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com
moléculas
Artigo
Casca do Umbu como Fonte de Antioxidante, Antimicrobiano e α
-Compostos Inibidores de Amilase
Leilson de Oliveira Ribeiro1,* , Beatriz Pereira de Freitas2, Carolline Margot Albanez Lorentino3, Heloísa Freire
Frota3, AndrééLuiz Souza dos Santos3, Davyson de Lima Moreira4, Bruno S.érgio do amaral5, Eliane Przytyk Jung1
e Claudete Norie Kunigami1
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Citação:Ribeiro, LdO; de Freitas, BP;
Lorentino, CMA; Frota, HF; dos Santos,
ALS; Moreira, DdL; do Amaral, BS;
Jung, EP; Kunigami, CN Casca de umbu
como fonte de compostos
antioxidantes, antimicrobianos e
inibidores de α-amilase. moléculas
2022,27, 410. https://doi.org/10.3390/
molecules27020410
Editores acadêmicos:
Francisco Cacciola e
Urszula Gawlik-Dziki
Recebido: 11 de dezembro de 2021
Aceito: 6 de janeiro de 2022
Publicado: 9 de janeiro de 2022
Nota do Editor:O MDPI permanece neutro
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creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Verruga Cules2022,27, 410. https://doi.org/10.3390/molecules27020410
1 Laboratório de Análises Químicas Orgânicas e Inorgânicas, Instituto Nacional de Tecnologia,
Rio de Janeiro 20081-312, Brasil; eliane.jung@int.gov.br (EPJ); claudete.kunigami@int.gov.br (CNK) Faculdade
2 de Engenharia Química, Universidade Federal Fluminense, Niterói 24210-240, Brasil;
beatrizzfreitas11@gmail.com
3 Laboratório de Estudos Avançados de Microorganismos Emergentes e Resistentes, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro 21941-902, Brasil; carolline.margot@gmail.com (CMAL);
heloisafreiref@gmail.com (HFF); andre@micro.ufrj.br (ALSdS)
4 Laboratório de Produtos Naturais, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro 22460-030, Brasil; davysonmoreira@jbrj.gov.br
5 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Sao Paulo, S.ao Paulo 05110-000, Brasil;
bruno.sergio90@gmail.com
* Correspondência: leilson.oliveira@int.gov.br
Abstrato:Aqui, a extração de compostos bioativos da casca do umbu foi otimizada usando extração
sólido-líquido assistida termicamente. Paralelamente, também foram avaliados os efeitos antioxidante,
antimicrobiano e inibitório contra a α-amilase do extrato otimizado. A combinação de condições
operacionais, incluindo a temperatura (32–74◦C), concentração de etanol (13–97%) e relação sólido/
líquido (1:10–1:60;p/v) foi empregado usando um design composto central rotacional para otimização. Os
extratos foram avaliados quanto aos compostos fenólicos totais (TPC), compostos flavonoides totais (TFC)
e capacidade antioxidante por ABTS•+, DPPH•e ensaios FRAP. O perfil bioativo do extrato otimizado foi
obtido por cromatografia líquida de ultra-performance acoplada a espectrometria de massa quadrupolo/
time-of-flight em ionização por electrospray nos modos negativo e positivo. Os resultados avaliados
estatisticamente mostraram que as condições operacionais ótimas para a recuperação de compostos
bioativos da casca do umbu incluíam 74◦C, 37% de etanol e uma relação sólido-líquido de 1:38. Nessas
condições, os valores obtidos foram 1985 mg GAE/100 g, 1364 mg RE/100 g, 122µmol TE/g, 174µmol/TE g
e 468µmol Fe2+/g para TPC, TFC, ABTS•+, DPPH•, e ensaios FRAP, respectivamente. Além disso, o extrato
otimizado foi eficaz contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (MBC variou de 0,060 a 0,24 mg
GAE/mL), bem como foi eficaz para inibir a α-amilase (IC50valor de 0,076 mg GAE/mL). O extrato
otimizado mostrou ser constituído principalmente por ácidos fenólicos e flavonoides.
Palavras-chave:Spondias tuberosa; resíduos de umbu; otimização de extração; espectrometria de massa; atividade
enzimática; atividade antibacteriana
1. Introdução
As frutas nativas do Brasil têm recebido destaque nos últimos anos por serem fontes de
compostos de grande interesse tecnológico e sanitário. Frutas como umbu, camucamu e
juçara são fontes de vitamina C e compostos fenólicos, por exemplo [1,2]. O umbu do
semiárido brasileiro contém compostos bioativos como rutina, quercetina, carotenoides e
vitamina C, conforme relatado por Ribeiro et al. [3]. Essa rica composição confere relevante
potencial antioxidante à fruta. Além de ser uma fruta rica em compostos bioativos, o umbu
desempenha importante papel socioeconômico, pois fornece e
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aumenta a renda de pequenos e médios produtores do semiárido brasileiro. Estima-se que 7.765
toneladas desta fruta foram produzidas em 2018 [4], sendo também comercializado como polpa
congelada [5].
O processamento de frutas gera um grande volume de resíduos, compostos principalmente por
cascas, sementes e caroços. Atualmente, sabe-se que os resíduos do processamento de frutas podem ser
ricos em compostos de alto valor agregado. Assim, seu uso para a recuperação de compostos
antioxidantes e/ou corantes tem sido avaliado.6]. O bagaço de uva, por exemplo, tem sido
extensivamente avaliado para este fim principalmente devido ao seu potencial antioxidante, que
aumenta a capacidade antioxidante dos produtos desenvolvidos e melhora sua vida de prateleira.7].
No caso do umbu, a casca e a semente já foram avaliadas quanto à composição em macro e
micronutrientes e compostos bioativos. Ribeiro e cols. [3] relatou que a casca da fruta apresentou teores
de 1775 mg/100 g e 2751µg/100 g para compostos fenólicos totais e carotenóides totais,
respectivamente, sendo identificados flavonóides como rutina e quercetina. Dentre os carotenoides,
destacaram-se o β-caroteno, a zeinoxantina e a β-criptoxantina. A semente do fruto foi avaliada por Dias
et al. [8]. Segundo esses autores, o óleo da semente era composto de ácidos graxos palmítico, esteárico,
oleico, linoleico e linolênico, com alto teor de ácidos graxos insaturados (70-73%). Os autores também
apontaram que os extratos obtidos das sementes eram ricos em compostos fenólicos. Omena et al. [9]
relataram que as frações do umbu, polpa, casca e semente, não apresentaram citotoxicidade em ensaios
com células epiteliais da córnea de ovelha. Além disso, a triagem fitoquímica mostrou a presença de
fenóis, taninos, antraquinonas, antronas, cumarinas, triterpenóides e esteróides em cascas de frutas
extraídas com solução hidroetanólica a 95% (ensaios qualitativos). A atividade antioxidante deste extrato
também foi avaliada usando um modelo de membrana de peroxidação lipídica mediada por radical
peroxila, sendo observado que os extratos de casca e semente de umbu forneceram mais de 95% de
proteção da membrana por 15 min. Esses resultados foram considerados melhores do que os obtidos
pelos controles positivos (Trolox, vitamina C e resveratrol). Cangussu et al. [10] avaliou o potencial das
farinhas da casca do umbu maduro e semi-maduro como fonte de compostos bioativos, destacando a
presença de trigonelina, um alcaloide com atividades bioativas. Os autores também avaliaram a
bioacessibilidade dos fenólicos, flavonoides e taninos extraíveis totais da farinha da casca do umbu,
sugerindo que a farinha da casca do umbu pode ser utilizada em produtos alimentícios em substituição a
outras farinhas de menor valor nutricional e funcional. Dessa forma, os dados demonstram o potencial
do resíduo do beneficiamento do umbu para a obtenção de novos produtos e/ou bioprodutos. Apesar
disso, tanto quanto sabemos, as condições ótimas para a recuperação dos compostos bioativos da casca
da fruta ainda não foram otimizadas de forma a proporcionar uma abordagem tecnológica para a
obtenção de um extrato rico em compostos bioativos com potencial de aplicação pelas indústrias
alimentícia e cosmética, como nos exemplos a seguir. Um extrato da casca da fruta siriguela foi utilizado
como ingrediente ativo na formulação de um filtro solar. Silva e cols. [11] relataram que o extrato
composto por dicafeoilglicose, hexahidroxidifenoil-galoil-glicose, galoil-bis-hexahidroxidifenoil-glicose,
rutina e quercetina (compostos fenólicos) promoveu proteção contra os raios UVB em uma formulação
de filtro solar a 30% do extrato. Extratos de cascas de frutas também têm sido utilizados para enriquecer
películas e revestimentos alimentícios, uma vez que compostos bioativos podem apresentar ação
antimicrobiana, o que ajuda a manter a qualidade pós-colheita das frutas conforme relatado por Gull et
al. [12]. Seus resultados mostraram que frutas de damasco tratadas com revestimento de nanoquitosana
adicionadas com 1% de extrato de casca de romã reduziram significativamente a porcentagem de
decomposição, perda de peso, retiveram efetivamente a atividade antioxidante, ácido ascórbico,
mantiveram acidez titulável e firmeza em um nível mais alto do que frutas não tratadas, bem como inibiu
significativamente a contagem de bactérias psicrofílicas totais, contagem de leveduras e bolores durante
o armazenamento a 4◦C por 30 dias.

Assim, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a extração de compostos

bioativos da casca do umbu e avaliar o perfil fitoquímico do extrato otimizado por UPLC-
qTOF/MS (cromatografia líquida de ultra-performance acoplada a espectrometria de massa
quadrupolo/time-of-flight). Adicionalmente, avaliou-se o efeito antioxidante, o efeito do
extrato otimizado contra microrganismos clinicamente relevantes e a atividade enzimática da
α-amilase.
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2. Resultados e Discussão
2.1. Efeito de Variáveis Independentes
Observou-se que a casca do umbu forneceu extratos antioxidantes por diferentes ensaios,
além de ser rica em compostos fenólicos, conforme resumido na Tabela1. O teor de TPC mudou de
525 mg/100 g para 1986 mg/100 g, mostrando a forte influência da temperatura de extração,
solução extrativa e fatores de relação sólido-líquido. O maior valor para esta resposta foi obtido
quando temperaturas de extração mais altas foram empregadas. Esse padrão também foi
observado para o teor de TFC, cujo valor máximo foi de 1513 mg/100 g. Nossos resultados foram
superiores aos dados relatados por Ribeiro et al. [3], que encontrou 1775 mg/100 g de TPC para
casca de umbu extraída com acetona 70% (extração analítica). Além disso, esses autores relataram
a presença de quercetina e rutina nessa fração da fruta. Isso corrobora o uso do conteúdo de TFC
como resposta em nosso estudo de extração.

Tabela 1.Valores reais e codificados das variáveis independentes empregadas para recuperar os compostos
bioativos das cascas de umbu e compostos fenólicos totais (TPC) e flavonoides (TFC) e valores da capacidade
antioxidante dos extratos.

Temperatura Etanol Relação sólido-líquido TPC1 TFC2

Ensaios ABTS•+3 DPPH•3 FRAP4
(◦C) (%) (g/ml)
1 40 (−1) 30 (−1) 1:20 (−1) 1280 925 74 95 319
2 40 (−1) 30 (−1) 1:50 (+1) 1644 1015 83 136 364
3 40 (−1) 80 (+1) 1:20 (−1) 603 692 25 49 150
4 40 (−1) 80 (+1) 1:50 (+1) 811 700 25 82 130
5 65(+1) 30 (−1) 1:20 (−1) 1593 1203 88 113 443
6 65 (+1) 30 (−1) 1:50 (+1) 1677 1207 101 163 448
7 65 (+1) 80 (+1) 1:20 (−1) 731 867 34 65 180
8 65 (+1) 80 (+1) 1:50 (+1) 850 877 37 96 246
9 32 (−1.68) 55 (0) 1:35 (0) 1231 847 58 105 289
10 74 (+1,68) 55 (0) 1:35 (0) 1986 1513 109 162 504
11 53 (0) 13 (−1.68) 1:35 (0) 1315 906 74 126 348
12 53 (0) 97 (+1,68) 1:35 (0) 525 646 9 51 119
13 53 (0) 55 (0) 1:10 (−1.68) 1075 1121 61 71 321
14 53 (0) 55 (0) 1:60 (+1,68) 1652 1038 74 160 442
15 (PC) 53 (0) 55 (0) 1:35 (0) 1479 1055 73 121 316
16 (CP) 53 (0) 55 (0) 1:35 (0) 1379 1087 72 125 346
17 (CP) 53 (0) 55 (0) 1:35 (0) 1405 1186 77 128 364
CP—Ponto central. 1Resultados expressos em mg GAE/100 g. 2Resultados expressos em mg RE/100 g. 3Resultados

Expresso comoµmol Trolox/g.4Resultados expressos comoµmol Fe2+/g.

Em relação à capacidade antioxidante dos extratos da casca do umbu foi registrado para ABTS•+,
DPPH•e os ensaios FRAP mostram que esse potencial aumentou 12, 3,3 e 4,2 vezes, respectivamente. Isso
corrobora as condições operacionais que têm grande influência na capacidade antioxidante, como
também observado para os teores de TPC e TFC. Além disso, os resultados corroboram que a interação
composto-radical é diferente, sendo, portanto, relevante a utilização de diversos ensaios para avaliação
da capacidade antioxidante de amostras vegetais. É importante ressaltar que o potencial antioxidante
observado na casca do umbu se deve à presença de compostos bioativos como os fenólicos.13] e sua
recuperação é uma alternativa para agregar valor à cadeia agropecuária da fruta, uma vez que as cascas
são descartadas após o despolpamento.
O maior valor encontrado para ABTS•+resposta em nosso trabalho (109µmol Trolox/g)
aproximou-se dos dados relatados por Ribeiro et al. [3], que avaliou diferentes frações do umbu
(143µmol Trolox/g). No estudo realizado por esses autores, a casca da fruta foi submetida a
sucessivas extrações com 50% de metanol e 70% de acetona (extração analítica), o que melhora a
recuperação dos compostos bioativos. Assim, eles relataram um maior valor de capacidade
antioxidante. No entanto, esses solventes são tóxicos, o que pode reduzir o potencial de sua
aplicação posterior, principalmente na indústria alimentícia.
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Com relação à análise estatística, todos os modelos foram significativos para prever o padrão
das respostas em relação às variáveis independentes, uma vez que os valores F calculados foram
maiores do que os valores F listados (F9,7= 3,68) emp=0,05. Para TPC, TFC, ABTS•+, DPPH•e
respostas FRAP, os valores F calculados foram 7,74, 7,27, 16,34, 18,38 e 7,08, respectivamente.
Além disso, vale ressaltar que a falta de ajuste não foi significativa, pois apresentoup-valores
inferiores a 0,05 e valores F calculados inferiores ao valor F listado para todas as respostas. o R2
os valores dos modelos ajustados foram 0,91, 0,90, 0,95, 0,96 e 0,91 para TPC, TFC, ABTS•+, DPPH•
e respostas do FRAP, respectivamente, mostrando que os modelos explicaram, pelo menos, 90% da
variabilidade dos dados obtidos neste delineamento experimental. Portanto, as superfícies de resposta
foram construídas para relacionar variáveis independentes e respostas. Figuras1e2mostram o efeito da
temperatura e da concentração de etanol, com a relação sólido-líquido fixada em 1:35, nos teores de TPC
e TFC e na capacidade antioxidante medida pelo ABTS•+, DPPH•e ensaios FRAP. A relação sólido-líquido
foi fixada em 1:35 por ter menor influência nos resultados, conforme pode ser observado nos gráficos de
Pareto (Figuras1e2), exceto para capacidade antioxidante por DPPH•ensaio.

Figura 1.Efeito das variáveis independentes sobre os compostos fenólicos totais (TPC) (a), compostos
flavonoides totais (TFC) (b).

Por meio do Gráfico de Pareto (Figura1a), é possível notar que a concentração de etanol
teve maior influência no teor de CPT dos extratos. O efeito linear apresentou um valor
significativo e negativo emp=0,05. Adicionalmente, observou-se que o efeito quadrático deste
fator foi significativo. Isso corrobora que existe um valor máximo de concentração de etanol,
o que promove maior obtenção de compostos fenólicos. A partir deste valor, há menor
recuperação destes compostos. Além disso, os efeitos lineares da temperatura e da relação
sólido-líquido foram significativos e positivos. Dessa forma, há maior recuperação dos
compostos fenólicos da casca do umbu a partir do aumento desses parâmetros. Através da
superfície de resposta (Figura1a), registra-se que utilizando temperaturas superiores a 60◦C e
solução de etanol entre 20 e 50%, obteve-se alto teor de TPC.
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Figura 2.Efeito das variáveis independentes sobre a capacidade antioxidante do ABTS•+(a), DPPH•(b) e
FRAP (c) ensaios.

Observou-se pelo teor de CFT que o efeito positivo e linear da temperatura foi o que
teve maior influência na recuperação dos compostos flavonoides seguido do efeito linear e
quadrático da concentração de etanol, ambos negativos (p<0,05) (Figura1b). Assim, como foi
citado acima, a temperatura aumenta a recuperação de compostos flavonoides da casca da
fruta. Para a concentração de etanol, há um limite para esse padrão, pois esse efeito
quadrático também foi significativo. Pela superfície de resposta, é possível observar que, nas
zonas de vermelho intenso, houve maior recuperação de flavonoides da casca do umbu, que
compreende temperatura entre 70 e 80◦C e concentração de etanol entre 20 e 60% (Figura1
b). Porém, é importante ressaltar que o ponto de ebulição do etanol é de 78,2◦C; portanto,
não é adequado excedê-lo. Além disso, a elevação da temperatura pode elevar o custo do
processo.
A capacidade antioxidante do ABTS•+ensaio teve o mesmo comportamento observado para o
conteúdo de TPC em relação à influência de variáveis independentes. A concentração de etanol exerceu
efeito negativo sobre esta resposta, sendo inversamente proporcional ao potencial antioxidante do
extrato, ou seja, altas concentrações de etanol reduziram a capacidade antioxidante dos extratos por
recuperarem menos compostos antioxidantes. Temperatura acima de 60◦C e concentração de etanol
abaixo de 50% compõem a faixa na zona vermelha intensa com maior capacidade antioxidante deste
ensaio (Figura2a).
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por DPPH•No ensaio, os fatores com influência significativa nesta resposta foram o efeito
linear da concentração de etanol, o efeito linear da relação sólido-líquido, o efeito quadrático da
concentração de etanol, o efeito linear da temperatura e o efeito quadrático da relação sólido-
líquido . Da mesma forma, a concentração de etanol favoreceu a recuperação de compostos
antioxidantes (Figura2b). Além disso, é importante destacar que a relação sólido-líquido teve maior
influência nessa resposta, quando comparada às outras respostas avaliadas neste estudo.

A capacidade antioxidante medida pelo ensaio FRAP foi dependente da concentração de

etanol e da temperatura de extração, sendo observado efeito negativo da concentração de
etanol e efeito positivo da temperatura. Pela superfície de resposta é possível notar que esse
potencial é maior quando a temperatura utilizada no processo de extração foi superior a 60◦C
e a concentração de etanol estava entre 10 e 50% (Figura2c).
Portanto, a influência da concentração de etanol (<50%) e temperatura (>60◦C) destaca-se a
recuperação de compostos bioativos da casca do umbu. O uso de um solvente binário contendo
mais água do que etanol mostrou-se mais eficiente para a extração. Ribeiro e cols. [14] também
relataram que o uso de etanol 30% em água como solução extrativa foi mais eficiente para extrair
os compostos antioxidantes das cascas de siriguela (Spondias purpurea). Jesus e outros [15]
publicaram um efeito positivo do solvente binário na recuperação de compostos antioxidantes de
resíduos de poda de videira. Segundo esses autores, misturas de álcoois/água foram mais
eficientes na extração de compostos fenólicos do que solventes monocomponentes devido ao
aumento da permeabilidade da membrana do material vegetal. Além disso, Oreopoulou et al. [16]
relataram que a eficiência de um solvente depende principalmente de sua capacidade de extrair
compostos bioativos, onde o etanol é um solvente adequado para solubilizar glicosídeos
flavonoides, enquanto a água torna-se mais capaz de dissolver glicosídeos ácidos fenólicos,
corroborando a utilização de um sistema binário de solventes composto por etanol e água. Além
disso, o etanol é um solvente verde, abundante e atóxico, o que aumenta sua utilização nos
processos de extração.
A temperatura de extração também tem um papel importante na extração de compostos
bioativos, pois aumenta tanto a solubilidade do soluto quanto o coeficiente de difusão de
compostos fenólicos conforme relatado por Rueuz-Garceua et al. [17], que obteve maior teor de
compostos fenólicos da casca da uva quando a temperatura de extração foi aumentada de 23◦C a
57◦C. No entanto, é importante ressaltar que nossos resultados revelam que o efeito positivo da
temperatura foi acompanhado pelo efeito da porcentagem de etanol na solução de extração, o que
corrobora a otimização dos processos de extração. Além disso, conforme relatado por Markom et
al. [18], a tensão superficial e a viscosidade do solvente são drasticamente reduzidas no ponto de
ebulição quando comparadas a uma temperatura mais baixa. Neste contexto, o solvente pode
atingir facilmente a parede celular do material vegetal. Assim, o extrato rico em bioativos é
resultado principalmente do efeito sinérgico da concentração de etanol na solução extrativa e da
temperatura do processo.

2.2. Seleção da condição operacional ideal

Conforme citado acima, cada resposta apresentou diferentes condições operacionais
para a extração dos compostos bioativos da casca do umbu. Assim, para melhor entender os
resultados e obter a condição ótima de temperatura, concentração de etanol e relação sólido-
líquido, que melhorasse a recuperação dos compostos bioativos, foi utilizado o método de
otimização simultânea. Figura3mostra perfis de conveniência individuais e gerais para as
condições de extração e respostas avaliadas. O valor global de desejabilidade alcançado foi
igual a 0,97, correspondendo à condição operacional ótima para extração de compostos
bioativos da casca da fruta. Portanto, a extração deve ser realizada a 74◦C, usando etanol 37%
e uma relação sólido-líquido de 1:38 para maximizar a recuperação desses compostos.
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Figura 3.Perfil de valores preditos para desejabilidade individual e global para a otimização da
extração. TPC—compostos fenólicos totais (mg GAE/100 g); TFC—compostos flavonoides totais (mg
RE/100 g); ATBS•+—(µmol TE/g); DPPH•—(µmol TE/g); FRAP—(µmol Fe2+/g).

Nesta condição operacional, foram observados valores de TPC (1985 mg GAE/100 g);
TFC (1364 mg RE/100 g); e capacidade antioxidante por ABTS•+(122µmol TE/g), DPPH•
(174µmol/TE g) e ensaios FRAP (468µmol Fe2+/g) estavam próximos dos valores previstos pelo
delineamento experimental: TPC (1928 mg GAE/100 g); TFC (1421 mg RE/100 g); capacidade
antioxidante por ABTS•+(112µmol TE/g), DPPH•(166µmol TE/g) e ensaios FRAP (514µmol Fe2+/
g) com coeficientes de variação inferiores a 7%. Portanto, os resultados mostraram que o
planejamento experimental é adequado para obter a condição operacional ótima para
extração de compostos bioativos da casca do umbu.

2.3. Perfil Bioativo por LC-HRMS

A análise LC-HRMS permitiu a identificação de 15 compostos químicos diferentes no
extrato (Tabelas2e3). De acordo com a seção experimental, a identificação foi realizada pelo
padrão de fragmentação MS/MS, comparação com a biblioteca GNPS e seleção dos hits que
foram previamente isolados deEspondiasspp. [3,19,20], compostos de espécies pertencentes
à família Anacardiaceae ou compostos comuns em espécies vegetais (ver Tabelas2e3). Não foi
possível construir clusters devido ao padrão de fragmentação relativamente baixo da
amostra. Os compostos foram melhor ionizados no modo positivo. O ácido pipecólico e o
ácido antranílico e seus derivados foram propostos por serem metabólitos secundários muito
comuns em plantas, inclusive em frutas.21,22]. A anotação dos compostos 2'-hidroxi-4'-
metoxiacetofenona, 4-acetil-2-prenilfenol e rubinaftina A foi baseada em compostos fenólicos
que podem ser encontrados em muitas espécies vegetais, bem como em ácidos fenólicos já
identificados emEspondiasspp., como ácido gálico, ácido 3,5-diidroxibenzóico e ácido
cumárico [3,19,20]. Isso observado, flavonóides, derivados do ácido benzóico, glicosídeos
(koaburside), C6-C3derivados, entre outros compostos, foram identificados no extrato.
Alguma atenção deve ser dada à rutina, que foi identificada em ambos os modos de
ionização. Este composto foi previamente identificado no umbu e tem mostrado muitas
propriedades biológicas, como cardiovascular, anticancerígena, anti-inflamatória,
antidiabética, antiobesidade, antimicrobiana, antileishmania, antioxidante
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atividades e outros [3,19,20,23]. Já se sabe que os flavonoides e os ácidos fenólicos possuem grandes
propriedades antioxidantes, conforme demonstrado em nosso trabalho [24,25].

Mesa 2.Metabólitos identificados provisoriamente por LC-HRMS no modo de íon negativo.

m/z m/z Molecular Fragmento

# tR(min) Metabólito Organismo/Referência
Observado Teórico Fórmula Íons (m/z)
3,5-
125.0261; Já descrito em
1 4.14 153.0200 153.0193 C7H6O4 Diidroxibenzóico
109.0279 Espondiasspp. [19]
ácido

301.0357;
300.0288;
Já descrito em
2 18h45 609.1482 609.1461 C27H30O16 273.0350; rutina
Espondiasspp. [3,20]
257.0430;
151.0033

300.0256;
Já descrito em
3 18.72 463.0862 463.0882 C21H20O12 271.0236; isoquercitrina
Espondiasspp. [19]
255.0342

285.0372;
284.0343;
kaempferol Já descrito em
4 20.62 593.1535 593.1512 C27H30O15 257.0501;
3-O-rutinoside Espondiasspp. [19]
255.0366;
227.0402

178.0512;
Já descrito em
5 35.27 193.0709 193.0506 C10H10O4 149.0979; Ácido ferúlico
Espondiasspp. [19]
134.0676

Tabela 3.Metabólitos identificados provisoriamente por LC-HRMS no modo de íon positivo.

m/z m/z Molecular Fragmento

# tR(min) Aduto Metabólito Organismo/Referência
Observado Teórico Fórmula Íons (m/z)

145.0502;
127.0399;
6 1,58 325.1329 325.1129 C12H22O11 [M−H2O + H]+ 85.0297; sacarose Muito comum em plantas
69.0342;
55.0188

84.0427;
7 3.10 130.0863 130.0863 C6H11NÃO2 [M + H]+ 57.0692; ácido pipecólico Encontrado emCitrinospp. [21]
56.0506

147.0445;
Já descrito em
8 7.47 165.0545 165.0546 C9H8O3 [M + H]+ 120.0824; ácido cumárico
Espondiasspp. [3,20]
119.0515

Encontrado emrhus parviflora

3,4,5-
185.0790; (Anacardiaceae) [26]
Trimetoxifenil
154.0640;
9 7.82 347.1670 347.1337 C15H22O9 [M + H]+ beta-D-
Encontrado em
153.0560; Cladogynos orientalis
glicopiranósido
125.0600 (Euphorbiaceae) [27]
(Koaburside)
121.0657;
Encontrado emArabidopsis
10 9.62 138.0557 138.0550 C7H7NÃO2 [M + H]+ 92.9800; ácido antranílico
thaliana(Crucíferas) [28]
65.0410

465.1022;
303.0496; Já descrito em
2 18h40 611.1614 611.1607 C27H30O16 [M + H]+ rutina
145.0511; Espondiasspp. [3,20]
129.0568
moléculas2022,27, 410 9 de 16

Tabela 3.Cont.

m/z m/z Molecular Fragmento

# tR(min) Aduto Metabólito Organismo/Referência
Observado Teórico Fórmula Íons (m/z)

447.1002;
303.0463; Já descrito em
3 18.54 465.1028 465.1028 C21H20O12 [M + H]+ isoquercitrina
258.0178; Espondiasspp. [19]
231.1018

149.0260; 2'-Hidroxi-4'-
fentrar emPaeoniaspp.
11 19.42 167.0705 167.0703 C9H10O3 [M + H]+ 125.0960; metoxiacetofenona
(Ranunculaceae) [29]
121.0310 (Paeonol)

149.0255;
Encontrado emPolimnia
121.0309; 4-Acetil-2-
12 36.01 205.1166 205.1223 C13H16O2 [M + H]+ sonchifolia
107.0825; prenilfenol
(Asteraceae) [30]
59.0501

303.1460;
Quercetina-
302.1490;
13 36.11 581.1551 581.1501 C26H28O15 [M + H]+ desoxihexosil- Muito comum em plantas
153.0967;
pentosídeo
149.0236

149.0240;
147.0656; Encontrado emrubiaspp.
14 38.09 389.2336 389.0843 C17H18O9 [M+Na]+ 129.0550; Rubinaftina A (Rubiaceae), ou seja,rubia
71.0850; yunnanensis[31]
57.0705

179.0861;
169.0027;
15 42.19 197.0812 197.0808 C10H12O4 [M + H]+ ácido diidroferúlico Muito comum em plantas
137.0633;
95.0850

2.4. Ensaios Antimicrobianos

A ação antimicrobiana do extrato otimizado da casca do umbu foi testada contra uma
variedade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como contra Cândidaespécies
(Tabela4). Os resultados mostraram uma capacidade distinta do extrato da casca do umbu em
inibir a viabilidade microbiana com maior ação sobre bactérias Gram-positivas (valores de CIM
variando de 0,03 a 0,06 mg GAE/mL) em comparação com bactérias Gram-negativas (CIM = 0,12
mg GAE/mL) mL), enquanto foi completamente ineficaz contraCândidaespécie, o que revela sua
capacidade de agir contra bactérias, mas não contra fungos. A concentração bactericida mínima
variou de 0,06 a 0,24 mg GAE/mL, tornando as bactérias Gram-positivas mais susceptíveis do que
as bactérias Gram-negativas. Esses resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pelas
diferenças morfológicas observadas entre esses dois grupos, em que as bactérias Gram-negativas
possuem uma membrana externa extra juntamente com espaço periplasmático que serve como
uma barreira de permeação seletiva, reduzindo assim a interação química e efeitos de inibição do
extrato [32]. Vários estudos têm atribuído o efeito inibitório de extratos de plantas contra
diferentes bactérias aos seus compostos fenólicos, como os identificados provisoriamente no
presente trabalho por LC-HRMS (Tabelas2e3). Esses compostos podem apresentar a capacidade de
se ligar à parede celular bacteriana e inibir o crescimento bacteriano. Além disso, compostos
fenólicos podem precipitar proteínas e inibir enzimas de microrganismos.33]. Além disso, é
relevante ressaltar que a ação antibacteriana pode ser devida à sinergia de vários compostos,
incluindo ácidos fenólicos e derivados de flavonoides e outros compostos bioativos apresentados
nas Tabelas2e3.

2.5. Inibição de α-amilase

Neste conjunto de experimentos, foi avaliado o efeito do extrato da casca do umbu sobre a
atividade da α-amilase. Os resultados revelaram que o extrato de umbu inibiu a atividade da α-
amilase de forma tipicamente dose-dependente. Nesse contexto, o extrato na concentração de
0,01 mg GAE/mL apresentou percentual de inibição de 38,3% e na concentração de 0,273 mg GAE/
mL aumentou para 87,4%. O extrato apresentou um IC50valor de 0,076 mg GAE/mL. A acarbose é
amplamente utilizada na medicina como um inibidor de enzimas digestivas relacionadas com
moléculas2022,27, 410 10 de 16

a quebra de polissacarídeos. Como essas enzimas são inibidas, há redução na absorção de

glicose e, consequentemente, redução da elevação da glicemia pós-prandial, o que ajuda a
reduzir o risco de Diabetes Mellitus e outras doenças.34,35]. o CI50valor da droga padrão foi
de 0,034 mg/mL. Embora seja necessária uma concentração menor deste medicamento para
inibição a 50% da atividade da α-amilase quando comparado ao extrato de umbu, destaca-se
que este extrato, obtido do resíduo da polpa do umbu, apresentou boa atividade inibitória
contra a α-amilase quando comparado com dados da literatura. Laaroussi et al. [36] relatou
que diferentes amostras de própolis do Marrocos apresentaram IC50valores entre 0,195 e
0,964 mg/mL, sendo, portanto, superior ao encontrado no extrato de umbu. Essa
comparação é interessante, pois a composição fitoquímica das amostras de própolis indicou
a presença de ácidos fenólicos, flavonoides e estilbenos, similar à composição do extrato de
umbu. Assim, esses resultados indicam que o extrato de umbu é um candidato promissor
para o controle e prevenção do Diabetes tipo 2.

Tabela 4.Atividade antimicrobiana do extrato da casca do umbu.

Ensaios Antimicrobianos (mg GAE/mL)1

microrganismos
Valores MIC Valores MBC/MFC
bactérias gram-positivas
Bacillus subtilis168 LMD 74,6 0,06 0,12
Staphylococcus aureusATCC 29213 0,06 0,06
Staphylococcus epidermidisATCC 12228 0,03 0,12
bactérias gram-negativas
Escherichia coliATCC 25922 0,12 0,24
Acinetobacter baumanniiATCC 19606 0,12 0,24
Psedomonas aeruginosaATCC 27853 0,12 0,24
Klebsiella pneumoniaeATCC13883 0,12 0,24
fungos
Candida albicansATCC 90028 ND ND
Candida tropicalisATCC 750 ND ND
ND—não detectado.1Resultados expressos em mg equivalente de ácido gálico/mL. MIC - concentração inibitória
mínima. MBC - concentração bactericida mínima. MFC - concentração fungicida mínima.

3. Materiais e Métodos
3.1. Casca de Umbu
Para este trabalho, foram utilizados frutos de umbu maduros (2,4 kg) adquiridos no mercado
local do Rio de Janeiro. Para isso, foram higienizados com hipoclorito de sódio (100 ppm) e
despolpados manualmente em peneira doméstica. Em seguida, as cascas de umbu foram secas
em estufa com circulação forçada de ar a 45◦C por 45h. As cascas secas foram desintegradas em
um misturador doméstico para obtenção de um pó. Apresentou-se com umidade igual a 17% (c/c),
determinado gravimetricamente a 105◦C.

3.2. Extração Sólido-Líquido Assistida Térmica

A extração dos compostos bioativos foi realizada por extração com solvente agitado, utilizando
frascos de vidro de 125 mL devidamente tampados e aquecidos por 60 min sob agitação constante de
130 rpm. Essas variáveis foram fixadas conforme Ribeiro et al. [14], que obteve extrato rico em
compostos antioxidantes da casca da siriguela. A temperatura de trabalho foi selecionada levando em
consideração o ponto de ebulição do etanol para evitar perdas durante o processo de extração. A
temperatura de extração, a porcentagem de etanol e a relação sólido-líquido (p/v) foram variados com o
objetivo de avaliar seu efeito nas respostas. O intervalo de variação das variáveis independentes foi
selecionado com base em dados preliminares e trabalhos publicados pelo nosso laboratório [14,37]. Os
extratos obtidos foram filtrados em papel de filtro quantitativo (FP41, Quanty) e armazenados em freezer
até posterior análise.
moléculas2022,27, 410 11 de 16

3.3. Design experimental

O efeito das variáveis independentes (temperatura de extração, porcentagem de etanol na
solução extrativa e relação sólido-líquido) sobre o teor de compostos fenólicos totais (TPC) e
compostos flavonoides totais (TFC) e capacidade antioxidante por ABTS•+, DPPH•
e os ensaios de FRAP foram avaliados usando a metodologia de superfície de resposta (RSM) baseada em
design composto rotacional central, composto por 8 pontos fatoriais (nível±1), 3 pontos centrais (nível 0)
e 6 pontos axiais (nível±1.68), resultando em 17 tentativas. Mesa1mostra a combinação das variáveis
independentes (valores codificados e reais). Os dados experimentais foram analisados por RSM, usando
a equação polinomial de segunda ordem. Análise de variância (ANOVA), teste de falta de ajuste e
coeficiente de determinação (R2) foram usados para verificar a significância do modelo.

Para determinar a condição ótima para extração dos compostos bioativos da casca
do umbu, foi utilizada a técnica de otimização simultânea de variáveis independentes
(desirability). A função desejabilidade é baseada na conversão de cada resposta em uma
desejabilidade individual (d). Depois disso, eles são combinados em uma desejabilidade
geral (D), usando a média geométrica. ODvaria de zero (0) a um (1), em que o valor 1
corresponde à resposta desejável [38]. Sob a condição operacional ótima, mais ensaios
foram realizados e os resultados observados foram comparados com os previstos pelo
modelo.

3.4. Análises químicas

3.4.1. Compostos fenólicos totais (TPC)
Essa determinação foi realizada com o reagente Folin-Ciocalteu (Imbralab, Ribeirao Preto,
Brasil) de acordo com o método descrito por Georgée outros [39]. Para as reações, 250µL de cada
extrato filtrado e devidamente diluído foram misturados com 1250µL de 10% (v/v) Folin-Ciocalteu
reagente e 1000µL de 7,5% (p/v) N / D2CO3solução. Em seguida, as amostras foram aquecidas a 50◦
C por 15 minutos e resfriado à temperatura ambiente em banho de gelo. A absorbância foi medida
a 760 nm. Uma curva de calibração foi criada a partir de um padrão de ácido gálico, que variou de
10 a 100 mg/L. O teor de TPC foi expresso em mg equivalente de ácido gálico por 100 g (mg GAE
100/g).

3.4.2. Compostos flavonoides totais (TFC)

O teor de TFC foi determinado com base no método descrito por Zhishen et al. [40] com
pequenas modificações. Aqui, 0,5 mL de extrato foi misturado com 3,2 mL de água ultrapura e 150
µL de NaNO2(5%). Após a homogeneização, a mistura foi deixada em repouso por 5 min. Depois
disso, 150µL de AlCl3(10%) foi adicionado à mistura e 1 mL de NaOH (1 M) foi adicionado após um
minuto. A absorbância foi registrada em 510 nm com um espectrofotômetro (Metash, Shanghai,
China) usando água ultrapura como branco. O teor de TFC foi calculado por meio da curva de
calibração da rutina, com concentração variando de 99 a 595 mg/L. Os resultados foram expressos
em mg de equivalentes de rutina por 100 g (RE/100 g).

3.4.3. ABTS•+Ensaio
A capacidade antioxidante foi determinada pelo método de redução do ABTS•+
radical (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) de acordo com Giao et al. [41]. Para as reações, 30µL
de cada extrato filtrado e devidamente diluído foram misturados com 3000µL ABTS•+
radical. Após 6 min, a absorbância foi medida a 734 nm com um espectrofotômetro em unidades
espectrofotométricas (Metash, Shanghai, China) usando água ultrapura como branco. A ABTS•+a
atividade antirradical foi calculada usando soluções Trolox (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) com
diferentes concentrações em uma faixa de 500–2000µmol. Os resultados foram expressos comoµ
equivalentes mol Trolox por grama (µmol TE/g).

3.4.4. DPPH•Ensaio
O DPPH•A atividade de eliminação de radicais (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) de
extratos foi determinada de acordo com o método descrito por Hidalgo, Sanchez-moreno
moléculas2022,27, 410 12 de 16

e Pascual-Teresa [42]. Para as reações, 100µL de cada extrato devidamente diluído foi adicionado a
2900µL de DPPH•solução (6×10−5M em metanol e diluído para uma absorbância de 0,700 a 517
nm). As soluções resultantes foram deixadas em repouso por 30 minutos no escuro à temperatura
ambiente. Depois disso, a absorbância foi medida em 517 nm com um espectrofotômetro (Metash,
Shanghai, China) usando metanol como branco. O DPPH•atividade de eliminação de radicais foi
calculada usando soluções Trolox com diferentes concentrações em uma faixa de 80-700µmol. Os
resultados foram expressos comoµmol Trolox (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) equivalentes por
grama (µmol TE/g).

3.4.5. Ensaio FRAP

Este ensaio foi realizado de acordo com Benzie e Strain [43] com ligeiras modificações.
As soluções estoque incluíam 300 mM de tampão acetato (pH 3,6), 10 mM TPTZ (Sigma-
Aldrich, Buchs, Suíça) em 40 mM de HCl e 20 mM de FeCl3·6H2O. A solução de trabalho foi
preparada misturando 25 mL do tampão acetato, 2,5 mL da solução TPTZ e 2,5 mL de FeCl3·
6H2O. 100µL de cada extrato reagiu com 3 mL de FRAP a 37◦C por 30 min. A absorbância foi
medida a 593 nm. O poder de capacidade redutora férrica foi calculado usando FeSO4·7H2
Soluções de O com diferentes concentrações em uma faixa de 150–1200µmol. Os resultados
foram expressos comoµmol Fe2+/g.

3.4.6. Análise UPLC-qTOF/MS

O extrato da amostra foi dissolvido em uma solução aquosa de ácido fórmico (0,1%,v/v) e
submetido a cromatografia líquida de ultra desempenho acoplada ao sistema de espectrometria de
massa quadrupolo/time-offlight (UPLC-qTOF/MS) da Bruker Daltonics (MaxisImpact, QTOf Bruker,
Bremen, Germany). A separação da amostra foi realizada em uma coluna Hypersil C18 (3µm tamanho de
partícula, 2,1 mm id×150 milímetros). A temperatura da coluna foi mantida a 40◦C. Uma alíquota de 20µL
da solução de extrato a 100 ppm foi injetado no equipamento com vazão de 0,27 mL/min. A eluição
gradiente linear de A (0,1% de ácido fórmico em água) e B (acetonitrila) foi aplicada com o seguinte
gradiente: 5% de B e, em seguida, aumentou linearmente para 9% de B em 5 min, depois 9% de B foi
aumentado para 16% dentro de 10 min, 16% B aumentou para 36% B dentro de 18 min, e 36% B
aumentou para 95% B dentro de 1 min, então mantendo esta concentração por 12 min. Em seguida, 95%
de B foi reduzido para 5% de B em 1 min e, finalmente, mantido dessa forma por 13 min. Análise de
dados (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) foi usada para interpretação dos dados. Os espectros de
massa (MS) foram adquiridos nos modos negativo e positivo com uma fonte de ionização por eletrospray
(ESI). Os dados foram digitalizados para cada amostra de teste de 50 a 1200m/z. Nitrogênio altamente
purificado (N2) foi usado como gás de nebulização e hélio ultra-puro (He) como gás de colisão. Em termos
de modo eletrospray negativo, a tensão capilar foi ajustada em 5000 V. Os parâmetros ESI aplicados
foram: gás seco: 200◦C; fluxo de gás seco: 8 L/min; nebulizador: 2 bar. Os dados adquiridos foram
convertidos para o formato mzML usando o software MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/
(acessado em 10 de dezembro de 2021)) e submetido à Global Natural Products Social Molecular Network
(GNPS [44];http://gnps.ucsd.edu(acessado em 10 de dezembro de 2021)) sistema online. Os cálculos de
rede molecular e correspondência de banco de dados foram construídos usando 2,0 Da como tolerância
de massa de íon precursor e 0,05 Da como tolerância de massa de íon fragmento, 0,7 como pontuação
mínima de cosseno e 3 como íons de fragmento mínimos combinados para ligação de borda. Finalmente,
os dados GNPS foram importados e visualizados usando o software Cystoscope (versão 3.8.0) para
encontrar as porções das sub-redes.

3.5. Estudos Biológicos In Vitro

Microrganismos e condições de cultura Gram-negativas (Acinetobacter baumanniiATCC
19606,Escherichia coliATCC 25922,Klebsiella pneumoniaeATCC 13883, ePseudomonas
aeruginosaATCC 27853) e Gram-positivos (Staphylococcus aureusATCC 29213,Staphylococcus
epidermidisATCC 12228 eBacillus subtilis168 LMD 74.6) foram cultivadas em ágar Mueller-
Hinton (Difco, Franklin Lakes, NJ, EUA) por 24 h a 35±2◦C. As leveduras
moléculas2022,27, 410 13 de 16

Candida albicansATCC 90028 eCandida tropicalisATCC 750 foram cultivados em ágar

Sabouraud dextrose (Difco, Franklin Lakes, NJ, EUA) por 24 h a 35±2◦C.

3.5.1. Ensaios antimicrobianos

Para esses ensaios, o extrato otimizado foi evaporado em rotavapor sob pressão
reduzida para eliminar o etanol. Em seguida, o extrato concentrado otimizado apresentou
teor de TPC igual a 0,965 mg GAE/mL. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de
microdiluição em caldo em placas de poliestireno de 96 poços, padronizadas conforme
documento M07-A9 (para ensaios bacterianos) e M27-A3 (para ensaios fúngicos). A
concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada por inspeção visual após incubação a
37◦C por 24 h de extratos nas concentrações finais de 0,03, 0,06, 0,12 e 0,24 mg GAE/mL. Para
determinar a concentração bactericida e fungicida mínima (MBC e MFC), 10µL dos poços que
não tiveram crescimento microbiano visível foram inoculados em meio de cultura Mueller-
Hinton e Sabouraud Dextrose Agar por 24 h a 37◦C. O MBC e o MFC foram considerados a
menor concentração capaz de inibir completamente o crescimento microbiano na superfície
do ágar.

3.5.2. Ensaio para inibição de α-amilase

O ensaio de inibição para α-amilase foi realizado conforme relatado por Meng et al. [45] com
pequenas modificações. Resumidamente, 100µL de extrato evaporado em rotavapor sob pressão
reduzida para eliminar o etanol em diferentes diluições, foi misturado com solução de α-amilase
(100µL, 1,0 U/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em tampão fosfato (pH 6,9) e 250µL de
solução de amido a 1%. A incubação foi realizada por 5 minutos a 37◦C. A reação enzimática foi
interrompida pela adição de reagente de ácido dinitrosalicílico (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Alemanha) (250µL) e a incubação foi realizada por 15 minutos em água fervente. Para diluição, 2
mL de água destilada foram adicionados à mistura de reação final. A absorbância foi lida a 540 nm.
O efeito inibitório foi calculado pela Equação (1). Os resultados foram expressos como IC50(mg
GAE/mL). Acarbose (Supelco, Laramie, WY, EUA) foi usada como controle positivo para comparar os
efeitos inibitórios.

Porcentagem de inibição (%) = [1−(Abdômenamostra−Abdômencontrole-1)/Abdômencontrole-2]×100 (1)

onde o abscontrole-1é o resultado da reação sem adição de enzima, que foi substituída por
solução tampão, enquanto a mistura de enzima e solução de amido sem extrato foi
Abdômencontrole-2.

3.6. Análise estatística

Todas as medições foram realizadas em triplicata e os resultados foram analisados usando o
software Statistic 13 (Dell Inc.) [46]. Os dados do planejamento experimental foram analisados por RSM,
usando a equação polinomial de segunda ordem. Análise de variância (ANOVA), teste de falta de ajuste e
coeficiente de determinação (R2) foram usados para verificar a significância do modelo. A função
desejabilidade foi aplicada para determinar os parâmetros operacionais de extração que poderiam
melhorar a recuperação de compostos bioativos da casca do umbu. Um nível de significância de 5% foi
empregado para todas as análises.

4. Conclusões
A recuperação dos compostos bioativos da casca do umbu foi influenciada principalmente
pelo percentual de etanol da solução extrativa e pela temperatura de extração. Sistemas de
solventes binários menos apolares e alta temperatura forneceram extratos ricos em compostos
bioativos. As condições operacionais ótimas para recuperar esses compostos foram 74◦C, 37% de
etanol como solvente e uma relação sólido-líquido de 1:38. Quinze compostos foram identificados
no extrato otimizado, compostos principalmente por ácidos fenólicos e flavonoides. Este extrato
apresentou atividade antioxidante e antimicrobiana, principalmente ação antibacteriana, e foi
capaz de inibir a enzima α-amilase. Assim, este estudo permitiu a identificao de
moléculas2022,27, 410 14 de 16

condições operacionais ótimas para obtenção de um extrato rico em bioativos da casca do umbu,
resíduo do processamento dessa fruta nativa do Brasil.

Contribuições do autor:Conceituação, LdOR e CNK.; metodologia, LdOR e EPJ; análise formal,

BPdF, LdOR, HFF e CMAL; investigação, BPdF, DdLM e LdOR.; recursos, LdOR e EPJ; curadoria de
dados, LdOR, ALSdS, DdLM e BSdA; preparação de redação original, LdOR e BPdF; redação—
revisão e edição, CNK, EPJ, ALSdS e DdLM; supervisão, CNK e EPJ Todos os autores leram e
concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado:Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:Os dados estão contidos no artigo.

Agradecimentos:Os autores agradecem o apoio do Instituto Nacional de Tecnologia (INT), Universidade

Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científicose euco e Tecnológico
(CNPq), Fundaçãoao de AmparoaPesquisa no Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenaçao de
Aperfeiçoamento de Pessoal de NeuNível Superior (CAPES).

Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências
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