corante; elas ficam incolores ate

serem contracoradas com um corante vermelho.

O metodo de Gram e uma das mais importantes tecnicas de coloracao na
microbiologia medica. Porem, os resultados da co- loracao de Gram nao sao
universalmente aplicaveis, pois algumas celulas bacterianas coram-se fracamente
ou nao adquirem cor. A reacao de Gram e mais consistente quando utilizada em
bacterias jovens, em crescimento.

Figura1.ProcedimentoparaarealizaodacoloraodeGram.

Figura2.MicrografiadebactriascoradaspeloGram.Osbastoneteseoscocos(roxo)
sogrampositivos,eosvibries(rosa)sogramnegativos.
Microbiologia[recursoeletrnico]/GerardJ.Tortora,

BerdellR.Funke,ChristineL.Case;traduo:AristboloMendesdaSilva...[etal.];reviso
tcnica:FlvioGuimaresdaFonseca.10.ed.Dadoseletrnicos.PortoAlegre:
Artmed,2012.