UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO

PARANÁ - CAMPUS TOLEDO

Centro de Engenharias e Ciências Exatas

Curso de Engenharia Química

Brenda Souza
Bianca Riva
Emanuelly Sulzbacher
Maria Julia Takaki Arroyo

PRÁTICAS 1 A 4

Trabalho apresentado referente a

nota parcial da disciplina de
Microbiologia Industrial
representada pela Prof. Me.
Jacqueline Ferandin Honório.

ANO LETIVO 2018

Sumário
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 3
1.1 APRENDIZADO SOBRE CONDUTA GERAL NO LABORATÓRIO................................................... 3
1.2 SOBRE AS PARTES DE UM MICROSCÓPIO E COMO TRABALHAR COM O EQUIPAMENTO ................. 5
1.3 TERMOS, TÉCNICAS E PROCESSOS DE ASSEPSIAS .............................................................. 10

2 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................... 14
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 19
3.1 VISUALIZAÇAO DOS MICRORGANISMOS NO MICROSCÓPIO................................................. 21
3.2 RESULTADOS DO PROCESSO DE COLORAÇÃO EM CADA MICRORGANISMO .............................. 22
4 CONCLUSÃO............................................................................................................. 26
5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 27

2
1 INTRODUÇÃO

Laboratórios com utilização em universidades são de alto ganho técnico,

prático e intelectual para o aluno, porém sem equipamentos e condutas adequadas
eles podem vir a ter um alto teor de risco, visto que, os laboratórios são lugares que
necessitam de alto cuidado. Em laboratórios de microbiologia, especialmente, o
cuidado com os equipamentos, a conduta dentro do laboratório e o manuseio dos
objetos de estudo a atenção e o cuidado devem ser redobrados, visto que,
geralmente, se trabalha com microrganismos que podem ser patológicos ao ser
humano.
As práticas de 1 a 4 visaram introduzir conceitos comumente utilizados no
universo da microbiologia, preparar o aluno a se portar no ambiente laboratorial,
preparar corretamente o local do experimento, bem como a aprender o manuseio
correto de microscópios e a observar bactérias e leveduras nestes microscópios
por meio de coloração Gram. Nas prática 1 e 2, objetivou-se conhecer as condutas
e normas aplicadas em um laboratório de microbiologia, tendo como ênfase o modo
de realização da assepsia tanto do ambiente quanto do operador e compreender a
diferença entre os termos referentes à limpeza e assepsia. Para a prática 3, seu
objetivo foi conhecer as partes ópticas e mecânicas do microscópio óptico e como
manuseá-lo corretamente. Por fim, para a prática 4, o objetivo foi a execução da
técnica da coloração de Gram e posteriormente a compreensão da importância do
teste e da aplicação deste. Além disso, o procedimento torna possível relacionar a
composição química da parede celular das bactérias com corantes, bem como a
descrição das suas formas e arranjos.

1.1 APRENDIZADO SOBRE CONDUTA GERAL NO LABORATÓRIO

Para minimizar ou evitar os riscos oferecidos por uma conduta laboratorial

erronia, técnicas foram elaboradas para aprimorar o comportamento do
instrumentador dentro deste local de trabalho. Ao relacionar o operador com a
manipulação de materiais no ambiente laboratorial, entra em ação o termo
conhecido como contenção, tendo o objetivo de reduzir ou eliminar a exposição de
equipes de um laboratório, meio ambiente e outras pessoas em geral a agentes
que possam apresentar algum risco. Segundo SALVATORI et al. (2013), este

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termo se divide em contenção primária e secundária, em que a contenção primária
enfoca a proteção da equipe do laboratório e do meio de trabalho contra a
exposição aos agentes infecciosos, é proporcionada por uma boa técnica de
microbiologia e pelo uso de um equipamento de segurança adequado. A contenção
secundária diz que a proteção do meio ambiente externo ao laboratório contra a
exposição aos materiais infecciosos, é proporcionada pela combinação de um
projeto das instalações e das práticas operacionais.
Já para a prevenção de riscos nas atividades tem-se a biossegurança, a qual
tem como definição um conjunto de medidas ou ações voltadas para a prevenção,
controle, minimização ou eliminação dos riscos presentes nas atividades de
pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços
que podem comprometer a saúde do homem, dos animais, a preservação do meio
ambiente e/ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos (UNIFESP, 2013).
As normas de Biossegurança são divididas em quatro níveis, sendo maior o
nível quanto maior o grau de contenção e complexidade. O nível é determinado
segundo o organismo de maior classe de risco envolvido no processo. O primeiro
nível de segurança, ou NB-1 é adequado ao trabalho que envolva agente com o
menor grau de risco para o pessoal do laboratório e para o meio ambiente. O
trabalho é conduzido, em geral, em bancada. Os equipamentos de contenção
específicos não são exigidos. O pessoal de laboratório deverá ter treinamento
específico nos procedimentos realizados no laboratório e deverão ser
supervisionados por cientista com treinamento em Microbiologia ou ciência
correlata. O nível de biossegurança dois, NB-2, é adequado ao trabalho que
envolva agentes de risco moderado para as pessoas e para o meio ambiente, é
muito semelhante ao NB-1, diferindo apenas no treinamento técnico do pessoal de
laboratório, o acesso ao mesmo deve ser limitado e Determinados procedimentos
nos quais exista possibilidade de formação de aerossóis infecciosos devem ser
conduzidos em cabines de segurança biológica ou outro equipamento de contenção
física (UNIFESP, 2013).
Já o nível de biossegurança três, NB-3, é aplicável aos locais onde forem
desenvolvidos trabalhos com OGM (organismos geneticamente modificados)
resultantes de agentes infecciosos Classe 3, que possam causar doenças sérias e
potencialmente letais, como resultado de exposição por inalação. Por fim, tem-se o
nível 4, NB-4, este nível deve ser usado sempre que o trabalho envolver OGM

4
resultante de organismo receptor ou parental classificado como classe de risco 4
ou sempre que envolver organismo receptor, parental ou doador com potencial
patogênico desconhecido (UNIFESP, 2013).
Além destes termos de grande importância, as normas de segurança básicas
como o uso de jaleco, se tornam essenciais pois previnem inúmeros tipos de
contaminação, por isso, a aplicação destes termos, faz com que o convívio
laboratorial se torne mais seguro e menos propenso a acidentes.

1.2 SOBRE AS PARTES DE UM MICROSCÓPIO E COMO TRABALHAR

COM O EQUIPAMENTO

O microscópio é um instrumento utilizado para ampliar e observar estruturas

pequenas dificilmente visíveis ou invisíveis a olho nú. Este equipamento possibilita
o aumento de imagens através da luz que, após incidir sobre a amostra, passa por
um conjunto de lentes objetivas (que formam e aumentam a imagem) e oculares
(que aumentam a imagem).
O aparelho é constituído basicamente por uma parte mecânica que serve de
suporte e uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador,
as objetivas e as oculares. Nos microscópios de luz, as lentes que ficam mais
próximas aos olhos do observador, durante a análise de uma amostra, são as lentes
oculares. Esta lente aumenta a imagem do objeto após o aumento já proporcionado
pela objetiva. É através dela que o observador vê a imagem do objeto (daí o nome
ocular, uma vez que o olho do observador está colocado à frente dela). Toda ocular
traz gravado o número de aumentos que proporciona. Para saber-se em que
aumento um objeto pode ser visto ao microscópio, basta multiplicar o número do
aumento dado pela objetiva pelo número do aumento dado pela ocular. Por
exemplo, se a objetiva usada aumenta 5X e a ocular aumenta 10X, o objeto está
sendo observado com um aumento total de 50X.
A Lente objetiva permite a ampliação da imagem de um objeto qualquer.
Pode também corrigir os defeitos das cores dos raios luminosos. Para se utilizar a
objetiva (100x) de imersão, coloca-se entre ela e a lamínula uma gota de óleo de
cedro ou de imersão. Este sistema permite um maior aproveitamento da quantidade
de luz com maior ampliação, pois com esse processo, captam-se os feixes

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luminosos que com as objetivas secas são desviados. Os aumentos fornecidos
pelas objetivas encontram-se gravados nas mesmas.
O Condensador ou diafragma, localiza-se abaixo da platina cuja função
principal é o fornecimento de uma grande quantidade de luz. Ao utilizar as objetivas
de pequeno aumento, o diafragma deve ser fechado para eliminar os raios laterais.
Em maiores ampliações, abre-se proporcionalmente o diafragma. Logo, o
diafragma associado à fonte luminosa regula a quantidade de luz que incide na
lente condensadora.

Figura 1- Estrutura de um microscópio óptico

Por fim, a parte mecânica do microscópio é composta pelas seguintes

estruturas:
• Base, dada como o suporte do microscópio, peça que sustenta todas
as outras, feito de ligas de metais pesados;
• Braço ou estativa, que representa a peça que liga a base até a parte
superior do microscópio, que sustenta os tubos, a mesa, o porta-condensador e os
parafusos micro e macrométrico;
• A Platina, uma placa de metal com um orifício no centro, por onde
passam os raios luminosos. A lâmina com o material a ser observado é colocada
sobre a platina que apresenta uma abertura no seu centro permitindo a passagem
dos raios luminosos, coletados pelo espelho. Estes são convergidos pelo

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condensador e pelo diafragma, passando pelo material que está na lâmina, pela
lente objetiva do tubo e da ocular até atingir a retina do globo ocular do observador;
• Revólver, peça encontrada abaixo do canhão na qual se inserem as
lentes objetivas. É dotado de um movimento de rotação que permite posicionar a
objetiva desejada para a observação do material a ser analisado. Este movimento
deve ocorrer sempre no sentido da objetiva de menor para a de maior aumento;
• Canhão, a parte mais superior do microscópio, contém um conjunto
de espelhos que projetam a imagem em direção às oculares nele encaixadas;
• Charriot, localizado acessória e superficialmente à platina, é formado
por uma presilha, dois botões giratórios e dois trilhos que têm a função de
movimentar a lâmina no plano e assim permitir a observação de toda a sua área
desejada.
• Parafusos micrômetro e macrômetro, responsáveis pela focalização.
O Parafuso micrométrico permite uma focalização mais limitada e mais fina, pois o
tubo desloca no máximo dois milésimos de milímetro, e o Parafuso macrométrico o
permite uma focalização grosseira do material. Possui um percurso vertical com
cerca de 7,5 cm.
A microscopia de campo claro é amplamente utilizada para análise de
materiais biológicos ou de outra natureza devido ao seu bom limite de resolução.
Esse limite de resolução é definido como a capacidade de uma lente separar
nitidamente as imagens de dois pontos muito próximos. Na prática, o poder de
resolução é a menor distância que pode existir entre dois pontos para que
apareçam individualizados. Assim, quanto menor for o limite de resolução da
objetiva, maior será o respectivo poder de resolução.
O limite de resolução (LR) do microscópio de luz depende do comprimento
de onda (λ) da radiação utilizada e da abertura numérica (a.n.) da objetiva, dado
pela seguinte equação:
𝐾 (1)
𝐿. 𝑅 = 𝜆.
𝑎. 𝑛
Em que: K é uma constante (0,61); λ é comprimento de onda da luz (na faixa
do verde - amarelo) e a.n. é a abertura numérica, que corresponde a medida da
capacidade de uma lente para receber informação (luz) de um objeto, e é definida
pela equação: a.n.= n.sen θ, onde n é o índice de refração do meio entre o objeto
e a objetiva (n=1 para o ar, n=1,33 para a água e n=1,5 para o vidro e para o óleo

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de imersão), e onde θ é o semiângulo de abertura, formado pelo eixo óptico e os
raios externos do feixe de luz que penetram na objetiva. Os microscópios ópticos
têm um limite de resolução da ordem de 0,2 µm, ou seja, as lentes destes
microscópios conseguem mostrar dois pontos distintos se estes estiverem
separados por distâncias de pelo menos 0,2 µm.
A microscopia óptica se refere ao uso de qualquer tipo de microscópio que
use luz para observação de espécimes. Existem vários tipos de microscopia óptica,
como:
• Campo escuro: A técnica faz uso de um tipo especial de condensador,
capaz de fazer com que somente os raios luminosos que atingirem um objeto na
lâmina entrem na objetiva. A luz que passar por onde só material transparente será
refletida, enquanto que a luz que atingir um corpo ou objeto sofrerá uma dispersão
por reflexão e refração, fazendo com que a luz incida sobre o objeto e entre na
objetiva. O objeto aparecerá iluminado e o fundo escuro.
• Confocal: Técnica utilizada para aumentar o contraste da imagem
microscópica e construir imagens tridimensionais através da utilização de um
orifício de abertura, pinhole, que permite uma grande definição de imagem em
amostras mais espessas que o plano focal. Utiliza um único fóton para iluminar o
plano amostral de cada vez.
• Fluorescência: É uma variação do microscópio de luz ultravioleta no qual
os objetos são iluminados por raios de um determinado comprimento de onda,
levando a emissão de luz de compostos fluorescentes. A imagem observada é o
resultado da radiação eletromagnética emitida pelas moléculas que absorveram a
excitação primária e emitiram uma luz com maior comprimento de onda.
• Confocal com varredura a laser: A amostra é varrida por um feixe de
elétrons que é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas refletoras que
o fazem percorrer o espécime ponto a ponto e ao longo de linhas paralelas. Ao
atingirem o espécime, os elétrons causam diversos efeitos. Emitem elétrons
secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um sistema de amplificação
e são transformados em pontos de mais ou menos luminosidade, gerando uma
imagem tridimensional.
Uma das aplicações da microscopia de campo claro é a análise de células
em cultivo, com os microscópios invertidos. O microscópio invertido segue o

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mesmo princípio de operação do microscópio óptico convencional, mas com a
particularidade de ser montado de maneira totalmente oposta.
O revólver e as objetivas estão montados abaixo da platina; a fonte luminosa
e a lente condensadora se encontram acima da platina, o que gera um grande
espaço entre a fonte luminosa e as objetivas. Logo, em microscópios invertidos, a
luz vem de cima do palco e o objetivo está abaixo dela, permitindo observar as
amostras localizadas no fundo de um recipiente. Isso é muito útil para manter as
amostras hidratadas e permite observações que não são possíveis com
microscópios convencionais.
Entre outros métodos de análises, temos a avaliação da contaminação em
amostras de caldos primária e mista, vinho (em fermentação ou no final de
fermentação) e levedo tratado ou não, a partir da contagem direta ao microscópio
óptico de bastonetes. Para esse tipo de experimento, as amostras de vinho e de
levedo devem ser previamente diluídas para que a visualização ao microscópio não
apresente mais que 3 a 5 bastonetes por campo, e misturadas em partes iguais
com corante azul de metileno/sulfato azul de nilo em um tubo de ensaio e depois
homogeneizá-los. Com essa mistura pronta, coloca-se 0,003 ml sobre uma lâmina
de vidro e observa-se ao microscópio óptico com a objetiva de imersão (100x),
fazendo a contagem dos bastonetes não corados (vivos). As células viáveis
aparecerão incolores e as não viáveis coloridas de azul intenso.
Outro tipo de análise que pode ser feito é a identificação de micotoxinas em
alimentos como, silagens e pão. As micotoxinas são substâncias tóxicas resultantes
do metabolismo secundário de diversas linhagens de fungos filamentosos. A
doença que resulta da ingestão de micotoxinas é denominada micotoxicose e a
mesma pode causar vários danos ao organismo animal, bem como em humanos,
afetando funções de crescimento do organismo e o desenvolvimento de tumores,
podendo ser letal. Para este experimento, coletou-se quatro amostras
representativas de um silo de silagem e amostras de pão de sanduiche, as
amostras foram semeadas em placas de petri no meio de cultura específico para
fungos – Agar Sabouraud, em seguida as mesmas foram incubadas em estufa
microbiológica na temperatura de 25°C por três dias. Posteriormente, retirou-se
uma pequena parte do micélio de cada fungo, que foram colocados sobre uma
lâmina com duas gotas da solução a 1% de azul de lactofenol, e observadas em

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microscópio óptico com magnitude de 400x, para identificar as micotoxinas, as
quais foram extraídas para posterior análise.
E, por fim, outra técnica conhecida é a análise microbiológica voltada à
garantia da segurança dos alimentos, como leite e seus derivados, ovos, carnes e
derivados. Entre os agentes causais mais envolvidos estão Staphylococcus aureus,
Salmonella spp. e Escherichia coli. No experimento proposto por Flávia Sarkis,
avaliou-se as condições microbiológicas das carnes de capivara, cateto e javali in
natura comercializadas no Brasil. Para a contagem presuntiva de Staphylococcus
aureus, foi utilizado o método de contagem direta em placas, com um microscópio
estereoscópico e contadas as colônias típicas de S.aureus: pretas, brilhantes,
circulares lisas, convexa e com halo ao redor. Para confirmação foram selecionadas
algumas colônias típicas para teste de Gram, catalase, coagulade e Staphy-Test.

1.3 TERMOS, TÉCNICAS E PROCESSOS DE ASSEPSIAS

É comum empregar no dia-a-dia os termos assepsia, antisséptico,

esterilização, limpeza, sanitização, desinfetantes, germicidas e entre outros como
sinônimos porque todos tem a finalidade de “limpar” um ambiente. Entretanto, estes
e outros termos que dão ideia de limpeza possuem significados diferentes, e o
emprego equivocado acaba acontecendo por não se saber especificamente a
finalidade de cada produto sobre os microrganismos. Cada tipo de limpeza e seu
termo correto possui determinada finalidade e é empregado de acordo com o
ambiente em questão e o nível em que se é aceito existir ou microrganismos.
De acordo com a ANVISA, assepsia é o conjunto de medidas adotadas que
visam a redução ou impedem a entrada de agentes patogênicos (microrganismos)
em superfícies em níveis seguros, e antissepsia é a operação que visa a redução
de microrganismos presentes na pele em níveis seguros, mediante o uso de
agentes anti-sépticos.
Destruir todas as formas de vida microbiana (vírus, bactérias, esporos,
fungos e protozoários), incapacitando a reprodução destes organismos e, assim,
causando morte microbiana, pode ser caracterizado como esterilização. Para este
procedimento usa-se agentes físicos (calor) como estufas e autoclaves, ou
químicos (soluções esterilizantes) como formaldeído e glutaraldeído. Em
contrapartida, os esterilizantes germicidas são produtos de ação letal

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especialmente sobre microrganismos patogênicos (germes). Este tipo de
esterilizante tem a capacidade de destruir os esporos produzidos pelos agentes
patogênicos.
Em relação à limpeza de ambientes comuns no dia-a-dia como casas,
banheiros, salas, corredores de escolas, entre outros, os termos mais apropriados
a se utilizar seriam a sanitização, desinfecção e a limpeza, propriamente dita. A
sanitização se caracteriza por utilizar um agente químico para reduzir a população
microbiana até atingir níveis compatíveis com as normas de saúde. Os
desinfetantes são definidos como substâncias químicas ou produtos capazes de
deter ou inibir a proliferação de microrganismos patogênicos em ambientes e
superfícies à temperatura ambiente. Por fim, a limpeza é a remoção de sujidades
que antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização.
Dois outros termos geralmente utilizados para se referir à limpeza de um
ambiente ou lugar, porém mais empregados no universo laboratorial, são a
degermação e a fumigação. O primeiro termo é definido como como uma medida
para reduzir ou remover parcialmente os microrganismos da pele ou outros tecidos
por meio de métodos químicos, como a utilização de anti-sépticos degermantes, e
físicos, como a higienização das mãos e antebraços. Já a fumigação se caracteriza
por tratamento com agente químico, em estado gasoso, que atinge a totalidade de
um produto a ser tratado fitossanitáriamente a fim de evitar a disseminação de
pragas em operações de transporte de cargas. Em relação à materiais orgânicos,
tem-se ainda o termo biocida. De acordo com o dicionário Dicio, biocida é um tipo
de conservante que impede o ataque de fungos e bactérias aos materiais
orgânicos.
Muitos microrganismos possuem técnicas de sobrevivência que os permite
resistir no ambiente se a técnica de limpeza adequada não for empregada. As
bactérias, por exemplo, produzem esporos bacterianos (endósporo) que são
estruturas resistentes, dormentes e não reprodutivas produzidas. Este mecanismo
é realizado a fim de garantir a sobrevivência do microrganismo por períodos
desfavoráveis. Para assegurar a limpeza total quando necessária e que nenhum
tipo de esporo ou microrganismo continue residindo no ambiente, existem, então,
métodos de esterilização e procedimentos de assepsia e antissepsia que podem
ser empregados nos laboratórios, por exemplo.

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 A flambagem é um método de esterilização usado para evitar que as culturas
nas alças e agulhas microbiológicas se espalhem ao se aquecer gradualmente a
ponta da alça utilizada para o esfregaço. O procedimento se dá posicionando-se a
ponta a alça na região azul da chama do bico de Bunsen (região mais fria da
chama). Deve-se arrastar a alça para cima lentamente até a região mais quente da
chama (imediatamente acima da região azul) e manter na posição até que a alça
fique vermelha, garantindo que todo o comprimento da alça receba o aquecimento
adequado. Depois de resfriado, a alça pode ser usada imediatamente e não deve
ser colocada em contato com a superfície ou agitada. A re-esterilização da alça
deve ser feita imediatamente após seu uso.
O bico de Bunsen é amplamente utilizado em laboratórios e em laboratórios
de microbiologia, especialmente, este é utilizado com o objetivo de esterilizar
materiais por meio da flambagem, conforme descrito anteriormente, e ainda para
aquecimento de superfícies ou como fonte de calor para aquecer recipientes. O
equipamento possui uma região de segurança que garante a diminuição de
microrganismos em um raio de aproximadamente 10cm em seu entorno devido ao
calor fornecido pela chama. A zona de segurança propicia um ambiente asséptico
ao redor do material e do raio que a chama alcança, diminuindo o risco de
contaminação por aspiração ou contato com microrganismos.
Já os procedimentos que visam a assepsia e antissepsia são realizados
fazendo-se a limpeza e desinfecção do ambiente em que se irá trabalhar com
solução desinfetante própria e o ambiente deve permanecer limpo e organizado
durante o decorrer de seu uso. A antissepsia das mãos ocorre sempre antes e
depois do manuseio com os materiais. Alças, agulhas e a bancada devem ser
esterilizadas antes e depois de sua utilização, a fim de evitar a criação de aerossóis.
Os dois primeiros materiais podem ser esterilizados ao se aquecer a ponta de suas
bases e a bancada esterilizada com álcool 70%, por exemplo. Para os frascos e
tubos, as bocas devem ser flambadas no início e fim de seu uso.
Analisando situações cotidianas ou industriais, pode-se notar que o
emprego de técnicas de assepsia, antissepsia e flambagem se fazem presentes
nestes meios. Ao se lidar armazenar alimentos em casa ou no recebimento de
matérias-primas alimentícias em uma indústria é essencial que se apliquem
técnicas de assepsia para evitar que haja a contaminação de microrganismos nos
alimentos e, assim, que ocorra alguma intoxicação. Em berçários de recém-

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nascidos ou na realização de algum tipo de cirurgia a antissepsia das mãos e
antebraços, feita por quem irá entrar em contato com uma pessoa, deve ser
realizada para evitar que não ocorra a contaminação por nenhum tipo de
microrganismo. A flambagem de facas antes de se cortar algum alimento ou ainda
a flambagem de agulhas de costura para se furar espinhas são exemplos do uso
de uma técnica de esterilização presentes no cotidiano e que muitas vezes são
feitos inconscientemente.

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2 MATERIAIS E MÉTODOS

Os materiais utilizados para a realização das práticas foram:

Tabela 1- Materiais requeridos para o procedimento.

Materiais utilizados
Solução de álcool e areia Lugol
Lâminas Álcool 70%
Alças e agulhas Água
Corantes de cristal de violeta Óleo de cedro (óleo de imersão)
Corante Fucsina Microscópio óptico
Bico de Bunsen Solução salina (0,9%)
Culturas bacterianas em meio líquido e Sólido Culturas de bactérias e leveduras

Antes de se iniciar a prática, procedimentos de limpeza e desinfecção foram

adotados para uma boa assepsia do local a ser trabalho. Estes procedimentos
consistem em vários métodos relacionados as bancadas, operadores e limpeza das
vidrarias e materiais utilizados. O uso de álcool 70% se faz essencial durante todo
o processo da prática, sendo utilizado pelos operadores para a limpeza das
bancadas e mãos. É importante ressaltar que os operadores deveriam estar
vestidos de jalecos e aqueles que possuíssem cabelo comprido deveriam prendê-
los.
Após a realização dos os procedimentos de assepsia da bancada, iniciou-se
o preparo das colônias de microrganismos que iriam ser analisadas no microscópio
óptico. Para isto, determinou-se que somente um operador iria realizar o preparo
da placa para cada microrganismo, sendo este preparo realizado sempre dentro da
área de segurança do bico de Bunsen. Para os três microrganismos Escherichia
Coli, Staphylococcus aureus e Saccharomyces as mesmas etapas e procedimentos
foram seguidos. Deste modo, esterilizou-se previamente a alça bacteriológica em
uma solução de álcool e areia e, em seguida, a alça foi flambada na área de chama
fria do bico de Bunsen, reinserida na solução de álcool e areia e flambada
novamente. Após essas etapas, esfregou-se a alça na colônia escolhida para a vez
e transferiu-se a alçada da colônia para uma lâmina. Nessa etapa faz-se necessário
observar que em cada placa deverá conter apenas uma colônia ou alçada na

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lâmina, tendo em vista que o inóculo não deve ser muito carregado. O esfregaço
da colônia garantiu que toda a superfície propícia da lâmina recebesse a colônia do
microrganismo. No caso da coleta da colônia é preciso realizar a diluição com salina
estéril 0,9% na lâmina de modo a evitar que o esfregaço fique muito concentrado e
posteriormente a visualização no microscópio seja difícil. Passou-se, então, a
lâmina preparada sobre a chama do bico de Bunsen até que esta ficasse seca, a
fim de fixar o esfregaço na lâmina e evitar que ele se perdesse durante as etapas
de lavagem com os corantes, água e álcool. Depois de realizado o esfregaço, a
alça foi esterilizada pelo mesmo método descrito anteriormente.
É importante salientar que a etapa de lavagem é fundamental para que a
próxima substância a ser utilizada não interfira na anterior, por isso no caso dos
corantes a lavagem deve ser realizada até que não saia mais corante da lâmina, o
mesmo vale para o álcool. Após o fim dessa etapa, deve-se secar suavemente a
lâmina e observar estas com o auxílio do microscópio na objetiva de imersão e com
o óleo de cedro/mineral, visando identificar as células coradas.
Em relação à prática, foi-se utilizado culturas de bactérias (Escherichia Coli,
Staphylococcus aureus) e levedura (Saccharomyces) previamente preparadas e
disponibilizadas quando estas já se apresentavam bem cultivadas. No caso de ser
necessário que o grupo prepare as culturas deve-se utilizar incubadora de fungos,
a qual é de uso exclusivo para o cultivo de bactérias e leveduras. Para a utilização
da incubadora para fungos necessita-se do seguinte processo para o
funcionamento: acionar o interruptor geral e deixar os componentes eletrônicos
estabilizarem por 5 minutos, lembrando sempre que o mesmo não pode ser ligado
e desligado em intervalos inferiores a 3 minutos. Selecionar a temperatura
desejada. A lâmpada piloto, ao apagar, indica que a temperatura de
termostatização foi atingida e, após isto, iniciam-se os ciclos de liga-desliga, para
manutenção da temperatura desejada. Aguardar a estabilização da temperatura +/-
30 minutos (SALVATORI et al., 2013). Em caso de necessidade de movimentação
do aparelho, esperar 30 minutos antes de religá-lo. Não abrir a porta
frequentemente para evitar a condensação dentro da câmara interna. Para evitar
problemas com a estabilização da temperatura, manter o interruptor ligado
constantemente. A temperatura é depende da metodologia empregada. O limite de
tolerância fica em ± 1 °C, e a limpeza deve ser realizada semanalmente (limpar com
uma esponja, água e detergente neutro e retirar todo o resíduo de espuma com um

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pano enxaguado em água limpa). Para a desinfecção, passar um pano umedecido
em álcool 70%.
Com a lâmina preparada, a próxima etapa é a de coloração, na qual
primeiramente deve-se cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta por
aproximadamente um minuto e em seguida esse deve ser lavado em água corrente
com o pissete. O mesmo procedimento deve ser repetido analogamente para o
lugol fraco, álcool absoluto e fucsina, respeitando respectivamente os seguintes
tempos: um minuto, quinze segundos e 30 segundos.
A etapa final é a de observação em microscópio óptico. Posicionou-se a
lâmina com a cultura colorida no microscópio, pingou-se uma ou duas gotas de óleo
de imersão, ligou-se o aparelho e ajustou-se as objetivas que melhor possibilitavam
a visualização dos microrganismos. Para que se tenha a quantidade de luz ideal
para fotografar o objeto de estudo, é preciso seguir alguns passos, os quais foram
desenvolvidos por August Köhler em 1893 e é geralmente chamado de “Iluminação
de Köhler”.
1. Abra completamente a Íris da Fonte de Luz e o Diafragma do
Condensador.
2. Ligue a Fonte de Luz e ajuste a Intensidade da Iluminação para cerca de
70%.
3. Abaixe completamente a platina utilizando os parafusos macrométrico e
micrométrico.
4. Coloque a objetiva de 4x no caminho da luz.
5. Insira a lâmina já preparada e com lamínula.
6. Ajuste o foco para que fique na margem da lamínula.
7. Abaixe completamente o Condensador (utilize o Parafuso Regulador de
altura do Condensador)
8. Feche completamente a Íris da Fonte de Luz.
9. Eleve o Condensador lentamente até que a margem da Íris esteja
completamente resolvida na imagem – você deve conseguir ver toda a
luz passando por um pequeno polígono.
10. Centralize este polígono usando os parafusos de centralização do
Condensador.
11. Abra a Íris somente até a margem poligonal sair do campo de visão.

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 12. Finalmente, feche o Diafragma do Condensador para aumentar o
contraste na amostra. O exato grau de fechamento do diafragma deve
ser determinado experimentalmente.
13. Ajustes finais na intensidade da luz e diafragma devem ser feitos
visualizando o espécime.
Em cada objetiva há inscrições sobre a quantidade de luz requerida e essa
quantidade deve ser ajustada no condensador a cada vez que trocar de objetiva,
repetindo os passos de 6 a 12.
Depois da visualização, as objetivas foram limpas com papel filtro macio para
não riscar a lente, embebido numa mistura de etanol e éter, e tomando cuidado
para não inundar a lente.
Ao finalizar a prática fez-se uso dos procedimentos de descarte dos materiais
utilizados, sendo este diferenciado em quatro tipos: descarte de amostras, de
materiais não reutilizáveis, materiais tóxicos e vidrarias quebradas. O descarte que
ficou responsável aos operados da prática foi o dos papéis que envolviam os swabs
e o destino dos swabs à solução de hipoclorito de sódio disponível no laboratório.
A lavagem das vidrarias utilizadas também ficou designada aos operadores. Após
o uso, depositou-se o material em soluções de hipoclorito de sódio e sabão por 24
horas, e posteriormente devem ser lavadas com água, detergente e esponja afim
de retirar todos os resíduos de seu interior.
. O descarte de amostras, materiais não reutilizáveis, materiais tóxicos e
vidrarias que foram quebradas ficaram sob responsabilidade do professor e do
coordenador do laboratório, em que, para o primeiro, faz-se o armazenamento das
amostras processadas em sacos adequados e destinados à esterilização em
autoclave a 121 ±1ºC por 20 minutos. Posteriormente o material é encaminhado
ao destino estabelecido para lixo orgânico na Instituição. As alíquotas de amostras
utilizadas para as diluições nos processos analíticos são autoclavadas da mesma
forma e encaminhadas ao lixo orgânico da Instituição. (SALVATORI et al., 2013)
Para os materiais não reutilizáveis, autoclave-se após a realização de
análises e descarta-se conforme determinado na instituição. Já para o descarte de
materiais tóxicos e contaminados, acondiciona-se o material em caixa coletora
própria, sendo seu recolhimento efetuado quando atingida a capacidade da mesma.
Por fim os descartes de vidrarias danificadas são armazenados em caixa
coletoras próprias e destinadas a usina de reciclagem da própria Instituição para
17
fins de reaproveitamento. As vidrarias quebradas com meio de cultura são
autoclavadas antes do descarte e acondicionadas em recipientes apropriados, por
exemplo, beckers de 1000 mL, potes plásticos, entre outros. (SALVATORI et al.,
2013)

18
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A parede celular é uma organela composta de peptidioglicanos, o qual é

responsável pela rigidez e pela configuração da forma das bactérias. Esta estrutura
possui múltiplas funções, como a proteção da célula contra alterações no equilíbrio
osmótico, fagocitose e outras substâncias químicas.
As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos conforme a
capacidade de suas paredes celulares fixarem o corante violeta cristal, isto se deve
ao fato de existirem diferentes graus de permeabilidade na parede dos
microrganismos Gram positivos e Gram negativos. A parede celular dos Gram
positivos, conforme o exposto na Figura 2 é composta por muitas camadas de
peptideoglicana, obtendo uma estrutura espessa e rígida. Além disso, esta possui
ácidos teicoicos (ácido lipoteicoico e ácido teicoico de parede), os quais possuem
carga negativa, oriundos dos íons de fosfato, que podem se ligar e regular o
movimento de cátions para dentro e fora da célula, além de assumir um papel no
crescimento celular ao impedir possíveis lises celular.
Em oposição, em sua parede celular os Gram negativos possuem somente
uma fina camada de peptideoglicana e uma membrana externa, por isso são mais
suscetíveis ao rompimento mecânico. Essa membrana possui caráter negativo e
funciona como uma espécie de barreira extra para antibióticos, enzimas digestivas,
detergentes, metais pesados, sais biliares e certos corantes. Os componentes da
parede celular desse tipo de microrganismos estão explícitos na Figura 3.

Figura 2- Parede celular Gram positiva.

19
 Figura 3- Parede celular Gram Negativa.

Devido a essas diferenças nas estruturas das paredes celulares é que se

pode definir o mecanismo da coloração de Gram. O cristal violeta cora ambas
células de púrpura já que é capaz de penetrar no citoplasma dos dois tipos
celulares.
A adição de lugol permite a formação de cristais com corante e estes são
grandes demais para escapar pela parede celular, fazendo com que haja
resistência a descoloração na etapa de diferenciação. Já a adição do álcool permite
a dissolução da membrana externa das células Gram negativas, fazendo com que
surjam pequenos buracos na camada, nos quais os cristais violeta-iodo se
difundem. Em oposição nas células Gram positivas ocorre a desidratação da
peptideoglicana, fazendo com que estas se tornem mais impermeáveis ao cristal
violeta. A adição de safranina torna as bactérias Gram negativas rosadas, em
virtude dessas se tornarem incolores após a lavagem com álcool, enquanto que
nas células gram positivas essa coloração não é tão visível devido a coloração roxa
escura previamente absorvida, por essa razão o álcool é considerado um agente
diferenciador de coloração.
Para esta prática foram escolhidos os seguintes microorganismos:
Escherichia Coli, Staphylococcus aureus e Saccharomyces. O E. Coli é um
bastonete curto, Gram negativo, não esporulado, medindo entre 1,1 a 1,5 μm por 2
a 6 μm (BARNES et al. 2003; OLIVEIRA et al., 2004; QUINN et al., 2005), enquanto
que o staphylococcus aureus é uma bactéria esférica do grupo dos cocos Gram
positivos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 μm de diâmetro, imóveis, não
esporulados e geralmente não encapsulados. (SANTOS et al. 2007)

20
 Já as leveduras são organismos eucarióticos unicelulares, que se
reproduzem assexuadamente por brotamento ou cissiparidade e que desenvolvem
a fermentação alcoólica. A levedura Saccharomyces apresenta forma oval ou
cilíndrica e apresenta membrana celular bem definida, pouco espessa e rígida
composta principalmente de dois polissacarídeos manana e glucana.

3.1 VISUALIZAÇAO DOS MICRORGANISMOS NO MICROSCÓPIO

Para a visualização amplificada da amostra de S. Aureus, E. Coli e

Saccharomyces, a luz, que incide sobre o condensador e que é responsável pelo
ajuste de luminosidade, atravessa o objeto e é encaminhada para o canhão de
lentes convergentes, formado pela objetiva e a ocular. Quando o feixe luminoso
atinge a lente objetiva, forma-se uma imagem intermediária e aumentada do objeto.
Nas lentes objetivas a imagem é ajustada pelo seu limiar de resolução, que
proporciona uma maior riqueza de detalhes, enquanto a lente ocular, funciona como
uma lupa que amplia e produz a imagem final do espécime observado.
O microscópio óptico possuía objetivas de 4, 10, 40 e 100, que proporcionam
uma visão panorâmica de aumento aproximado de 40x, 100x, 400x e 1000x,
respectivamente. As objetivas utilizadas na visualização do microrganismo foram
as de 40x e 100x.
Para a visualização das estruturas desejadas, a partir da objetiva de 40x
deve ser utilizado uma interface líquida entre a objetiva e o material na lâmina, para
não danificar a lâmina, sendo que essa interface deve ter o mesmo índice de
refração da objetiva.
No aumento de 100x durante o experimento, utilizou-se o óleo de imersão
para que o índice de refração fosse igual para a lâmina de vidro e o óleo. Isto faz
com que os raios luminosos não se dispersem ao atravessarem o conjunto lâmina-
óleo, permitindo a entrada de um grande cone de luz na objetiva, e assim permite
uma melhor resolução.

21
 Figura 4- Raios luminosas na lente objetiva sem óleo e com óleo de imersão.

O uso de microscópios de luz implica encontrar um ótimo ponto de foco que

permita a visualização da imagem sem nenhuma distorção. Nesse equipamento, o
foco é ajustado pelo deslocamento da amostra no eixo Z mediante a utilização dos
parafusos macrométricos e micrométricos. Esses parafusos se encontram na parte
lateral da estativa. O maior deles é o macrométrico, que permite grandes avanços
ou recuos da platina em direção à objetiva, enquanto o micrométrico permite
pequenos avanços ou recuos. Esse movimento da platina leva à focalização do
material observado em diferentes aumentos.

3.2 RESULTADOS DO PROCESSO DE COLORAÇÃO EM CADA

MICRORGANISMO

As Figura 5 e Figura 6 representam as lâminas obtidas após a realização do

teste de coloração de Gram nesses microrganismos.

22
 Figura 5 e Figura 6- Lâmina de Saccharomyces e lâmina de E.Coli, vistas no
microscópio, respectivamente.

Observou-se que após a realização dos procedimentos indicados

anteriormente, a lâmina contendo E.Coli apresentou coloração roxeada, entretanto
na que continha Saccharomyces notou-se uma coloração mais próxima da rosa.
Devido a algum erro de procedimento experimental, como não
desenvolvimento da colônia nas condições em que foi colocada ou necessidade de
um outro método de coloração das placas, não se fez possível fazer a mesma
identificação nas lâminas contendo Staphylococcus aureus.
Os resultados obtidos na prática experimental vão de acordo com os
encontrados na literatura teórica, já que a E.Coli realmente apresentou coloração
roxeada, se aproximando de tons azul violeta, conforme as bactérias gram
negativas apresentam após a realização desse teste. Enquanto que a
Saccharomyces apresentou uma coloração próxima da rosada, puxando para o
vermelho, já que apresenta parede celular mais rígida e pouco espessa.
A coloração de Gram é bastante utilizada em análises químicas
especialmente para identificar preliminarmente a morfologia das bactérias ou
estabelecer se há um número significativo destas nas amostras coletadas. Em
virtude disso, há a exigência de que haja um controle de qualidade envolvendo as
etapas desse processo, no caso da coloração de Gram faz-se necessário que as
cepas bacterianas sejam repicadas a cada 15 dias em ágar nutriente e que se
realize um controle da pureza destas a cada 2 meses e posteriormente ao teste
estas devem retornar aos tubos com ágar nutriente. O repique das cepas deve ser

23
feito em placas fazendo uso do método do esgotamento por estrias e estas devem
ser identificadas pelos procedimentos tradicionais.
As lâminas de controle de qualidade para uso diário devem ser preparadas
com muita atenção. Inicialmente deve-se pipetar solução salina estéril em um tubo
de ensaio limpo e estéril. A alça bacteriológica deve ser previamente e
posteriormente flambada tomando-se o cuidado de aguardar que esta esfrie antes
do contato com os microorganismos. Pipeta-se então uma gota da suspensão
microbiana sobre cada uma das lâminas, que devem secar naturalmente e ser
estocadas em um porta lâminas a temperatura ambiente sendo devidamente
identificadas.
Além desse teste de coloração Gram existem outros testes que poderiam ser
utilizados, como o método da coloração simples, de ZiehlNielsen, coloração
negativa, imuno citoquímica, coloração supra vital, diferenciação por lugol e reativo
de Schiff. A coloração simples envolve a aplicação de uma única solução corante,
sendo que esta ou tem afinidade com a célula bacteriana e faz se possível observar
os microrganismos corados contra um fundo transparente ou então cora o meio
envolvente tornando os microrganismos transparentes (coloração negativa). Entre
os corantes mais utilizados estão o azul de metileno, cristal violeta e a
Carbolfucsina.
O Método de Ziehl-Neelsen, foi desenvolvido em 1882 e é baseado na
peculiaridade de que apenas alguns gêneros bacterianos resistem ao
descoramento com uma solução de álcool-ácido e permanecem corados de
vermelho mesmo após o tratamento utilizando fucsina fenicada aquecida. As
bactérias que não possuem essa propriedade geralmente apresentam a coloração
do corante de fundo, em geral azul de metileno ou ácido pícrico saturado. O
diferencial das bactérias que ficam avermelhadas está no fato destas possuírem
uma parede celular contendo lipídeos fortemente ligados, os quais provocam a
hidrofobicidade e dificultam a passagem de corantes aquosos, além da ação dos
mordentes e dos diferenciadores. Esse método é bastante utilizado para validar o
diagnóstico de doenças como a tuberculose pulmonar. Já a coloração negativa é
um procedimento em que o material de fundo é corado com um corante ácido que
deixa as células incolores. Geralmente utiliza-se o corante negro nigrosina e
emprega-se esse método para células nas quais a coloração direta é difícil.

24
 O método da imunocitoquímica baseia-se numa reação antígeno-anticorpo
e envolve um sistema de alta sensibilidade de detecção na qual ocorre a formação
de um produto colorido. Basicamente os antígenos são localizados em células de
um esfregaço ou de uma amostra de tecido partindo do princípio da ligação
específica destes com os anticorpos.
A coloração supravital depende do resultado da combinação das
propriedades bioquímicas e da ativação fisiológica dos microrganismos em estudo.
O corante utilizado pode ser o azul brilhante de cresil e esse método é útil no
diagnóstico de anemias.
Por fim, a coloração ácido periódico Schiff (PAS) é utilizada para distinguir
diferentes tipos de doença de estocagem de glicogênio e funciona com base na
reação seletiva de oxidação entre o ácido periódico e os resíduos de glicose,
produzindo aldeídos que reagem com o reagente Schiff e produzem uma coloração
púrpura-magenta.

25
4 CONCLUSÃO

Com o estudo das normas e termos apresentados, após colocá-los em

pratica foi possível compreender a importância de suas aplicações para que se
maximize a possibilidade de se obter bons resultados da prática dentro de um
laboratório. Os procedimentos de assepsia e limpeza da bancada, materiais,
operadores e outras partes úteis do laboratório são fundamentais para a
minimização dos riscos é imprescindível para evitar contaminações tanto do
operador quanto do material a ser estudado. É necessário sempre se verificar qual
processo de limpeza (esterilização, flambagem, assepsia, antissepsia, sanitização,
limpeza, entre outros procedimentos) é o mais adequado para o momento, e ter
claros o que cada termo significa para que não ocorra confusão em relação ao
procedimento de limpeza que se deseja.
O método de Gram permite identificar bactérias com diferentes estruturas de
parede celular, por meio da coloração que estas adquirem após uma sucessão de
etapas envolvendo a adição de inúmeros agentes químicos. Nesta prática,
escolheu-se para a realização dos testes os seguintes microorganismos:
Escherichia Coli, Staphylococcus aureus e Saccharomyces. Assim, com o auxílio
do microscópio foi possível visualizar, pela técnica de coloração Gram, os
microorganismos previamente citados. Os resultados obtidos foram de encontro
com os esperados pela literatura, tendo em vista que a E.coli apresentou coloração
roxeada enquanto que a Saccharomyces apresentou uma coloração próxima da
rosada. A lâmina que continha Staphylococcus aureus não pode ser devidamente
observada e isto reforça a importância do preparo adequado das cepas e da
realização correta de todas as etapas do procedimento. É importante lembrar que
existem ainda uma sequência de passos obrigatórios que garantem a qualidade da
cepa e da lâmina preparada, para que estas não venham a apresentar problemas
futuros ou não possam ser devidamente visualizadas.

26
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