Machine Translated by Google

Revista Microquímica 160 (2021) 105616

Listas de conteúdo disponíveis em ScienceDirect

Revista Microquímica

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/microc

Uma estratégia de eficiência para extração e recuperação de ácido elágico de resíduos

de casca de castanha e avaliação de sua atividade biológica

Juan-Yan An a,1, Li-Tao Wang a,1 , Mu Jie Nv , Jian-Dong Wang , Zi-Hui Cai , Yan-Qiu Wang , uma uma uma uma

Su Zhang , Qing Yang , Yu Jie Fu a,b,*

b uma

uma

The College of Forestry, Beijing Forestry University, 100083 Beijing, PR China

b
Centro Avançado de Inovação para Melhoramento de Árvores por Design Molecular, Beijing Forestry University, 100083 Beijing, PR China

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: As cascas de castanha em grande quantidade são resíduos agrícolas e florestais significativamente subaproveitados que podem ser
Resíduos de casca de castanha
explorados como recurso para a produção de compostos ativos naturais de alto valor. Neste estudo, uma abordagem eficiente e verde foi
Solvente eutético profundo
estabelecida para extrair e recuperar o composto fenólico altamente valorizado, ácido elágico, a partir de cascas de castanha com solventes
Desnaturação
eutéticos profundos à base de cloreto de colina (DESs). Utilizando condições otimizadas de extração assistida por ultra-som com cloreto de
Extração
colina/n-propanol DES, relação sólido-líquido de 40 mg/mL, tempo de extração de 70 min e poder de extração de 200 W, valor de extração
Ácido elágico
altamente eficiente para ácido elágico de 4,64 mg/ g foi obtido. Enquanto isso, o ácido elágico foi recuperado facilmente com uma
Avaliação da atividade biológica
porcentagem de recuperação de 94,9% pelo método de precipitação antisolvente através da desnaturação do DES com água. A pureza do
ácido elágico nos extratos atingiu 85,6%, o que é mais de duas vezes superior à dos métodos de extração com etanol (36,4%). Além disso,
o ácido elágico recuperado exibiu forte atividade antioxidante com IC50 (0,309 mg/mL) e atividade antibacteriana significativa com
concentração inibitória mínima (CIM) (250 mm) e diâmetro da zona de inibição (DIZ) (17,60 ÿg/mL). O método de precipitação anti-solvente
pode desnaturar o DES, levando a uma maior eficiência de extração e recuperação e ácido elágico de alta pureza simultaneamente em
uma única etapa. O novo método é de grande importância para todo o processo de produção de castanha para a utilização de cascas de
castanha. Além disso, este método também pode ser usado como um método alternativo verde e livre de poluição para a extração e
recuperação de componentes fenólicos de recursos naturais para aplicações farmacêuticas e bioquímicas.

1. Introdução a produção foi de aproximadamente 1.988.224 toneladas em 2018, representando mais

Os resíduos biológicos contêm grandes quantidades de ingredientes nutricionalmente
ativos. A reutilização de resíduos como materiais de valor agregado não apenas
economiza custos, mas também pode ser um benefício para o meio ambiente. Resíduos
de florestas e indústrias agrícolas são um recurso valioso que pode ser explorado como
fonte de medicamentos à base de plantas [1]. A crescente demanda por moléculas
bioativas tem incentivado pesquisas para encontrar novas fontes de moléculas naturais.
A castanha (Castanea mollissima) é uma noz crucial pertencente à família Fagaceae .
É nativa das regiões temperadas do hemisfério norte e atualmente está distribuída por
todo o mundo [2]. É uma espécie arbórea importante para a economia agrícola e florestal.
A produção de castanha da China e o volume de exportação sempre ocuparam o
primeiro lugar no mundo. De acordo com as últimas estatísticas da Organização das
Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), a castanha da China
de 80% da produção mundial. A grande produção de castanha tem efeitos econômicos
consideráveis, mas o grande número de castanhas e cascas de frutas produzidas pelo
processamento da castanha são muitas vezes considerados como resíduos agrícolas e
florestais e são queimados ou descartados, o que pode levar ao encorajamento da
superpopulação de larvas de insetos destruidores de culturas . 3]. A casca de castanha
é um subproduto barato e não desenvolvido que contém uma variedade de ingredientes
bioativos, incluindo pigmentos, flavonóides e fenóis. Os fenóis específicos, ácido gálico
e ácido elágico, são conhecidos por exibir propriedades antioxidantes e anticancerígenas
[4]. O ácido elágico é um derivado dimérico do ácido gálico [5] e possui certos efeitos
biológicos, como conter antiangiogênico [6], anticancerígeno [7], antidiabetes [8],
antioxidante [9-10], anti propriedades inflamatórias e anti-apoptóticas [11-12]. Um estudo
recente descobriu que o ácido elágico exibiu um potencial efeito protetor sobre

* Autor correspondente em: The College of Forestry, Beijing Forestry University, 100083 Beijing, PR China.
Endereço de e-mail: yujie_fu@163.com (Y.-J. Fu).
1
Os autores contribuíram igualmente para o trabalho.

https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.105616 Recebido em
21 de julho de 2020; Recebido em formulário revisado em 5 de outubro de 2020; Aceito em 6 de outubro de 2020
Disponível online em 9 de outubro de 2020
0026-265X/© 2020 Publicado por Elsevier BV
Machine Translated by Google

J.-Y. Um et ai. Revista Microquímica 160 (2021) 105616

várias doenças neurodegenerativas e é considerado um potencial composto líder com
efeitos farmacológicos multi-alvo [13]. No entanto, os métodos tradicionais de extração
de ácido elágico usam solventes orgânicos que requerem grandes quantidades de
etanol ou metanol, o que leva a uma baixa taxa de extração, alto consumo de energia e
riscos ambientais [14]. Portanto, é necessário desenvolver um método de extração
verde eficiente, ambientalmente amigável e sustentável de ácido elágico de cascas de
castanha abandonadas.
ácido (>98,0%) foi adquirido de Sichuan Weikeqi Biological Tech nology Co., Ltd.
(Chengdu, China). Folin-ciocalteu (FC), 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e ácido
ascórbico (Vc) foram todos obtidos da Sigma-Aldrich (EUA). A acetonitrila e o ácido
fórmico para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram de grau
cromatográfico (J&K Scientific Ltd., Pequim, China). A água desionizada foi purificada
pela Pall Filter (Beijing) Co., Ltd. Todos os outros reagentes químicos eram de grau
analítico e disponíveis comercialmente.

Nos últimos anos, solventes eutéticos profundos (DESs) surgiram como um novo
solvente verde ideal para substituir reagentes orgânicos e líquidos iônicos (LIs) [15]. O
DES é geralmente composto por um doador de ligação de hidrogênio (HBD) e um
aceptor de ligação de hidrogênio (HBA) [16]. Cloreto de colina (ChCl) é um dos
compostos HBA mais amplamente utilizados, e alguns exemplos de componentes HBD
comuns são açúcar, ácidos orgânicos, álcoois orgânicos e etc. [17]. Embora os DESs e
LIs tenham propriedades físicas semelhantes, quando comparados aos LIs, os DESs
são mais disponíveis, facilmente degradáveis, têm baixo custo e são baixos ou não
tóxicos [18]. Atualmente, os DESs têm sido amplamente utilizados em biocatálise,
eletroquímica, ciência de materiais, química de plantas e outros campos devido às suas
excelentes vantagens [19-21]. A utilização de DESs para extrair vários compostos
biologicamente ativos de diferentes materiais vegetais também é uma aplicação
comumente usada [22-25].
No entanto, devido à pressão de vapor insignificante de DESs e alta miscibilidade com
água, a recuperação do composto alvo do DES é bastante desafiadora [26]. Em termos
de seguir os princípios da química analítica verde, é particularmente importante adotar
um método razoável e eficaz para extração e recuperação de compostos [27-28].
Portanto, propomos a recuperação do ácido elágico, um composto alvo insolúvel em
água, pela desnaturação dos DESs por meio da adição de água.
Neste estudo, propomos um novo processo de extração e recuperação de ácido
elágico de cascas de castanhas residuais através de DES e desnaturação de DES com
água. Especificamente, 10 DESs à base de cloreto de colina foram projetados para
avaliar a eficiência de extração de ácido elágico de cascas de castanha. O método de
superfície de resposta foi utilizado para otimizar os parâmetros do processo de extração
do ácido elágico. Em seguida, o ácido elágico do DES foi recuperado através da
desnaturação do DES pela adição de água.
Finalmente, a atividade antioxidante do ácido elágico foi medida por DPPH, e seu efeito
inibitório em seis bactérias foi então avaliado. Este estudo fornece uma estratégia para
melhorar a taxa de extração de produtos naturais com DES e obter compostos alvo de
alta pureza pelo método de precipitação antissolvente para desnaturar o DES em uma
etapa. Pode ser utilizado como um método verde, eficiente e conveniente para
estabelecer um protocolo de obtenção de produtos naturais.
2.2. Processo de extração
2.2.1. Preparação de DESs
Cloreto de colina foi usado como HBA inicial para sintetizar DES com diferentes
HBDs (Tabela 1) em banho de óleo a 80 ÿC com agitação constante até a formação de
um líquido homogêneo. Os DESs sintetizados foram armazenados em frascos selados
à temperatura ambiente até o uso.
2.2.2. Extração de ácido elágico da casca de castanha Pó de
casca de castanha (40 mg) foi adicionado ao solvente de extração (1,0 mL) em um
tubo de microcentrífuga de 2,0 mL e extraído por um limpador ultrassônico (Kunshan
Ultrasonic Instrument, Jiangsu, China). O extrato foi então centrifugado por 15 min a
12.000 r/min. Em seguida, 100 ÿL de su pentant foi diluído cinco vezes com metanol até
500 ÿL e depois centrifugado novamente antes da análise de HPLC.
2.2.3. Otimização dos parâmetros de extração de DES O tempo
de extração (X1), poder de extração (X2) e razão sólido-líquido (X3) para ácido
elágico foram otimizados sistematicamente usando um design Box-Behnken de três
fatores (BBD) em três níveis. Os níveis reais e de codificação das variáveis
independentes utilizadas no delineamento experimental são apresentados nas Tabelas
2 e 3, respectivamente.
2.3. Recuperação de ácido elágico de solventes eutéticos desnaturados por
precipitação com água
O ácido elágico do DES foi separado através da desnaturação do DES com água
(método de precipitação anti-solvente). Resumidamente, a solução extraída foi
centrifugada (15 min, 12.000 rpm) e o sobrenadante foi colocado em um tubo de
centrífuga de 50 mL, onde um certo volume de água foi adicionado para precipitar o
ácido elágico (Fig. S2) [29]. A mistura foi deixada em banho de gelo a 0 ÿC por 6 h,
centrifugada (15 min, 12.000 rpm) e então seca para obtenção do ácido elágico bruto.

2. Materiais e métodos
2.4. Análise de HPLC

2.1. Materiais, produtos químicos e reagentes

A quantificação do ácido elágico da casca da castanha foi realizada usando um
sistema de HPLC de fase reversa Agilent 1260 com uma coluna Gemini-C18 (250 mm
As cascas de castanha (Castanea mollissima) foram adquiridas da região de
× 4,6 mm, 5 ÿm, Phenomenex, EUA). A fase móvel consistiu em solução aquosa de
Yimeng shan (Shandong, China). O material foi seco a peso constante à sombra,
ácido fórmico a 0,1% (A) e acetonitrila (B). A temperatura da coluna foi fixada em 30
pulverizado, peneirado (40 mesh) e armazenado em freezer a 4 ÿC até o momento de
ÿC, o volume de injeção foi de 20 ÿL e a vazão foi de 1 mL/min. O comprimento de onda
sua utilização. O cloreto de colina (>98,0%) foi adquirido da Aladdin Bio-Chem
de detecção foi de 254 nm. As condições de eluição de gradiente foram tão
Technology Co., Ltd. (Xangai, China). Elágico

Tabela
1 Diferentes sistemas de solventes eutéticos profundos preparados.

Abreviação HBA HBDs Razão molar Temperatura de aquecimento Aspecto em temperatura ambiente

DES1 Cloreto de colina Etilenoglicol 1:1 80 ÿC Líquido transparente

DES2 Cloreto de colina N-propanol 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES3 Cloreto de colina 1,2-Propanodiol 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES4 Cloreto de colina Glicerol 1:1 80 ÿC Líquido transparente
5 DE DEZEMBRO Cloreto de colina Butanol 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES6 Cloreto de colina 1,4-Butanodiol 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES7 Cloreto de colina Ácido acético 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES8 Cloreto de colina Ácido propiónico 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES9 Cloreto de colina ácido butírico 1:1 80 ÿC Líquido transparente
DES10 Cloreto de colina Ácido lático 1:1 80 ÿC Líquido transparente

2
Machine Translated by Google

J.-Y. Um et ai. Revista Microquímica 160 (2021) 105616

Tabela 2 método de difusão [31-32] conforme relatado anteriormente. O ácido elágico recuperado
Resultados do projeto Box-Behnken para os rendimentos de extração de ácido elágico. foi dissolvido em DMSO (2 mg/mL) e centrifugado (15 min, 12.000 rpm). S. aureus, B.
Fatores de execuções Rendimento de extração (mg/g DW) subtilis, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans e Enterococcus Faecium foram cultivados em
caldo nutriente durante a noite a 37 ÿC antes do uso. Adicionou-se água destilada para
X1(O , min) X2 (tb , W) X3 (Tc , mg/mL)
diluir a suspensão bacteriana para cerca de 1 × 10- foi espalhada uniformemente em uma
0(40) 0(200) 0(40) 3,80 6
placa de ágar adequada. A amostra filtrada
UFC (20
e 100 ÿLÿL)
de foi transferida
solução para um
bacteriana copo oxford e
diluída
12 ÿ 1(10) 1(300) 0(40) 3,49
3 4.18
foi colocada suavemente na superfície do ágar. Ampicilina foi usada como controle positivo
0(40) ÿ 0(200) ÿ 0(40)
4 1(10) ÿ 1(100) 0(40) 3,32 e DMSO foi usado como controle negativo. As placas inoculadas foram incubadas a 37 ÿC
5 1(10) 0(200) ÿ ÿ 1(10) 2,99 por 12 h. A atividade antibacteriana foi avaliada medindo a DIZ das bactérias testadas. Os
6 0(40) 1(100) ÿ 1(10) 2,86
valores de DIZ foram expressos em milímetros e valores <8,00 mm foram considerados
7 1(70) 0(200) 1(70) ÿ 3,51
como 'zona sem inibição (NIZ)'. Todos os testes foram realizados em triplicado.
8 1(70) 0(200) 1(10) ÿ 3,67
9 0(40) 1(300) ÿ 1(10) 2,45
10 1(70) 1(100) 0(40) 3,86
11 0(40) 0(200) ÿ 0(40) 3,98
12 0(40) ) 1( 100) 1( 70) 3.11
A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo método do caldo de
13 0(40) 0(200) 0(40) 4.12
microdiluição [32-33] com algumas modificações. Primeiro, 100 ÿL de caldo nutriente foi
14 0(40) ÿ 1(300) 1(70) 3,22
15 1(10) 0(200) 1(70) 3,60 adicionado a uma placa de 96 poços. Em seguida, 100 ÿL de ácido elágico (4 mg/mL)
16 1(70) 1(300) 0(40) 4,01 foram adicionados e duplamente diluídos em série. Finalmente, a solução bacteriana (10-
17 0(40) 0(200) 0(40) 4,36 6
UFC) foi adicionada a cada poço e agitada.
uma

Tempo de extração (min). Ampicilina foi utilizada como controle positivo com concentração inicial de 0,5 mg/mL e o
b
Poder de extração (W). controle negativo foi de 100 µL de caldo nutriente.
c
Relação sólido/líquido (mg/mL). A incubação foi realizada por 12 h a 37 ÿC e medida com um leitor de microplacas. Os
resultados foram expressos em porcentagem de inibição. A concentração mais baixa da
amostra foi definida como CIM e os valores são expressos em ÿg/mL.
Tabela
3 Estatísticas ANOVA do modelo quadrático para os rendimentos de extração de ácido elágico.

Variáveis ácido gálico 3 Resultados e discussão

Valor F valor p

Modelo 10,86 0,0024

3.1. Seleção de sistemas DES para extração de ácido elágico de resíduos de
uma

8.17 0,0244
casca de castanha
X1
b
X2 4.570E-004 0,9835
c
X3 6,56 0,0375
O DES é um sistema solvente multicomponente, que possui certo grau de
X1X2 4.911E-003 0,9461
ajustabilidade e seletividade para os produtos naturais na matriz vegetal extraída [24]. As
X1X3 3,61 0,0992
X2X3 1,56 0,2400 propriedades físicas e químicas dos DESs podem afetar significativamente a eficiência de
2
X1 0,35 0,5709 extração dos compostos alvo [34].
2
X2 23.31 0,0019 Polaridade e viscosidade são as propriedades mais significativas dos DESs e afetam
2
X3 50,56 0,0002
diretamente a capacidade de extrair compostos alvo devido às propriedades de contato
Falta de ajuste 0,92 0,5089
R2 0,9331
entre o solvente de extração e as biomoléculas [35].
Portanto, selecionar o tipo apropriado de DESs é muito importante para o processo de
uma

Tempo de extração (min).

b
extração de ingredientes biologicamente ativos. Neste estudo, para selecionar o DES mais
Poder de extração (W).
c adequado para extrair eficientemente o ácido elágico, 10 tipos de DESs foram sintetizados
Relação sólido/líquido (mg/mL).
(Tabela.1). Pode ser visto que os diferentes tipos de DESs têm efeitos diferentes sobre o
rendimento de extração de
segue: 0–10 min, 10–10% B; 10–15 min, 10–20% B; 15–30 min, 20–30% B. Todas as
amostras preparadas para HPLC foram filtradas através de filtros de membrana de 0,45
ÿm antes do uso.

2.5. Avaliação da atividade do ácido elágico recuperado

2.5.1. Atividade de eliminação do radical DPPH

Após a secagem do ácido elágico recuperado, a atividade antioxidante foi medida pela
atividade de eliminação do radical DPPH [30]. Resumidamente, oito amostras de
concentração foram feitas com 0,1 mL das soluções de amostra misturadas com 1 mL de
DPPH e, em seguida, 1,4 mL de etanol absoluto foi adicionado.
A solução mista foi mantida no escuro por 70 min à temperatura ambiente e então a
absorbância das amostras foi medida em 517 nm.
O ácido ascórbico foi usado como controle. A atividade antioxidante foi calculada a partir
da seguinte fórmula:

Atividade antioxidante (%) = [(AB ÿ AA)/ AB] × 100%

onde AB é o valor de absorbância de DPPH e AA é a absorbância

valor da amostra testada.

2.5.2. Teste de atividade antibacteriana Fig. 1. Comparação da eficiência de extração do ácido elágico com diferentes sistemas de
O diâmetro da zona de inibição (DIZ) foi determinado pelo ágar solventes eutéticos profundos.

3
Machine Translated by Google
J.-Y. Um et ai.
ácido elágico (Fig. 1). Entre esses 10 DESs, o efeito de extração do DES 2 (ChCl/n-
propanol) mostrou-se melhor que os outros 9 DESs. Isso pode ser devido à polaridade
mais fraca do ácido elágico. Comparado aos outros DESs, a polaridade do ChCl/n-
propanol é semelhante ao ácido elágico, o que pode ser benéfico para a extração do
ácido elágico [24]. Além disso, o DES 2 tem baixa viscosidade, pode dissolver melhor
a matriz da amostra da planta e levar a uma maior taxa de extração [26]. Portanto,
escolhemos DES 2 para experimentos subsequentes.
Estudos anteriores [36] mostraram que além da composição e razão molar do
DES, a alta viscosidade dificulta a transferência de massa da matriz vegetal para a
solução de extração. A presença de água pode reduzir a viscosidade do solvente,
ajustar a polaridade, aumentar a dissolução de ingredientes ativos e pode levar a um
efeito significativamente melhor no rendimento de extração dos compostos alvo [37].
Conforme mostrado na Fig. 2, quando o teor de água de DES 2 foi aumentado de
10% para 30% (relação em volume), o rendimento de extração de ácido elágico
aumentou, com o rendimento de extração de ácido elágico mais alto no aumento de
30%. Esta pode ser a viscosidade e polaridade mais adequadas do DES após a
adição de 30% de água [36].
Por outro lado, quando o teor de água diminuiu, o rendimento da extração diminuiu.
Assim, a adição de água pode reduzir significativamente a viscosidade e a tensão
superficial e aumentar a área de contato entre a amostra e o solvente, além de
acelerar a taxa de dissolução dos componentes alvo, melhorando significativamente
o rendimento da extração [36]. É importante notar que quando quantidades excessivas
de água foram adicionadas, o rendimento de extração de ácido elágico diminuiu.
Potencialmente, a adição excessiva de água rompe as ligações de hidrogênio entre
n propanol e cloreto de colina. Portanto, o teor de água ideal foi encontrado em 30%.
3.2. Otimização dos parâmetros operacionais para extração de ácido elágico
Para otimizar ainda mais o processo de extração do DES, as condições de
extração do ácido elágico foram otimizadas através da análise de variância BBD
(ANOVA). Como resultado deste experimento de fator único (Fig. S1), o tempo de
extração (10 a 70 min, X1), poder de extração (100 a 300 W, X2) e razão sólido-
líquido (10 a 70 mg/mL, X3) foram selecionadas como as três variáveis. Os resultados
dos dados experimentais são apresentados na Tabela 2. O modelo polinomial
quadrático foi ajustado com três variáveis para determinar o maior rendimento de
extração e realizado em ordem aleatória. Com base na análise de regressão múltipla
dos dados experimentais, a equação polinomial de segunda ordem do ácido elágico
foi obtida da seguinte forma:
Y = 0,49842 + 0,010644X1 + 0,017460X2 + 0,068465X3 ÿ
2,36833E ÿ 006X1X2 ÿ 2,14056E ÿ 004X1X3 + 4,33900E ÿ 005X2X3 +
2 2 2.
6.52758E ÿ 005X1 ÿ 4.77127E ÿ 005X2 ÿ 7.80752E ÿ 004X3
Fig. 2. Efeito do teor de água em DESs nos rendimentos de extração de ácido elágico.
4
Revista Microquímica 160 (2021) 105616
Conforme mostrado na Tabela 3, a análise de variância e regressão do modelo
polinomial quadrático de superfície de resposta está listada. A equação polinomial
quadrática foi estatisticamente significativa (p < 0,05) e o valor para a falta de ajuste
não foi significativo (p = 0,5089). Isso indica que o modelo pode se ajustar
adequadamente aos dados do experimento. Além disso, tanto o coeficiente linear
quanto o coeficiente quadrático são significativos (Tabela 3).
Portanto, o tempo de extração (X1), o poder de extração (X2) e a relação material-
líquido (X3) são fatores importantes na determinação do processo de extração do
ácido elágico [28].
A influência das interações entre as três variáveis no rendimento de extração do
ácido elágico foi demonstrada pelo diagrama de superfície de resposta tridimensional
(Fig. 3). A interação entre o poder de extração e o tempo de extração não é
significativa, conforme mostrado na Fig. 3A. A interação entre a razão sólido-líquido
e o tempo de extração é mostrada na Fig. 3B. O rendimento da extração muda com
o aumento do tempo de extração. A interação entre a razão sólido-líquido e o poder
de extração tem um efeito significativo no rendimento da extração, conforme mostrado
na Fig. 3C. Quando a relação sólido-líquido é de 40 mg/mL e a potência de extração
de 200 W, a eficiência de extração do ácido elágico é a mais alta. O efeito da razão
sólido-líquido na taxa de extração é provavelmente devido ao fato de que mais
quantidade de solvente não é econômico e menos solvente não é propício para a
transferência de massa do DES e do substrato da planta [35].
Um aumento da potência ultrassônica acelera a ruptura da parede celular e a
subsequente difusão do soluto [38]. Uma amplitude mais forte resulta no impacto na
interface entre a casca da castanha e o DES 2, melhorando assim a eficiência de
extração do ácido elágico [37]. Além disso, o aumento da potência pode fazer com
que a temperatura do meio (DES) aumente, o que reduz a viscosidade do solvente e
pode atingir facilmente a matriz da célula vegetal [36].
De acordo com a ANOVA, as condições ótimas de extração foram as seguintes:
tempo de extração de 70 min, potência de extração de 199,22 W e relação sólido-
líquido de 39,78 mg/mL. O rendimento máximo teórico de ácido elágico nestas
condições óptimas foi de 4,35 mg/g. Por conveniência, o tempo de extração foi
mantido em 70 min, a potência de extração foi modificada para 200 W e a relação
sólido-líquido foi modificada para 40 mg/mL. Esses valores foram selecionados como
os melhores parâmetros experimentais para a extração de ácido elágico de cascas
de castanha por ChCl/n propanol. Os rendimentos reais de extração de ácido elágico
foram de 4,64 mg/g.
Os resultados dos experimentos de verificação indicaram que o modelo estabelecido
era confiável e razoável.
3.3. Recuperação de ácido elágico de DESs desnaturados
A recuperação do composto do DES é difícil devido à sua baixa pressão de vapor
[24]. Estudos recentes mostraram que métodos de resina macroporosa, anti-solvente,
dióxido de carbono supercrítico e recristalização [26] têm sido usados para recuperar
compostos alvo de DESs. Neste estudo, o método de precipitação anti-solvente é
usado para desnaturar o DES para recuperar o composto alvo, o ácido elágico.
Estudos [29] mostraram que a água é um antissolvente eficaz quando se considera
que o ácido elágico é insolúvel em água devido à sua fraca polaridade. Quando uma
quantidade apropriada de água é adicionada ao DES, ele irá desnaturar e o ácido
elágico irá precipitar (Fig. S2). Isso pode ser devido ao fato de que a adição de água
quebra a ligação de hidrogênio do DES e desnatura o DES e reduz sua capacidade
de dissolver e interagir com o ácido elágico [29]. A água pode formar ligações de
hidrogênio com o doador de prótons e aceptor do soluto, limitando assim a formação
de ligações de hidrogênio das moléculas do soluto . Portanto, em comparação com a
formação de ligações de hidrogênio entre a água e esses solutos, as ligações de
hidrogênio intermoleculares e intramoleculares de solutos dissolvidos em água são
quase desfavoráveis [39]. A fim de determinar a quantidade ideal de água para
precipitar o ácido elágico, foi realizado um experimento de triagem e os resultados
são mostrados na Fig. 4.
Conforme mostrado, à medida que o volume da água desionizada adicional aumenta,
mais ácido elágico foi recuperado. Especificamente, quando a proporção de água
para solução de extrato foi de 30:1 (v/v), o teor de ácido elágico recuperado foi de
4,40 mg/g com uma taxa de recuperação de 94,90% e uma pureza de 85,6%.
Machine Translated by Google
J.-Y. Um et ai.
Fig. 3. Gráficos de superfície de resposta do modelo para rendimento de extração do ácido elágico. (A) Poder de extração e tempo de extração; (B) Relação sólido-líquido e tempo de
extração; (C) Relação sólido-líquido e poder de extração.
Fig. 4. Efeito do teor de água na desnaturação de DESs para a recuperação de ácido
elágico.
Esse resultado é mais de duas vezes maior do que quando obtido por extração com
etanol (35,6%). Assim, a desnaturação de DESs pela adição de água pode efetivamente
separar o ácido elágico.
3.4. Atividade de eliminação de radicais DPPH
Um antioxidante é uma substância que é definida como sendo capaz de combater
outros substratos oxidáveis e retardar ou prevenir sua oxidação .
A Fig. 5 mostra a curva dose-resposta para os extratos de ácido elágico recuperados e o
controle positivo, Vc. À medida que a concentração de ácido elágico aumentou, a atividade
antioxidante também aumentou gradualmente. O ácido elágico apresentou boa atividade
antioxidante, embora inferior à do Vc. O valor de IC50 para a eliminação do radical DPPH
de ácido elágico e Vc foram 0,309 mg/mL (p < 0,05) e 0,027 mg/mL (p < 0,05),
respectivamente. Estes resultados mostram que ChCl/n-propanol é um solvente eficaz
para extração e recuperação de ácido elágico e que o ácido elágico recuperado tem forte
atividade de eliminação de radicais livres.
3.5. Atividade antibacteriana
Houve uma variação significativa nas atividades antibacterianas (valores DIZ) do
ácido elágico, conforme mostrado na Tabela 4. O efeito inibitório do ácido elágico contra
C. albicans, S. aureus e E. faecium (cerca de 17,60,
5
Revista Microquímica 160 (2021) 105616
Fig. 5. Atividade de eliminação do radical DPPH do ácido elágico recuperado da casca da
castanha.
17,40 e 17,25 mm, respectivamente) foi claramente mais forte. Foi intrigante descobrir
que o ácido elágico recuperado inibiu especificamente duas bactérias gram-positivas de
crescimento, S. aureus e E. faecium, enquanto inversamente possuía uma inibição fraca
contra duas bactérias gram-negativas, E. coli e P. aeruginosa. Os valores de CIM do
ácido elágico recuperado contra S. aureus, B. subtilis e E. faecium foram 250 ÿg/mL, 500
ÿg/mL e 250 ÿg/mL, respectivamente. A faixa de MIC foi a mesma das três bactérias gram-
negativas. Os valores de CIM do ácido elágico recuperado contra P. aeruginosa, E. coli e
C. albicans foram 500 ÿg/mL, 250 ÿg/mL e 500 ÿg/mL, respectivamente. Em comparação
com o controle positivo, a CIM do ácido elágico recuperado foi maior que a do controle
positivo ampicilina. Nossos resultados foram consistentes com Carla et al.
(2015) [41]. Isso pode ser devido principalmente à diferença significativa na estrutura da
parede celular. As bactérias gram-positivas têm apenas uma camada de parede celular,
enquanto as bactérias gram-negativas têm uma estrutura de múltiplas camadas [42].
Assim, o ácido elágico recuperado possui bons efeitos antibacterianos e pode
potencialmente ser usado como conservante natural de alimentos para prevenir
intoxicações alimentares e aumentar a segurança alimentar.
4. Conclusões
Neste estudo, uma nova e eficiente estratégia para extrair e
Machine Translated by Google

J.-Y. Um et ai. Revista Microquímica 160 (2021) 105616

Tabela
4 O diâmetro da zona de inibição (DIZ), concentração inibitória mínima (MIC) do material selecionado contra bactérias.
Propriedades antibacterianas Material selecionado Bactérias Gram-positivas Bactérias Gram-negativas

S. aureus B. subtilis E. fezes P. aeruginosa E. coli C. albicans

DIZ (mm) Ácido elágico bruto 17h40 15,80 17,25 13,75 14,10 17,60
Ampicilina 15h00 17,40 35,25 16,50 17,75 31,25
DMSO SERIES SERIES SERIES SERIES SERIES SERIES

CIM(ÿg/mL) Ácido elágico bruto >250 >500 >250 >500 >250 >500
Caldo >62,50 >125 >3,90 >31,25 >31,25 >3,90
Nutritivo Ampicilina DENTRO DENTRO DENTRO DENTRO DENTRO DENTRO

“Sem Inibição” (NI).

DIZ menor que 8,00 mm foi definido como “Zona Sem Inibição” (NIZ).

explorou-se a recuperação do ácido elágico dos resíduos de cascas de castanha
por DES e a desnaturação de DESs. A amostra DES específica de cloreto de colina
e n-propanol (1/1, mol/mol) apresentou o maior rendimento de extração (4,64 mg/
g). A recuperação eficiente do ácido elágico foi realizada através da desnaturação
[6] L. Vanella, CD Giacomo, R. Acquaviva, I. Barbagallo, GL Volti, V. Cardile, N.
G. Abraham, V. Sorrenti, Efeitos do ácido elágico em fatores angiogênicos em células de câncer de
próstata, Cânceres. 5 (2013) 726-738, https://doi.org/10.3390/ cancers5020726.
[7] P. Gupta, T. Mohammad, P. Khan, MF Alajmi, A. Hussain, MT Rehman, M.

do DES pela adição de água, o que levou a uma taxa de recuperação de 94,90%.
Além disso, o ácido elágico recuperado apresentou boa atividade antioxidante e
efeitos antibacterianos. Portanto, a abordagem desenvolvida pode ser considerada
como um procedimento valioso para recuperar o valioso ácido elágico a partir de
cascas de castanhas naturais e de baixo custo, reduzindo assim o desperdício de
biomassa e a poluição ambiental na indústria de processamento de castanha.
5. Declaração do Autor
Juan-Yan An, Li-Tao Wang e Yu-Jie Fu desenharam o manuscrito.
Juan-Yan An, Li-Tao Wang, Mu-Jie Lv e Jian-Dong Wang realizaram experimentos.
Zi-Hui Cai, Yan-Qiu Wang, Su Zhang, Qing Yang analisaram os dados. Juan-Yan
An escreveu o artigo. Yu- Jie Fu, Li-Tao Wang revisou e editou o manuscrito Todos
os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
I. Hassan, Avaliação do ácido elágico como inibidor da esfingosina quinase 1: Uma abordagem
direcionada para a terapia anticâncer, Biomed. Farmacêutico. 118 (2019) 109245, https://doi.org/
10.1016/j.biopha.2019.109245.
[8] RP Nankar, M. Doble, combinação de drogas híbridas: tratamento antidiabético de ratos Wistar
diabéticos tipo 2 com combinação de ácido elágico e pioglitazona, Phytomedicine 37 (2017) 4–9,
https://doi.org/10.1016 /j.phymed.2017.10.014.
[9] Y. Liu, Yu Liu, Y. Liu, H. Liu, Y. Shang, Avaliação dos efeitos do ácido elágico na qualidade dos frutos
de kumquat durante o armazenamento, Sci. Hortico. 227 (2018) 244–254, https://doi.org/10.1016/
j.scienta.2017.08.055 .
[10] Y. Wang, Y. Zeng, W. Fu, P. Zhang, L. Li, C. Ye, L. Yu, X. Zhu, S. Zhao, Seed
crescimento mediado de nanobastões core-shell Au@Ag para a detecção de ácido elágico em
cosméticos clareadores, Anal. Chim. Acta 1002 (2018) 97–104, https://doi.org/10.1016/
j.scienta.2017.08.055 .
[11] F. Firdaus, MF Zafeer, E. Anis, M. Ahmad, M. Afzal, O ácido elágico atenua a neuroinflamação induzida
por arsênico e a apoptose associada à disfunção mitocondrial, Toxicol. Rep. 5 (2018) 411–417,
https://doi.org/10.1016/j.toxrep.2018.02.017.
[12] L. Verotta, L. Panzella, S. Antenucci, V. Calvenzani, F. Tomay, K. Petroni,
E. Caneva, A. Napolitano, Resíduos fermentados de romã como fonte sustentável de ácido elágico:
Propriedades antioxidantes, ação anti-inflamatória e liberação controlada em condições de digestão
simulada, Food Chem. 246 (2018) 129-136, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.10.131.

[13] S. Alfei, F. Turrini, S. Catena, P. Zunin, M. Grilli, AM Pittaluga, R. Boggia, Ácido elágico um composto
bioativo multi-alvo para descoberta de drogas no SNC? Uma revisão narrativa, Eur. J. Med. Química
Declaração de Interesse Concorrente 183 (2019) 111724, https://doi.org/10.1016/j. similar.2019.111724.

[14] Z. Liu, Z. Chen, F. Han, X. Kang, H. Gu, L. Yang, Método assistido por micro-ondas para hidrólise e
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes extração simultâneas na obtenção de ácido elágico, ácido gálico e óleo essencial de folhas de
conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho Eucalyptus globulus usando Bronsted ¨ líquido iônico ácido [HO3S(CH2)4mim]HSO4,
Prod. 81 (2016)
Ind. Crops
152–
relatado neste artigo. 161, https://doi.org/ 10.1016/j.indcrop.2015.11.074.

[15] AP Abbott, G. Capper, DL Davies, RK Rasheed, V. Tambyrajah, Novas propriedades solventes de

Reconhecimentos misturas de cloreto de colina/ureia, Chem. Comum. 7 (2003) 70-71, https://doi.org/10.1039/B210714G.

[16] RA Sheldon, JM Woodley, Papel da biocatálise na química sustentável, Chem.

Os autores agradecem o apoio financeiro da “Na
Programa Nacional de R&P Chave da China” (2018YFD1000605-01).
Apêndice A. Dados Suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi. org/10.1016/
j.microc.2020.105616.
Referências
[1] JE Mgaya, GB Shombe, SC Masikane, S. Mlowe, E. Mubofu, Casca de castanha de caju: um potencial
bio-recurso para a produção de produtos químicos, materiais e combustíveis de origem biológica,
Green Chem. 21 (2019) 1186–1201, https://doi.org/10.1039/x0xx00000x.
[2] J.-S. Ham, H.-Y. Kim, S.-T. Lim, Atividade antioxidante e desodorizante de componentes fenólicos em
extratos de casca de castanha, Ind. Crops Prod. 73 (2015) 99-105, https://doi.org/10.1016/
j.indcrop.2015.04.017.
[3] G. Squillaci, F. Apone, LM Sena, A. Carola, A. Tito, M. Bimonte, AD Lucia,
G. Colucci, FL Cara, A. Morana, Castanha (Castanea sativa Mill.) resíduos industriais como um
biorecurso valioso para a produção de ingredientes ativos, Process Biochem. 64 (2018) 228–236,
https://doi.org/10.1016/j.procbio.2017.09.017.
[4] Y. Ye, S. Mo, W. Feng, X. Ye, X. Shu, Y. Long, Y. Guan, J. Huang, J. Wang, O extrato etanólico de
Involcucrum castaneae melhorou as vias aéreas induzidas por ovalbumina inflamação e
espessamento do músculo liso em cobaias, J. Ethnopharmacol. 230 (2019) 9–19, https://doi.org/
10.1016/j.jep.2018.10.027.
[5] Vekiari SA, Gordon MH, Garcia-Macias P, Labrinea H, Extração e
determinação do teor de ácido elágico em cascas e frutos de castanha, Food Chem. 110 (4) (2008)
1007-1011, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.02.005.
Rev. 118 (2) (2018) 801-838, https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.7b00203.
[17] A. Paiva, R. Craveiro, I. Aroso, M. Martins, RL Reis, ARC Duarte, Solventes eutéticos profundos naturais
– solventes para o século XXI, ACS Sustainable Chem. Eng. 2 (2014) 1063-1071, https://doi.org/
10.1002/chin.201424290.
[18] Q. Zhang, K. De Oliveira Vigier, S. Royer, F. J´erome, ˆ Solventes eutéticos profundos: sínteses,
propriedades e aplicações, Chem. Soc. Rev. 41 (21) (2012) 7108, https://doi.org/10.1039/
c2cs35178a.
[19] X.-J. Shen, T. Chen, H.-M. Wang, Q. Mei, F. Yue, S. Sun, J.-L. Wen, T.-Q. Yuan, R.- C. Sun,
transformações estruturais e morfológicas de macromoléculas de lignina durante o pré-tratamento
com solvente eutético profundo de base biológica (DES), ACS Sustainable Chem.
Eng. 8 (5) (2020) 2130–2137, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.9b05106.
[20] J. Ali, M. Tuzen, D. Citak, OD Uluozlu, D. Mendil, TG Kazi, HI Afridi,
Separação e pré-concentração de cromo trivalente em águas ambientais usando solvente eutético
profundo com método de microextração de líquido dispersivo assistido por ultrassom, J. Mol. Líquido
291 (2019) 111299, https://doi.org/ 10.1016/j.molliq.2019.111299.
´
J.
[21] D. Rodríguez-Llorente,´ A. Bengoa, G. Pascual-Munoz, P. Navarro, VI Agueda, A. Delgado, S.
Alvarez-Torrellas, J. García, M. Larriba, Recuperação
soluções aquosas
sustentável
usando deterpenóides
gorduras voláteis
e solventes
ácidos de
eutéticos, ACS Sustainable Chem. Eng. 7 (19) (2019) 16786–16794, https://doi.org/10.1021/
acssuschemeng.9b04290 .
[22] L.-T. Wang, Q. Yang, Qi Cui, X.-H. Fan, M.-Z. Dong, M.-Z. Gao, M.-J. Lv, J.-Y. An, D. Meng, X.-H. Zhao,
Y.ÿJ. Fu, sistema micelar de solvente eutético profundo à base de mentol reciclável para extração de
fitoquímicos de folhas de Ginkgo biloba, J. Cleaner Prod. 244 (2020) 118648, https://doi.org/10.1016/
j. jclepro.2019.118648.
[23] Qi Cui, J.-Z. Liu, L.-T. Wang, Y.ÿF. Kang, Y. Meng, J. Jiao, Y.ÿJ. Fu, Preparação de solventes eutéticos
profundos sustentáveis e sua eficiência na extração e

6
Machine Translated by Google
J.-Y. Um et ai.
enriquecimento dos principais flavonóides bioativos das folhas do espinheiro, J. Cleaner Prod.
184 (2018) 826-835, https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2018.02.295.
[24] AR Mansur, N.ÿE. Song, HW Jang, T.-G. Lim, M. Yoo, TG Nam, Otimizando a extração eutética
profunda assistida por ultrassom de flavonóides em brotos de trigo mourisco comum, Food Chem.
293 (2019) 438–445, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2019.05.003.
[25] P. Zhou, X. Wang, P. Liu, J. Huang, C. Wang, M. Pan, Z. Kuang, Extração de compostos fenólicos
aprimorados de folhas de Morus alba L. por solventes eutéticos profundos combinados com ultra-
som assistido extração, Ind. Crops Prod. 120 (2018) 147–154, https://doi.org/10.1016/
j.indcrop.2018.04.071.
[26] Li Duan, W.-H. Zhang, Z.-H. Zhang, E.-H. Liu, L. Guo, Avaliação de solventes eutéticos profundos
naturais para a extração de flavona C-glicosídeos bioativos de Flos Trollii, Microchem. J. 145
(2019) 180-186, https://doi.org/10.1016/j.
microc.2018.10.031.
[27] A. Gaÿuszka, ZM Migaszewski, P. Konieczka, J. Namie´snik, Analytical Eco-Scale para avaliar o
verde de procedimentos analíticos, TrAC, Trends Anal. Química 37 (2012) 61-72, https://doi.org/
10.1016/j.trac.2012.03.013.
[28] J. Pÿotka-Wasylka, Uma nova ferramenta para a avaliação do procedimento analítico: Green
Analytical Procedure Index, Talanta 181 (2018) 204–209, https://doi.org/ 10.1016/j.talanta.2018.01.
013.
[29] Y. Huang, F. Feng, J. Jiang, Y. Qiao, T. Wu, J. Voglmeir, Z.-G. Chen, Extração verde e eficiente
de rutina da casca de trigo sarraceno usando solventes eutéticos profundos naturais, Food
Chem. 221 (2017) 1400–1405, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.11.013.
[30] Y. Li, B. Jiang, T. Zhang, W. Mu, J. Liu, Antioxidante e atividades de eliminação de radicais livres
do hidrolisado de proteína de grão de bico (CPH), Food Chem. 106 (2) (2008) 444-450, https://
doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.04.067.
[31] B. Shan, Y.-Z. Cai, JD Brooks, H. Corke, A atividade antibacteriana in vitro de
especiarias dietéticas e extratos de ervas medicinais, Int. J. Microbiol Alimentar. 117 (1) (2007)
112-119, https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.03.003.
[32] C.-L. Chan, R.-Y. Gan, NP Shah, H. Corke, Polifenóis de especiarias dietéticas selecionadas e
ervas medicinais afetam diferencialmente bactérias patogênicas comuns transmitidas por
alimentos e bactérias do ácido lático, Food Control 92 (2018) 437–443, https://doi. org/10.1016/
j.foodcont.2018.05.032.
[33] B. Shan, YZ Cai, JD Brooks, H. Corke, Propriedades antibacterianas e principais componentes
bioativos do pau de canela (Cinnamomum burmannii): atividade
Revista Microquímica 160 (2021) 105616
contra bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, J. Agri. Química Alimentar. 55 (2007)
5484-5490, https://doi.org/10.1021/jf070424d.
[34] W. Bi, M. Tian, KH Row, Avaliação de solvente eutético profundo à base de álcool na extração e
determinação de flavonóides com otimização de metodologia de superfície de resposta, J.
Chromatogr. A 1285 (2013) 22-30, https://doi.org/10.1016/j. croma.2013.02.041.
[35] M.-Z. Gao, Qi Cui, L.-T. Wang, Y. Meng, L. Yu, Y.-Y. Li, Y.-J. Fu, Uma estratégia verde e
integrada para extração de compostos fenólicos aprimorados de folhas de amoreira (Morus
alba L.) por solvente eutético profundo, Microchem. J. 154 (2020) 104598, https://doi.org/10.1016/
j.microc.2020.104598.
[36] SS Patil, A. Pathak, VK Rathod, Otimização e estudo cinético de extração eutética profunda
assistida por solvente com base em solvente: Uma rota mais verde para extração de
curcuminóides de Curcuma longa, Ultrason. Sonochem. 70 (2021) 105267, https://doi.org/
10.1016/j.ultsonch.2020.105267.
[37] S.-H. Ren, Y. Xiao, Y.-M. Wang, J. Kong, Y.ÿC. Hou, W.-Z. Wu, Efeito da água na separação de
fenol do óleo modelo com cloreto de colina através da formação de solvente eutético profundo,
Processo Combustível. Tecnol. 137 (2015) 104–108, https://doi.org/ 10.1016/j.fuproc.2015.04.004.
[38] Y. Dai, J. van Sprosen, G.-J. Witkamp, R. Verpoorte, YH Choi, Natural profundo
solventes eutéticos como novos meios potenciais para tecnologia verde, Anal. Chim. Acta 766
(2013) 61–68, https://doi.org/10.1016/j.aca.2012.12.019.
[39] H. Tian, J. Wang, Y. Li, W. Bi, DDY Chen, Recuperação de produtos naturais de solventes eutéticos
profundos por desnaturação por imitação, ACS Sustainable Chem. Eng. 7 (11) (2019) 9976–
9983, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.9b01012. ˆ
[40] M. Nikoli´c, J. Glamoclija, ICFR Ferreira, RC Calhelha, A. Fernandes,
T. Markovi´c, D. Markovi´c, A. Giweli, M. Sokovi´c, Composição química, atividade
antimicrobiana, antioxidante e antitumoral de Thymus serpyllum L., Thymus algeriensis Boiss. e
óleos essenciais de Reut e Thymus vulgaris L., Ind. Crops Prod. 52 (2014) 183–190, https://
doi.org/10.1016/j.indcrop.2013.10.006.
[41] C. Dias, R. Domínguez-Perles, A. Aires, A. Teixeira, E. Rosa, A. Barros, M.
J. Saavedra, Fitoquímica e atividade contra patógenos digestivos de extratos (poli)fenólicos
do caule da uva (Vitis vinifera L.), LWT - Food Sci. Tecnol. 61 (1) (2015) 25–32, https://doi.org/
10.1016/j.lwt.2014.11.033.
[42] R.-Y. Gan, Z.-Q. Deng, A.-X. Yan, NP Shah, W.-Y. Luís, C.-L. Chan, H. Corke,
Cascas de feijão comestíveis pigmentadas como fontes naturais de polifenóis com efeitos
antioxidantes e antibacterianos, LWT - Food Sci. Tecnol. 73 (2016) 168-177, https://doi. org/
10.1016/j.lwt.2016.06.012.