Aula 2 – Coloração de

GRAM, nutrientes e
fatores que influenciam
o crescimento
bacteriano.

Disciplina: Microbiologia Básica

Professor: Dr. Lucas Santos

 Histórico da coloração de
GRAM
• Em 1884 o bacteriologista Hans Christian Gram desenvolveu a coloração de Gram.
• A Coloração classifica as bactérias em dois grandes grupos:

• Gram-positivas: Coloração roxa.

Gram-negativas: Coloração rosa.
 Relembrando...
• As bactérias reagem de modo diferente a coloração de Gram, devido as diferenças
estruturais presentes em suas paredes celulares que afetam a retenção ou
liberação do complexo violeta-iodo.
 Coloração de GRAM
A partir de características bioquímicas das bactérias as mesmas
podem ser classificadas como gram positivas ou gram negativas,
corando-se de roxo ou rosa respectivamente.
Qual a importância da
coloração gram?
É uma importante ferramenta laboratorial dentro da
Microbiologia, auxiliando o laboratório no diagnóstico.
Qual a importância da
coloração gram?
Classificar os microrganismos com base em suas
características tintoriais, forma, tamanho e arranjos
celulares.
 Qual a importância da
coloração gram?
Indicar uma terapia antimicrobiana direcionada;
Indica a necessidade da escolha certa do meio de cultura para
obtenção correta do crescimento bacteriano.
 Preparação de amostras
para coloração
• A primeira etapa é a transferência das bactérias da cultura, para a lâmina.
 Preparação de amostras
para coloração
• É necessário fazer o ESFREGAÇO
 Preparação de amostras
para coloração
• É necessário fazer o ESFREGAÇO
 Preparação de amostras
para a coloração
Técnica de coloração

Antes de corados, os microrganismos (M.O.) precisam ser

FIXADOS à lâmina.

É usualmente a primeira etapa em um processo multipassos

de preparação de uma amostra de material biológico para a
microscopia ou outras análises.

Fixação: MATA e ADERE os M.O.

 Preparação de amostras
para coloração
1- Fixação: MATA e ADERE os M.O.

Tipos de fixadores:

• Solução aquosa de Formol a 4%

• Álcool a 70%
• Formol Glicerinado a 4%
• Chama do bico de bunsen
 Preparação de amostras
para coloração
• É necessário fazer o ESFREGAÇO
Etapas da coloração de
GRAM

Violeta de
genciana
 Etapas da coloração de
GRAM
1- A primeira etapa é a aplicação do cristal violeta.
O cristal violeta tem como finalidade
corar a parede celular bacteriana na
cor roxa.

As bactérias coradas em roxo ao

final da técnica, são as GRAM
POSITIVAS.

Violeta de
genciana
 Etapas da coloração de
GRAM
2- A segunda etapa é a aplicação mordente Iodo/Lugol.
O iodo/lugol, se liga ao cristal violeta
dentro da bactéria formando o
complexo cristal violeta-Iodo (CV-I).

Violeta de
genciana
 Etapas da coloração de
GRAM
3- A terceira etapa é a aplicação do álcool para descoloração.
A finalidade do álcool é a
descoloração do complexo CV-I.

A parede celular gram negativa não

consegue reter o complexo CV-I
dentro da bactéria.

Nessa etapa, as bactérias gram

negativas perdem a coloração roxa.
Violeta de
genciana
 Etapas da coloração de
GRAM
4- A quarta etapa é a aplicação do corante fucsina/safranina.
A bactéria gram positiva, não
descolore na etapa do álcool, logo ela
não absorve o corante fucsina, se
mantendo roxa.

A bactéria gram negativa, descolore

na etapa do álcool, e absorve o
corante fucsina, obtendo a coloração
vermelha.
Violeta de
genciana
Etapas da coloração de
GRAM

Roxas

Violeta de
genciana
Etapas da coloração de
GRAM

Violeta de
genciana
 Por que as gram -,
descolorem?
GRAM (+)

Parede espessa de
peptideoglicano retém o
complexo violeta/Iodo.

GRAM (-)

Parede fina de
peptideoglicano nãoderetém
Violeta
o complexo violeta/Iodo.
genciana
Reagentes usados na
coloração de GRAM

Violeta de
genciana
 Exemplos de gram positivas
• Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Staphylococcus,
Streptococcus

Violeta de
genciana
 Exemplos de gram negativas
• Escherichia, Helicobcater, Enterobacter, Pseudomonas, Salmonella

Violeta de
genciana
 Fatores que influenciam no
crescimento bacteriano

Violeta de
genciana
 Fatores necessários para o
crescimento bacteriano
• Fatores químicos:

Macronutrientes;
Micronutrientes;
Água.
 Fatores necessários para o
crescimento bacteriano
• Fatores físicos:

Temperatura;
pH;
Pressão osmótica;
Oxigênio.
Fatores químicos que influenciam
no crescimento bacteriano.

Violeta de
genciana
 Nutrientes utilizados pelos
microrganismos
• Células procarióticas: Fornecimento de
nutrientes

90% de água;
8% de macromoléculas;
Outros componentes.

Síntese de
macromoléculas
 Nutrientes
• São as substâncias encontradas no ambiente que
participam da nutrição celular.
• Dois grandes grupos:

-MACRONUTRIENTES: necessários em
maiores quantidades, tem papel
importante na estrutura e metabolismo;

-MICRONUTRIENTES: necessários em
pequenas quantidades, tem funções
enzimáticas e estruturas nas biomoléculas.
 Macronutrientes

• Carbono:

• Base de todas as moléculas orgânicas;

• Esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes: lipídeos,
carboidratos e proteínas;
• Fornecem energia para o crescimento microbiano;
• Exemplos: celulose, amido, sacarose, lactose, glicose.
 Macronutrientes

• Nitrogênio:

• Segundo elemento mais abundante nas células;

• Compõe proteínas, ácidos nucléicos e peptideoglicano;
• Fontes de peptonas: carne, gelatina, queratina, farinha de
soja, sementes de algodão.
 Macronutrientes
• Fósforo: encontrado em compostos orgânicos (ácidos nucleicos)
ou inorgânicos (fosfatos)

• Magnésio: membranas e ácidos nucleicos, funcionamento de

enzimas

• Cálcio: estabilização da parede celular e termo resistência nos

esporos

• Ferro: presente em muitas proteínas, principalmente nas

envolvidas na respiração
 Micronutrientes
• Embora necessários em pequenas quantidades, têm papel tão
importante quanto os macronutrientes

• Cobalto: formação da vitamina B12

• Zinco: papel estrutural em várias enzimas e proteínas
• Cobre: enzimas respiratórias
• Manganês: ativador de enzimas
 Outras exigências
• Água:

• Essencial para os micro-organismos: absorção dos nutrientes

dissolvidos;
• Disponibilidade variável no ambiente;
• Regulação térmica.
Fatores físicos que influenciam no
crescimento bacteriano.

Violeta de
genciana
Fatores físicos que influenciam
no crescimento bacteriano:
Temperatura
 Temperatura
Temperatura Ótima de Crescimento;
A temperatura na qual uma espécie de microrganismo cresce mais
rapidamente.
Temperatura
 Psicrófilos
• Capazes de crescer a 0°C ou ainda menos.
• Temperatura ótima: cerca de 15 °C
• Encontrados nas profundezas dos oceanos ou em regiões polares

Lactobacillus
Aeromonas
 Psicrotróficos
• Microrganismos psicrotróficos são aqueles que têm capacidade de se
desenvolver entre 0°C e 7°C.

• Ex: Enterobacter cloacae, Yersinia enterocolitica e Hafnia alvei,

Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophyla.

Enterobacter cloacae Aeromonas hydrophyla

 Psicrófilos e psicrotróficos
• Os microrganismos psicrófilos e psicrotróficos multiplicam-se bem em
ambientes refrigerados, sendo os principais agentes de deterioração de
carnes, pescado, ovos, frangos e outros.
 Mesófilos
• Temperatura ótima: 25 a 40 °C
• Organismos dentro de corpos de animais
• Maioria das bactérias patogênicas: 37 °C

Grupos dos Lactobacillus,

Estreptococos
 Termófilos
• Altas temperaturas;
• Temperaturas ótimas: 50 a 60 °C;
• Germinação e crescimento de
endósporos.
• Ex.: Geobacillus stearothermophilus

Hipertermófilas: acima de 60°C

Aquifex, Thermocrinis e
Thermotoga
Geobacillus stearothermophilus
 Fatores físicos que
influenciam no crescimento
bacteriano:
pH e salinidade
 Potencial hidrogeniônico:
pH
• Acidez, neutralidade e alcalinidade
 Potencial hidrogeniônico:
pH Lactobacillus acidophilus: utilizado para
• Maioria cresce entre 6,5 e 7,5; reposição de microbiota intestinal.

• Poucas são acidófilas (abaixo de 4);

• Alcalinidade inibe o crescimento
(preservar alimentos).
 Salinidade: Halofilia
• Dizem-se halófilos (do grego halo -
sal + filo - amigo):

Organismos extremófilos que

podem desenvolver-se em
ambiente com altas
concentrações de sal.
 Salinidade: Halofilia
• Microrganismo Halófilo: é
dependente de altas
concentrações de sal para o
crescimento. São os organismos
encontrados nos mares (6 a 15%
de Cloreto de Sódio).

• Microrganismo Halófilo Extremo:

é aquele dependente
exclusivamente de
concentrações muito altas de sal
para exercer o seu crescimento
(Concentração de 15 a 30% de
Cloreto de Sódio). Ex: Halobacterium, Halococcus
 Salinidade: Halofilia
• Microrganismo Halotolerante:
é aquele que tolera certa dose
de salinidade (Concentração
de 1 a 6% de Cloreto de Sódio).

• Microrganismo Não Halófilo:

são aqueles em que a
salinidade é tóxica e ocasiona a
lise celular.
Salinidade: Halofilia
Fatores que influenciam
no crescimento
bacteriano:
Oxigênio
 Oxigênio
Oxigênio atmosférico

Funciona nos processos de respiração

aeróbica.

Podem ser:
Aeróbios: exigem oxigênio livre
Anaeróbios: não toleram a presença de
O2 livre
Facultativos: crescem na presença ou
ausência de O2
Oxigênio
 Aeróbios obrigatórios
São aqueles micro-organismos que só
crescem na presença de oxigênio.

Esses micro-organismos são capazes de

crescer em uma atmosfera padrão de
21% de oxigênio.

Pseudomonas aeruginosa
 Anaeróbios obrigatórios
Crescem na ausência de oxigênio.

São aqueles micro-organismos que

podem ser mortos pelo oxigênio, e que
não utilizam ele para suas reações de
produção de energia.

Clostridium tetani
 Aeróbios facultativos
São aqueles micro-organismos que
crescem na presença do oxigênio, mas
podem também crescer na sua
ausência.

Eles não requerem o oxigênio para o

crescimento, embora possam utilizá-los
para a produção de energia em suas
reações químicas.
Escherichia coli
OBRIGADO