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DEPARTAMENTO DE ENTOMOLOGIA,

FITOPATOLOGIA E ZOOLOGIA AGRCOLA


Setor de Fitopatologia

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz


Universidade de So Paulo

EXERCCIOS PRTICOS DE
MICROBIOLOGIA

Coordenador: Jorge A. M. Rezende


Organizadores: Ana P. O. Amaral Mello
ngelo A. B. Sussel
Eliane G. da Silva
Luis F. C. Ribeiro
Janayna M. Barbosa
Jorge A. M. Rezende
Raquel de C. Neroni
Ricardo Ferrari Silva
Scheila C. Maciel
Sylvia R. G. Moraes

PIRACICABA, SP
2008
PREFCIO

As aulas prticas da disciplina LEF-321 Microbiologia envolvem diversos


exerccios prticos que so realizados e avaliados pelos alunos, tais como colorao e
mobilidade de bactrias, anlise das caractersticas morfolgicas de fungos, preparo e
esterilizao de meio de cultura, efeito da luz e temperatura no crescimento e esporulao
de microrganismos, fixao de nitrognio atmosfrico, entre outros.

Com o objetivo de proporcionar aos alunos um material didtico mais adequado


para melhorar o aprendizado foi elaborada a presente apostila que, antes de cada
exerccio, traz alguns conceitos bsicos sobre o tema a ser trabalhado em sala de aula.
Com isso, espera-se que o aluno disponha de uma melhor referncia para estudos e
eventuais consultas futuras.

Essa apostila foi organizada, em 2005, pelos alunos do programa de Ps-


graduao em Fitopatologia, ngelo Aparecido Barbosa Sussel (mestrado), Janayna
Magalhes Barbosa (doutorado), Raquel de Cssia Neroni (mestrado), Ricardo Ferrari
Silva (doutorado) e Scheila da Conceio Maciel (doutorado), sob a coordenao do
Professor Jorge Alberto Marques Rezende. Em 2007, a apostila com os Exerccios
Prticos em Microbiologia foi atualizada pelos alunos do programa de Ps-graduao em
Fitopatologia, Ana Paula de Oliveira Amaral Mello (doutorado), Eliane Gonalves. da Silva
(doutorado), Luiz Fernando Caldeira Ribeiro (doutorado) e Sylvia Raquel Gomes Moraes
(doutorado), sob a superviso do mesmo Professor. Todas as informaes contidas na
apostila foram compiladas de livros textos que tratam dos temas dos exerccios e que
esto listados na Bibliografia Consultada.

OS ORGANIZADORES

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SUMRIO

REGRAS BSICAS DE SEGURANA EM LABORATRIO .......................................................... 4

1 - MICROSCOPIA PTICA .......................................................................................................... 6

2 - COLORAO E MOTILIDADE DE BACTRIAS ..................................................................... 11

3 - REINOS CHROMISTA E FUNGI ............................................................................................. 16

4. REQUERIMENTOS NUTRICIONAIS E MEIOS DE CULTURA DE MICRORGANISMOS.......... 27

5. CULTIVO E CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS............................................................ 35

6 - CONTROLE QUMICO E FSICO DE MICRORGANISMOS .................................................... 45

7 - CONTROLE BIOLGICO DE MICRORGANISMOS ANTAGONISMO .................................. 55

8 - PRODUO DE EXOENZIMAS ............................................................................................. 59

9 - ISOLAMENTO DE FUNGOS E BACTRIAS DO SOLO .......................................................... 64

10 - ANLISE MICROBIOLGICA E TRATAMENTO DA GUA .................................................. 68

11 - FERMENTAO ALCOLICA.............................................................................................. 75

12 FIXAO DE NITROGNIO ................................................................................................ 84

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ................................................................................................... 92

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REGRAS BSICAS DE SEGURANA EM LABORATRIO

A segurana no laboratrio exige o mesmo tipo de ateno contnua que se dedica


pesquisa. Cada pessoa tem a responsabilidade de conhecer os riscos sade e
segurana, os quais esto relacionados com o correto manuseio dos produtos qumicos,
dos equipamentos e das tcnicas, de modo que possa estabelecer disposies e
procedimentos que diminuam a ocorrncia de acidentes.
As experincias que se realizaro so certamente novidades para alguns dos
estudantes, com pouca experincia laboratorial. Importa, por isso, prevenir. preciso
proteger a sade do prprio experimentador e de terceiros, que tambm podero ser alvo
de prticas menos adequadas. O sucesso das experincias depender do grau de rigor
com que as mesmas forem executadas e dos baixos nveis de contaminaes cruzadas
que for possvel manter.
Assim, o acesso ao laboratrio de microbiologia restrito s pessoas qualificadas,
que incluem os estudantes apenas durante os perodos de aulas previstos. Como
sugesto, recomenda-se o uso de um jaleco comprido, limpo e devidamente ajustado ao
corpo, para proteger o operador e o seu vesturio de eventuais acidentes. Desta forma,
alm de proteger o experimentador, o jaleco minimiza o transporte de microrganismos
exteriores para o laboratrio, permitindo a manuteno de uma baixa carga de
contaminantes evitando tambm a propagao indesejvel no exterior dos
microrganismos manipulados no laboratrio.
expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contato ou
aplicar cosmticos durante a execuo de experincias laboratoriais. aconselhvel
adquirir o hbito de manter as mos longe da boca.
O local de trabalho dever estar sempre devidamente limpo, para tanto, o aluno
deve sempre proceder desinfestao da bancada antes de iniciar os trabalhos, para no
permitir a contaminao das prprias experincias com microrganismos de sesses
anteriores, e posteriormente para minimizar a propagao dos microrganismos com os
quais acabou de manipular.
Todo o equipamento e material de laboratrio utilizado durante a experimentao,
dever ser reposto no local indicado depois de concluda a sua utilizao.
Particularmente, as placas e tubos contaminados devero ser desinfestados ou colocados
em local prprio para descontaminao.

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Qualquer acidente dever ser imediatamente reportado ao responsvel pela
sesso de trabalho.
No iniciar qualquer experincia sozinho. O conhecimento e compreenso prvia
dos procedimentos experimentais e a efetiva disponibilidade de todos os recursos
materiais necessrios constituem elementos importantes para o sucesso dos
experimentos.

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1 - MICROSCOPIA PTICA

1. INTRODUO
A descoberta dos microrganismos se deve ao holands Antony Van Leeuwenhoek
(1632 1723), que combinava uma rara destreza na construo de microscpios simples
com uma tambm rara habilidade como observador e intrprete cientfico. Como nos
sculos 17 e 18 no existiam cientistas profissionais, como compreendemos o termo hoje,
todos aqueles que se dedicavam s atividades cientficas o faziam entre outras
atribuies que lhes proporcionavam o sustento ou por j disporem de fortuna pessoal.
Assim, todas as grandes descobertas deste perodo, em todos os campos da cincia,
foram realizadas por amadores. Leeuwenhoek, apesar de possuir pouca educao formal
e nunca ter freqentado uma Universidade, foi capaz de descobertas importantssimas, as
quais foram registradas em uma longa srie de cartas escritas em holands, que foram
posteriormente traduzidas para o ingls e publicadas nos Anais da Sociedade Real de
Londres.
Os microscpios de Leewenhoek pouco se parecem com os instrumentos que hoje
nos so familiares. A lente, nica, diminuta e quase esfrica, esmerilada com grande
cuidado, era montada entre duas pequenas placas metlicas. O exemplar era colocado na
ponta rombide de um alfinete afixado placa posterior e trazido ao foco por manipulao
de dois parafusos que variavam a posio do alfinete em relao a lente. Durante esta
operao, o observador segurava o instrumento com a outra face muito prxima ao seu
olho e procurava enxergar atravs da lente. Nenhuma mudana na amplificao era
possvel, visto que a capacidade magnificadora de cada microscpio era uma propriedade
intrnseca de sua nica lente. Apesar da construo grosseira, os microscpios de
Leewenhoek proporcionaram aumentos de 50 a at cerca de 300 vezes o dimetro. A
amplificao mxima que ele pde conseguir foi pouco menos de um tero da maior
amplificao proporcionada por um moderno microscpio ptico composto.
O lugar de Leewenhoek na histria cientfica no se deve tanto sua habilidade
em construir microscpios, embora ela tenha sido essencial, mas ao extraordinrio
alcance e acuidade de suas observaes microscpicas. Ele era dotado de um
excepcional grau de curiosidade e estudou quase todos os objetos passveis de serem
visualizados atravs de um microscpio. Seu maior merecimento repousa, entretanto, em
sua descoberta do mundo microbiano, cuja existncia, em toda a sua variedade e
profuso, revelou humanidade.

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Apesar das descobertas de Leewenhoek, a explorao do mundo dos micrbios
no progrediu por mais de um sculo aps sua morte. As principais razes desse longo
atraso parecem ter sido de ordem tcnica dos microscpios disponveis na poca. Os
mais importantes progressos pticos, que conduziram um dia aos microscpios
compostos da qualidade dos que hoje empregamos, iniciaram-se aproximadamente em
1820, estendendo-se pelos cinco decnios subseqentes.
Desde as descobertas de Leewenhoek, ficou claro que o microscpio ferramenta
bsica no estudo de microrganismos. Por isso, ter uma compreenso geral dos princpios
fsicos que constituem a base de seu funcionamento, bem como das tcnicas especiais
de preparao dos espcimes, so necessrios para o estudo microscpico de material
biolgico.

2. MICROSCPIO PTICO
No perodo de 1860 a 1890 a construo do microscpio foi colocada em bases
racionais, principalmente por Abbe, que foi o primeiro a compreender claramente as
bases fsicas da microscopia. Poder-se-ia pensar que o poder de ampliao de um
microscpio poderia ser aumentado indefinidamente, pela introduo de um nmero cada
vez maior de lentes de aumento, corrigidas quanto aberrao. No entanto, isto
impossvel, como Abbe foi o primeiro a reconhecer, porque uma outra propriedade do
sistema de lentes, seu PODER DE RESOLUO, estabelece uma limitao. O poder de
resoluo a capacidade de mostrar, como distintos e separados, dois pontos muito
prximos entre si. O poder de resoluo uma medida do tamanho do menor objeto que
pode ser visto ao microscpio, e que pode ser calculado pela equao de Abbe, indicada
abaixo. Se o objeto for menor do que o poder de resoluo, haver sobreposio da sua
imagem com as imagens dos pontos adjacentes, e ele no ser distinguido. Dois fatores
governam o poder de resoluo de um microscpio: uma propriedade da lente conhecida
como sua abertura numrica; e o comprimento de onda da luz usada para a iluminao.
Equao de Abbe: d = 0,612 /n sen
onde:
d = poder de resoluo
= comprimento de onda da luz
n = ndice de refrao do meio entre o objeto e a objetiva
= metade do cone de luz que passa pelo objeto e atinge a objetiva.
n sen = abertura numrica

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Para todas as finalidades prticas, o comprimento de onda da luz fixo. Portanto,
qualquer melhoria no poder de resoluo, com lentes de elevado aumento, ter que ser
baseada no aumento da abertura numrica. A abertura numrica depende de dois fatores:
dimetro da objetiva em relao sua distncia focal e ndice de refrao da substncia
existente entre a lente e o objeto examinado, e da matriz onde o objeto se encontra. No
que se refere lente, existem dificuldades pticas que estabelecem um limite ao aumento
da abertura numrica. Um recurso muito utilizado para aumentar a abertura numrica
aumentar o ndice de refrao do meio entre o objeto examinado e a objetiva,
preenchendo-o com um lquido que tenha um ndice de refrao mais elevado que o do
ar. O leo de cedro o mais usado para esse fim. As lentes empregadas com esse leo
so chamadas objetivas de imerso.
Qual o menor objeto que pode ser nitidamente observado com um bom
microscpio composto? Isso pode ser calculado considerando-se que: n = deve ser maior
do que o ndice de refrao do ar que igual a um. Isso pode ser obtido com o leo de
imerso, cujo n = 1,5; deve ser o mais prximo possvel de 90; e deve ser prximo de
4000 (luz violeta) que o menor comprimento de onda que sensibiliza o olho humano.
Assim, com n = 1,5 e sen = 0,87 (que tpico para uma lente de imerso) e = 4000 ,
a resoluo (d) terica obtida de 0,2 . Em outras palavras, dois pontos que no esto
separados por pelo menos essa distncia no sero vistos como pontos distintos, mas
sim como uma nica imagem, como ilustrado na figura 1.

A B

Figura 1. A) Dois pontos separados por aproximadamente 0,2 ; B) Dois pontos


separados por menos de 0,2 (Wischnitzer, 1988).

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3. DESCRIO DE UM MICROSCPIO PTICO
A figura 2, na pgina de exerccios, ilustra um moderno microscpio composto.
Vamos em primeiro lugar seguir a trajetria de luz no instrumento. A luz refletida por um
espelho plano, para o condensador. O condensador mvel e, para se obter a mxima
resoluo com grandes aumentos, deve focalizar a luz no plano do objeto. O condensador
equipado com um diafragma. Este tem a funo de controlar o feixe luminoso que
penetra no sistema de lentes do condensador. A sua funo, portanto, no , como
muitos pensam controlar a quantidade de luz que penetra no microscpio, mas reduzir o
ngulo do cone de luz de modo que, depois de atravessar o objeto e divergir para a
objetiva, ele no exceda o dimetro desta lente. Dessa forma, a luz que alcana os olhos
no passa atravs da periferia da objetiva, que de difcil correo. A luz que passa para
o sistema da objetiva focalizada no sistema de lentes da ocular, depois de passar pelo
tubo do microscpio.
As objetivas do microscpio so fixadas a uma pea giratria, que pode alinhar
qualquer delas com o resto do sistema ptico, permitindo, assim, fcil e rpida mudana
de aumento.
O objeto examinado em uma lmina de vidro colocada sobre uma superfcie
plana horizontal, que possui um acessrio para mover a lmina.
H dois tipos de ajustes para a focalizao do sistema de lentes: o macromtrico,
que move o sistema numa distncia vertical de vrios centmetros e serve para trazer o
objeto ao foco aproximado; o micromtrico, que atua numa distncia muito menor, e
utilizado para a focalizao final.

4. CUIDADOS COM O MICROSCPIO


 Nunca forar; deve-se trabalhar livremente;
 Limpeza: particularmente, as lentes de imerso devem ser limpas com
algodo;
 Nunca tocar as lentes com as mos; se necessrio, limpar com algodo ou
papel apropriado;
 As lentes das objetivas nunca devem tocar a lmina; nunca fazer a focalizao
abaixando o canho com o boto macromtrico, olhando pelas oculares;
 No inclinar o microscpio;
 Aps o uso, guardar em local apropriado e protegido.

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5. EXERCCIOS
1. Identifique os componentes bsicos do microscpio:

a) Base
b) Platina ou mesa
c) Charriot
d) Canho ou tubo
e) Revlver
f) Objetivas
g) Ocular
h) Parafuso macromtrico
i) Parafuso micromtrico
j) Condensador
k) Diafragma
l) Fonte de luz ou
iluminador
Figura 2. Microscpio composto

2) O que o poder de resoluo de um microscpio ptico? Qual o menor objeto que


pode ser adequadamente visualizado em um microscpio ptico?

3) Para que serve o leo de imerso?

4) Explique como foram feitas a montagem da lmina e a observao do fungo ao


microscpio.

5) Esquematize o fungo examinado ao microscpio, indicando o aumento utilizado.

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2 - COLORAO E MOTILIDADE DE BACTRIAS

1. INTRODUO
Bactrias so microrganismos procariticos invisveis a olho nu. A dimenso de
uma clula bacteriana da ordem de micrometro (m), que corresponde a 1/1000 mm. As
clulas bacterianas, dependendo da espcie, variam em tamanho. Por exemplo,
estafilococus e estreptococus so bactrias esfricas com dimetro variando de 0,75 a
1,25 m, enquanto que as bactrias causadoras de tifo e disenteria, que so cilndricas,
medem 0,5 a 1 m de largura por 2 a 3 m de comprimento.
As clulas bacterianas podem ser de trs tipos: esfrica, cilndrica ou espiralada.
As clulas esfricas so denominadas cocus. As bactrias cilndricas, ou do tipo
bastonetes, so chamadas de bacilos. Aquelas espiraladas recebem o nome de espirilo.
Embora algumas bactrias aparecem na forma de clulas individuais, muitas
espcies crescem em arranjos bem definidos. Esses arranjos so tpicos das espcies e
podem ser utilizados para fins de identificao. Por exemplo, bactrias do tipo cocos
podem apresentar diferentes arranjos, tais como diplococos, estreptococos, ttrades
estafilococos e sarcinas. As bactrias do tipo bacilos, diferentemente das anteriores,
geralmente no formam arranjos caractersticos, embora haja exceo.
Algumas clulas bacterianas podem apresentar estruturas externas, tais como
flagelos e plos (pili/pilus). Os flagelos so estruturas filamentosas, do tipo de um fio de
cabelo, com formato helicoidal, que propele a bactria em um meio lquido. Os flagelos
so geralmente mais longos que a clula, atingindo 15 a 20 m, mas o dimetro apenas
uma pequena frao do dimetro da clula, isto , 12 a 20 nm (1 nm = 1/1000 m). Por
isso, os flagelos no podem ser vistos em um microscpio ptico, cujo poder de resoluo
da ordem de 0,2 m ou 200 nm. No entanto, h processos especiais de colorao, que
precipitam o corante na superfcie do flagelo, tornando-o mais grosso e assim, visvel ao
microscpio ptico.
Muitas bactrias tambm apresentam estruturas externas que no esto
relacionadas com motilidade e que so denominadas plos. O plo tem um dimetro
menor que o flagelo (3 a 10 nm), alm de ser menor e reto. O pili est associado a
diversas funes, entre as quais a reproduo sexuada da bactria, aderncia da clula
bacteriana no hospedeiro, etc. O pili s visto em microscpio eletrnico.

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2. PAREDE CELULAR
A parede celular dos procariotos uma estrutura rgida que mantm a forma de
cada clula bacteriana. A estrutura to rgida que condies de alta presso ou qualquer
outra condio adversa dificilmente alteram o formato de uma bactria. Dependendo da
espcie e das condies de crescimento da bactria, a parede celular pode representar
de 10 a 40 % do peso seco da clula.
A parede celular da bactria no uma estrutura homognea, mas sim constituda
por camadas de diferentes substncias que variam em espessura e composio. Essas
diferenas so teis para a identificao e classificao das bactrias. Dependendo da
constituio da parede celular, as bactrias so classificadas em Gram positivas ou Gram
negativas.
A parede celular das bactrias Gram positivas geralmente possui uma camada
espessa de peptideoglucano. A parede celular das bactrias Gram negativas mais
complexa do que a das anteriores. As bactrias Gram negativas possuem uma membrana
externa que cobre a camada de peptideoglucano, que mais delgada que a encontrada
nas bactrias Gram positivas. Nas bactrias Gram negativas, a camada de
peptideoglucano representa somente 5 a 10 % do peso seco da parede celular da
bactria. Essa camada de peptideoglucano est localizada no espao periplasmtico,
entre a membrana plasmtica e a membrana externa. A membrana externa, ausente em
bactrias Gram positivas, constituda de fosfolipdios e encontra-se ancorada na
camada de peptideoglucano por meio de molculas lipoproticas (Figura 3).
Os milhares de espcies de bactrias so diferenciados atravs de anlise de
diferentes caractersticas, tais como morfologia, presena e tipo de flagelos, composio
qumica da parede celular (Gram), requerimentos nutricionais, atividades bioqumicas e
fonte de energia e seqncia de nucleotdeos do DNA genmico.

3. MTODOS DE COLORAO DE BACTRIAS


Os mtodos de colorao de bactrias so utilizados para caracterizao
morfolgica, visualizao de flagelos, identificao da composio da parede celular, etc.
Esse conjunto de informaes til na identificao da espcie bacteriana.

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cido teicico cido lipoteicico
Peptideoglucano

Parede
celular

Membrana
plasmtica

Protena A

Lipo-polissacardeo Fosfolipdio
Lipoprotena
Membrana
Parede externa
celular
Peptideoglucano
Membrana
plasmtica
Protena

B
Figura 3. Estrutura da parede celular de uma bactria Gram positiva (A) e Gram negativa
(B).

3.1 COLORAO DIRETA


A colorao da clula bacteriana com um nico corante chamada de colorao
direta, simples ou positiva. As principais etapas da colorao direta so:
a) fazer um esfregao da suspenso bacteriana na lmina de vidro;
b) fixar o esfregao na lmina atravs do calor;
c) cobrir o esfregao com o corante (safranina ou fuccina) por um minuto;
d) lavar gentilmente a lmina com gua, secar com o calor e observar.

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3.2 COLORAO INDIRETA
Na colorao indireta ou negativa, o meio (lmina) fica corado, pois a clula
bacteriana no absorve o corante.
a) fazer um esfregao da suspenso bacteriana na lmina de vidro;
b) fixar o esfregao na lmina atravs do calor;
c) colocar uma gota do corante (Nanquim) em uma extremidade da lmina,
distante do esfregao;
d) com o auxilio de outra lmina, na posio inclinada, arrastar o Nanquim sobre
o esfregao, de tal sorte que forme uma pelcula bem fina do corante;
e) secar no ar e observar.

3.3 COLORAO DIFERENCIAL OU DE GRAM


Uma das tcnicas mais importantes de colorao diferencial para bactria a
colorao de Gram. Essa tcnica foi primeiramente descrita em 1884, pelo mdico
dinamarqus Christian Gram. Ele desenvolveu esse mtodo quando estava procurando
meios para localizar clulas de penumococos em tecido pulmonar de pacientes que
morreram de pneumonia. As principais etapas da colorao de Gram so:
a) fazer um esfregao da suspenso bacteriana na lmina de vidro;
b) fixar o esfregao na lmina atravs do calor;
c) cobrir o esfregao com cristal violeta por um minuto;
d) cobrir o esfregao com soluo de iodo (30 segundos), que ir fixar o cristal
violeta dentro da clula bacteriana;
e) lavar com lcool, que ir remover o corante da bactria Gram negativa;
f) cobrir o esfregao com safranina (um minuto), que ir colorir as clulas que
foram descoloridas pela ao do lcool.
g) Lavar com gua, secar no calor e observar.

As bactrias que retm o cristal violeta e adquirem uma colorao violeta so


chamadas de Gram positivas. As bactrias que perdem o cristal violeta com a ao do
lcool e que adquirem a colorao vermelha proporcionada pela safranina so chamadas
de Gram negativas. Essa diferena na colorao est relacionada com a espessura e
composio da parede celular dessas bactrias. Durante o processo inicial de colorao
descrito acima, h a formao de um complexo cristal violeta + soluo de iodo no interior
da clula bacteriana. Quando a clula de uma bactria Gram negativa lavada com

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lcool, os lipdeos localizados na membrana externa so dissolvidos e removidos. Isso
promove o rompimento da membrana externa e aumenta a sua permeabilidade. Com isso
o complexo cristal violeta + iodo lavado. A clula descolorida da bactria Gram negativa
adquire a colorao vermelha proporcionada pelo corante safranina. No caso das clulas
de uma bactria Gram positiva, o lcool promove o fechamento dos poros existentes na
espessa camada de peptideoglucano, retendo o complexo cristal violeta + iodo dentro da
clula (Figura 3).

4. MTODO PARA DETECO DE MOTILIDADE


A motilidade de clulas bacterianas, que um indicativo da presena de flagelos,
visualizada em uma gota da suspenso bacteriana, observada em uma lmina especial
que possui uma rea cncava no centro. O procedimento denominado gota pendente
consiste das seguintes etapas:
a) colocar uma gota da suspenso bacteriana em uma lamnula;
b) inverter a lamnula e coloc-la sobre a lmina, de tal sorte que a gota fique
pendente no centro da rea cncava;
c) observar a motilidade das clulas bacterianas

5. EXERCCIOS
1) Quais as formas bsicas das clulas bacterianas e qual seu tamanho mdio?

2) Por que as bactrias gram positivas aparecem coradas de azul e as gram negativas de
rosa no mtodo de colorao de Gram?

3) Quais as principais caractersticas utilizadas para a identificao dos milhares de


espcies de bactrias?

4) Esquematize as bactrias vistas ao microscpio indicando o aumento utilizado.

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3 - REINOS CHROMISTA E FUNGI

1. INTRODUO
Existem aproximadamente 10 milhes de espcies de organismos vivos na face
da Terra, dos quais os microrganismos compreendem a grande maioria. Com isso, h
necessidade de orden-los em grupos baseados nas suas similaridades. O primeiro
sistema de classificao de organismos surgiu em meados do sculo 18, proposto pelo
mdico e botnico suo Carolus Linnaeus. Esse sistema possua dois reinos: Plantae e
Animalia. Nesse sistema, Linnaeus agrupou os protozorios no reino Animalia, e outros
microrganismos dentro do reino Plantae. Esse sistema tornou-se pouco prtico para os
microrganismos, pois alguns deles eram semelhantes s plantas, outros aos animais,
enquanto alguns possuam caractersticas de ambos. Em 1866, o zoologista alemo Ernst
H. Haeckel props um terceiro reino para solucionar esse problema. Esse reino,
denominado Protista, inclua todos os microrganismos tais como bactrias, algas,
leveduras e protozorios. medida que mais informaes foram sendo obtidas a respeito
das estruturas internas desses microrganismos, o reino Protista passou a ser
questionado.
Em meados do sculo 20, aps a inveno do microscpio eletrnico, houve um
avano significativo nos estudos das estruturas internas das clulas. A descoberta mais
importante em termos taxonmicos foi a de que as clulas podiam ser divididas em duas
categorias, com base no ncleo: eucariticas, que possuem uma membrana celular
envolvendo o ncleo, separando-o assim do citoplasma e procariticas, que no
possuem o material nuclear envolto por uma membrana, sendo ento disperso no
citoplasma. Essa diferena foi a base para separar as bactrias de outros reinos de
microrganismos, alm das plantas e animais. Bactrias possuem clulas procariticas.
Algas, fungos, protozorios, plantas e animais possuem clulas eucariticas.
Em 1969, Robert H. Whittaker expandiu o sistema de classificao proposto por
Haeckel e apresentou um sistema composto por cinco Reinos, levando em considerao
as maneiras pelas quais os organismos obtinham o seu alimento (fotossntese, absoro
e ingesto) e a sua organizao celular (Eucaritico/Procaritico). Nessa nova
classificao, os organismos procariticos (bactrias) foram alocados no reino Monera. O
reino Protista inclua os microrganismos eucariticos unicelulares: algas, protozorios e
fungos limosos. Organismos eucariticos superiores foram colocados nos reinos Plantae,
Animalia e Fungi.

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Antes de 1997 acreditava-se que os organismos procariticos representavam a
forma mais primitiva de um organismo, devido a sua estrutura bastante simples. Por isso,
foram considerados ancestrais dos eucariotos mais complexos. No entanto, Carl Woese e
colaboradores, descobriram que os procariotos e eucariotos aparentemente evoluram a
partir de um ancestral comum, porm por caminhos diferentes. As evidncias que
apoiaram essa sugesto vieram dos estudos do cido nuclico ribossomal (rRNA), que
essencial para a sntese de protenas em todas as clulas vivas. O rRNA de qualquer
organismo possui uma seqncia especfica de nucleotdeos, cujos genes que controlam
essa seqncia mudaram lentamente durante os bilhes de anos de evoluo dos
organismos. A comparao das seqncias de nucleotdeos do rRNA permite indicar com
maior preciso o grau de relacionamento entre eles. Atualmente, a seqncia do rRNA
usada para discernir inter-relaes evolucionrias entre os organismos vivos, servindo
como cronmetro evolucionrio consideravelmente importante. Com isso, ficou claro que
havia dois tipos de bactrias, distintos um do outro, designados archaeobacteria e
eubactria.
A seqncia molecular do RNA ribossomal revelou uma histria evolucionria dos
organismos vivos bem diferente das anteriores, baseadas principalmente nas relaes
fenotpicas. Assim, verifica-se hoje que a vida celular tem evoludo em trs linhas
principais, tendo duas delas permanecido exclusivamente microbianas e compostas por
clulas procariticas. Essas duas linhas so Bacteria e Archaea. A linha eucaritica
chamada Eukarya. Essas trs linhas, originalmente denominadas reinos, foram mais
recentemente re-denominadas com o nvel taxonmico de domnio.
No Domnio Eukarya, alm dos Reinos Protozoa, Animalia e Plantae, tambm
esto os microrganismos dos Reinos Chromista e Fungi, cujos representantes sero
estudados em aulas prticas.

2. REINO CHROMISTA
Os organismos do Reino Chromista so unicelulares ou filamentosos, nutrem-se
por fotossntese ou absoro, possuem celulose na parede celular e presena de flagelos
tubulares. Trs filos (divises) anteriormente includos no reino Fungi so hoje aceitas
dentro do reino Chromista: Hyphochytridiomycota; Labyrinthulomycota e Oomycota.
Desses, apenas o ltimo ser motivo de estudo em aula prtica devido sua importncia
com agente causal de doenas de plantas.

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Os Oomycotas diferem dos fungos verdadeiros em relao a vrias caractersticas
estruturais, bioqumicas, fisiolgicas e moleculares. So cromistas aquticos ou terrestres,
de gua marinha ou doce, saprfitas ou parasitas (alguns economicamente importantes
para as plantas). Possuem talo unicelular ou micelial (hifa asseptada), parede celular
composta por 1-3 e 1-6 glucana e celulose. Tm como principais estruturas do ciclo
assexual o esporngio, os zosporos com dois flagelos, o esporangiforo e a vescula
(em algumas espcies). Exemplos de Oomycotas que causam prejuzos s plantas so:
Pythium sp., Phytophthora sp, Plasmopara sp. e Peronospora sp (Figuras 4, 5 e 6).

b
a

Figura 4. Estruturas de Pythium sp.: (a) esporngio (vescula) contendo zosporos


imaturos; (b) esporngio tpico; (c) zosporos

Figura 5. Estruturas reprodutivas de Phytophthora. Assexuais: (a) esporngio, (b)


zosporo, (c) clamidsporo e Sexual: (d).

18
Figura 6. Estrutura de Peronospora (a) e Plasmopara (b): esporangiforo e esporngio

3. REINO FUNGI
Os organismos do reino Fungi so unicelulares ou filamentosos (maioria), possuem
hifas asseptadas ou septadas, caracterizados pela nutrio por absoro, parede celular
constituda basicamente por quitina e fase somtica ou vegetativa haplide ou dicaritica.
Os principais filos so: Ascomycota; Basidiomycota; e Zygomicota. Incluem-se tambm os
Fungos Mitospricos, que so aqueles cuja reproduo sexual desconhecida ou
ausente.
Resumo das principais caractersticas de cada filo apresentado a seguir.

ZYGOMYCOTA

O filo Zygomycota, classe Zygomycetes, compreende todos os fungos que


produzem zigsporo (que um zigoto de origem sexuada), contido em um zigosporngio
de parede espessa. So fungos de conjugao, filamentosos saprofticos que apresentam
hifas cenocticas (sem septos). Um exemplo o mofo preto do po (Rhizopus nigricans)
que produz esporangiospro (assexuados) situado no esporngio, que ao se abrir
dispersa os esporangiospros (aplansporos), e esses encontrando local adequado iro
germinar formando um novo fungo (Figura 7). O grupo compreende cerca de 600
espcies de fungos, que se desenvolvem principalmente em material vegetal ou animal
em decomposio.

19
Esporngio
Aplansporo
s

Esporangiforo

Figura 7. Estruturas vegetativa e reprodutiva de zigomicetos (Rhizopus).

ASCOMYCOTA

Os ascomicetos so fungos da diviso Ascomycota que produzem esporos em


corpos de frutificao especficos chamados ascos e um grupo monofiltico bem
sucedido de cerca de 12.000 espcies (em 1950). Neste grupo incluem-se quase todos os
fungos que se associam com algas ou cianobactrias para formar lquenes. Este grupo
engloba, tambm, a maioria dos fungos patognicos para as plantas.

Estes fungos produzem grandes quantidades de ascos de cada vez, que esto
contidos numa estrutura (corpo de frutificao) chamada de ascocarpo. Os principais tipos
de ascocarpos so: peritcio; cleistotcio; apotcio e ascostroma. Em alguns casos os
ascos so desprovidos de corpo de frutificao e por isso so denominados ascos nus
(Figura 8). Cada asco produz 8 ascsporos (ou um mltiplo de 8), que resultam de uma
mitose seguida de uma meiose. Os ncleos haplides resultantes esto cercados por uma
membranas e, eventualmente, por uma parede esporfita. As hifas dos ascomicotas so
dividas por septos.

20
Ascos nus

Peritcio

Cleistotcio

Apotcio

Ascostroma

Figura 8. Corpos de frutificao (ascocarpos)

21
BASIDIOMYCOTA

O filo Basidiomycota um grande taxon do reino dos fungos que engloba as


espcies que produzem esporos exgenos numa estrutura em forma de basto chamada
basidia (Figura 9). Essencialmente o grupo irmo dos Ascomycota, contm cerca de 30
000 espcies (37 % dos fungos descritos). Hoje considera-se que os Basidiomycota
compreendem trs grandes classes: os Hymenomycotina (Hymenomycetes; cogumelos),
os Ustilaginomycotina (Ustilaginomycetes; ferrugens dos cereais), e os Teliomycotina
(Urediniomycetes; ferrugens). Ocorrem em ambientes terrestres e aquticos (incluindo o
ambiente marinho) e podem ser caracterizados por possurem hifas septadas,
transportarem os esporos sexuais nas basidias, por terem um fase dicaritica duradoura,
e por apresentarem ligaes em grampo de conexo.

Basidiocarpos (cogumelos)

Esterigma

Basidisporos
Basidia

Lamela Lamela

Figura 9. Basidiocarpo (cogumelo) com diversas lamelas onde esto situadas as basdias
e os basidiporos (esporos sexuais exgenos).

22
FUNGOS MITOSPRICOS
A maioria dos fungos classificada com base nas caractersticas dos corpos de
frutificao e nos esporos produzidos durante a reproduo sexual. Os fungos
mitospricos, anteriormente chamados de deuteromicetos ou fungos imperfeitos, so
aqueles onde o processo sexual e desconhecido ou inexistente. Esse termo atualmente
usado apenas informalmente para denotar formas de reproduo assexuada de membros
de Ascomycota e Basidiomycota.

Figura 10. Exemplos de conidiforos, condios e corpos de frutificao de fungos


mitospricos

23
5. EXERCCIOS
1. Identifique e esquematize as estruturas dos microrganismos (Oomycota e Zygomicota)
observadas ao microscpio ptico, colocando legendas e o aumento utilizado.
A) B)

2. Identifique e esquematize as estruturas fngicas observadas nos Ascomicetos,


colocando legendas e o aumento utilizado.
A. B.

24
3. Identifique e esquematize as estruturas fngicas observadas nos Basidiomicetos,
colocando legendas e o aumento utilizado.

A) B)

25
4. Identifique e esquematize as estruturas observadas nos Fungos Mitospricos,
colocando legendas e o aumento utilizado.

A) B)

C) D)

26
4. REQUERIMENTOS NUTRICIONAIS E MEIOS DE CULTURA DE
MICRORGANISMOS

1. INTRODUO
De todos os organismos vivos, os microrganismos so os mais versteis e
diversificados em suas exigncias nutricionais. Porm, compartilham algumas
necessidades nutricionais em comum com todos os organismos vivos, tais como a
necessidade de carbono, de nitrognio e de gua. Logo, em estudos laboratoriais, onde
as clulas microbianas so caracterizadas em relao as suas propriedades morfolgicas,
fisiolgicas e bioqumicas, h requerimento de uma variedade de elementos qumicos
como nutrientes de meios de cultivo apropriados. Estes elementos so necessrios tanto
para a sntese como para as funes normais dos componentes celulares. Os elementos
qumicos principais para o crescimento dos microrganismos so carbono, nitrognio,
hidrognio, oxignio, enxofre e fsforo.
Um meio adequado para o desenvolvimento de microrganismos deve incluir as
fontes disponveis de carbono, nitrognio, de sais inorgnicos, e dependendo do
organismo, at mesmo de vitaminas e de outros fatores de crescimento.
Carbono: usado para sntese de carboidratos, protenas, lipdeos;
Fontes de carbono: O carbono alm de ser uma fonte de energia, tambm
fonte principal de elementos estruturais e funcionais dos microrganismos. As fontes de C
geralmente empregadas so monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos.
Os monossacardeos so acares simples, como glucose (dextrose), frutose,
galactose e manose, biologicamente muito importantes para fungos. A glicose uma
fonte de C universal utilizada pela maioria dos fungos.
Os oligossacardeos so acares derivados de 2, 3 ou 4 hexoses, pela perda da
gua. Os mais comumente empregados so: maltose, celobiose, lactose e sacarose. A
no utilizao de um dissacardeo pelo fungo indica sua incapacidade de converter este
acar em hexoses, enquanto os que utilizam um dissacardeo possuem enzimas que o
hidrolisam em acares mais simples. A maltose um produto da hidrlise do amido,
sendo utilizado por quase todos os fungos.
Os polissacardeos so polmeros de acares ou derivados de acares. Do
mesmo modo, a utilizao destas fontes de C pelos fungos depende da sua capacidade
na produo de enzimas hidrolticas que degradam estes compostos em acares mais

27
simples. Portanto, somente os fungos que possuem essas enzimas so capazes de
utilizar a celulose, o amido e o glicognio, para seu crescimento e esporulao.
Nitrognio: um importante componente dos aminocidos e cidos nuclicos que
so utilizados na sntese de protenas. As clulas eucariticas no conseguem usar o
nitrognio atmosfrico (N2), somente algumas bactrias conseguem usar o N2 dando
origem a NH4. Portanto, os fungos no fixam nitrognio atmosfrico e no sobrevivem na
ausncia de uma fonte inorgnica ou orgnica deste.
Fontes de nitrognio: os fungos utilizam o N como elemento estrutural e
funcional. As protenas so compostas de substncias nitrogenadas e constituem a base
do protoplasma. Os fungos diferem na capacidade de utilizar as vrias formas de N, mas
todas as espcies crescem bem em nitrognio orgnico, como a asparagina, peptona,
casena, etc. Alguns crescem melhor quando o N inorgnico adicionado ao meio de
cultura, como nitrato de potssio, nitrato de sdio, nitrato de clcio, os quais so
equivalentes, fornecendo N ntrico, porm os seus efeitos fisiolgicos so diferentes. Do
mesmo modo, os sais de amnia orgnicos e inorgnicos so equivalentes, fornecendo N
amoniacal. Os sais de nitrato e de amnia tm efeitos opostos sobre o pH do meio de
cultura. Quando um fungo consome o nitrato, o meio se torna alcalino, porm quando a
amnia utilizada pelo fungo, o meio de cultura se torna mais cido. Em geral, os sais de
amnia de cidos inorgnicos fortes tendem a tornar o meio muito cido, em relao aos
sais de amnia de um cido fraco.
Outros elementos qumicos, tambm necessrios para a sobrevivncia de
microrganismos so o hidrognio/oxignio que se encontram presentes nos muitos
compostos orgnicos; o enxofre que participa da sntese dos aminocidos cistena,
cistina, metionina; o fsforo que constituinte dos cidos nuclicos e adenosina trifosfato
(ATP); bem como as vitaminas, que so tambm importantes, pois funcionam como
coenzimas nas reaes enzimticas (a maioria dos fungos deficiente para tiamina e
biotina).
Alm disso, temos os micronutrientes Co, Bo, Mo, etc. que so importantes na
ativao de certas enzimas.
A alterao do pH do meio impede o desenvolvimento de certos microrganismos.
A maioria dos fungos cresce melhor em condies cidas (pH 5,5 6), enquanto que o
crescimento de bactrias , geralmente, favorecido por condies aproximadamente
neutras (pH 6-8).

28
De um modo geral, os meios pobres em carboidratos e ricos em substncias de
origem vegetal induzem ou aumentam a esporulao de fungos fitopatognicos. Os
substratos sem fontes de nutrientes, como gar-gua, so comumente usados quando se
deseja que o desenvolvimento do microrganismo em estudo, se d a partir dos nutrientes
presentes no tecido contaminado, do qual se est tentando isolar esses organismos.

2. EXERCCIO
1) Esquematize o exerccio visando a demonstrao da utilizao do nitrognio por
fungos (na aula ser utilizado o fungo Verticillium sp.). Comente os possveis
resultados a serem obtidos no exerccio.

29
3. MEIOS DE CULTURA
A sobrevivncia e o suporte da vida dos microrganismos dependem do
fornecimento adequado de nutrientes e de condies para o seu crescimento. Quanto aos
nutrientes, grande parte dos microrganismos apenas necessita de substncias solveis de
baixo peso molecular, usualmente originada pela degradao enzimtica de outros
nutrientes mais complexos. Uma soluo contendo estes nutrientes designada como
meio de cultura. H uma grande quantidade de meios utilizados no isolamento, na
manuteno e na propagao de culturas puras de bactrias e de fungos fitopatognicos
ou no. Um meio adequado para o desenvolvimento de microrganismos deve incluir as
fontes disponveis de carbono, nitrognio, sais inorgnicos e, dependendo do organismo,
at mesmo de vitaminas e de outros fatores de crescimento.
Em geral, os meios de cultura so lquidos, semi-slidos ou slidos. Um meio
lquido sem agente solidificante designado por caldo nutritivo. As culturas lquidas so
usadas principalmente para aumentar o inculo de bactrias e de fungos, e para estudar a
taxa de desenvolvimento e as propriedades fisiolgicas dos organismos, quando, por
exemplo, a colnia tem de ser recuperada para pesagem ou para extrao qumica. Os
meios lquidos raramente so utilizados para fins de identificao, porque poucos fungos
esporulam bem nestas solues. Os organismos em cultura lquida podem ser cultivados
em meio parado (estacionrio) ou em meio agitado, num aparelho agitador contnuo ou
em ar estril borbulhante. A agitao proporciona aerao e uniformidade no processo de
desenvolvimento de organismos.
Um caldo nutritivo (meio lquido) suplementado com um agente solidificante,
usualmente o gar, origina um meio slido ou semi-slido. O gar um extrato de algas
marinhas, um carboidrato complexo que contm basicamente galactose e possui muito
pouco valor nutritivo. O gar muito adequado como agente solidificante porque se
liquefaz a 100 C e solidifica a 40 C. Devido a estas propriedades, os microrganismos,
em especial os patognicos, podem ser cultivados a temperaturas da ordem dos 37 C
sem receios de liquefao do meio solidificado. Um meio de cultura bem solidificado exige
uma concentrao de gar da ordem dos 1,5 a 1,8 %. Uma concentrao inferior a 1%
resulta num meio semi-slido.
Os meios slidos normalmente so utilizados no isolamento de bactrias e de
fungos para fins de identificao e de preservao de culturas. A grande vantagem e
utilidade do meio slido residem no fato da existncia de uma superfcie dura, em que os
microrganismos podem crescer adequadamente para o isolamento de colnias

30
separadas. Uma colnia bem definida e isolada constitui uma cultura pura. Alm disso, o
meio com gar dissolvido temperatura elevada, pode ser distribudo por tubos de ensaio
que, depois solidificado, servem para cultura em profundidade, para teste da produo de
gs ou, em meio inclinado para cultura em rampa, para teste de caractersticas ou
preservao de culturas.
A maioria dos meios se enquadra em trs categorias: 1) sinttico ou definido, 2)
semi-sinttico, e 3) natural ou complexo.
Os meios sintticos ou definidos so constitudos de ingredientes cuja composio
e concentrao qumica conhecida. Esses meios so teis nos estudos fisiolgicos e
descritivos, quando se torna necessrio repetir exatamente um lote anterior do meio de
cultivo ou registrar os efeitos da retirada ou acrscimo de determinada substncia.
Os meios semi-sintticos assemelham-se aos meios sintticos quanto a possurem
um conjunto conhecido de ingredientes. Porm, apresentam a diferena de que, pelo
menos alguns dos ingredientes so de composio desconhecida ou varivel. Um meio
sinttico, no qual todos os ingredientes so definidos quimicamente, pode ser
transformado em semi-sinttico, acrescentando-se uma determinada substncia, como
extrato de levedura. Sabe-se que o extrato de levedura contm certas vitaminas, mas
desconhecemse as quantidades exatas ou a existncia de outras substncias que
podem estar presentes. Os meios semi-sintticos so amplamente utilizados nos
trabalhos de rotina e oferecem opo entre os meios sintticos e naturais.
O meio natural ou complexo composto, parcial ou integralmente, por produtos
naturais, como partes de plantas (folhas, brotos, tubrculos, etc) ou de infuses ou de
extratos de materiais de origem vegetal ou animal. Os meios naturais so muito bons e
proporcionam a esporulao de fungos que, de outra forma, poderia no ocorrer. Sua
principal desvantagem que podem diferir, significativamente, de lote para lote, no
fornecendo assim resultados experimentais confiveis.

31
Exemplo de cada um destes dois
ltimos tipos de meio so
apresentado a seguir.Meio definido
NaNO2 0.1 g/L
K2HPO4 0.5 g/L
CaCO3 5.0 g/L
MgSO4 7H2O 0.2 g/L
FeSO4 7H2O 0.005 g/L
NaCl 0.5 g/L

Meio semi-sinttico
Triptona 5.0 g/L
Extrato de levedura 2.5 g/L
Glucose 1.0 g/L
gar 15.0 g/L

Alm destes, os meios de cultura podem tambm ser classificados de outras


formas:
 Meios enriquecidos: O enriquecimento se faz de modo a favorecer o crescimento de
determinado organismo. Contm alguns importantes fatores de crescimento como
vitaminas, aminocidos ou componentes do sangue.
 Meios seletivos: A utilizao deste tipo de meio permite a seleo de um
microrganismo particular de uma populao em que os microrganismos presentes no
conseguem crescer. Os aditivos para tornar estes meios seletivos so os antibiticos
ou outros compostos txicos;
 Meios diferenciais: Como o nome indica este tipo de meio permite a separao de
microrganismos de diferentes caractersticas, como a colorao das colnias ou da
regio envolvente do meio de cultura.
 Meios salinos mnimos: So meios quimicamente definidos que contm apenas os
sais inorgnicos indispensveis ao crescimento bacteriano (o exemplo de meio
sinttico apresentado anteriormente um meio salino mnimo).
Alguns meios podem ser considerados, simultaneamente, pertencerem a mais de
uma das categorias indicadas. Um gar salino de manitol, por exemplo, um meio
complexo, diferencial e seletivo.

32
Nas primeiras tentativas para isolar um patgeno desconhecido, com freqncia
utiliza-se um meio padro de isolamento. Por exemplo, gar nutritivo (NA) para bactrias
e gar-gua (AA) ou batata-dextrose-gar (BDA) para fungos causadores de doenas em
plantas. Outros meios mais especficos tambm podem ser utilizados tanto para fungos
como para bactrias. O exame microscpico do tecido infectado, freqentemente, indica o
tipo de patgeno envolvido se fungo, bactria ou actinomicetos, sugerindo desta
forma, os meios provveis a serem utilizados.

4. EXERCCIO
Preparo do meio de batata-dextrose-gar (BDA)

- BDA um meio semi-sinttico: composto em parte de material natural de composio


desconhecida e em parte de substncias conhecidas.

- BDA um meio no seletivo: permite o desenvolvimento de ampla gama de


microrganismos.

- Preparo: pesar 1,5 g de gar, 1,5 g de dextrose (glicose), juntar com 100 mL de caldo de
batata cozido (200 g de batata/ litro de gua) contidos no Erlenmeyer. Fechar com tampo
de algodo, cobrir o bocal com jornal e anotar o nmero do balco. Esterilizar em
autoclave. Aps esterilizao, verter em 3 placas de Petri, esterilizadas, no interior de
cmara assptica. Anotar nas placas o nmero do balco/turma e examinar na aula
seguinte. Observe as placas de Petri contendo meio BDA. Caso algumas placas
apresentem o crescimento de fungos e bactrias contaminantes, comentem as possveis
causas e como resolv-las.

- Observar o funcionamento da autoclave, estufa para esterilizao de vidrarias e cmara


assptica ou de fluxo laminar.

1) Diferencie os meios sintticos dos meios complexos.

33
2) O que gar?

3) Com relao ao crescimento de bactrias e fungos em meios de cultivo: a) qual o pH


mais adequado para esses microrganismos? B) Qual a preferncia desses
microrganismos em relao quantidade de protenas e carboidratos no meio?

34
5. CULTIVO E CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS

1. INTRODUO
Ao longo do tempo, os cientistas aprenderam a cultivar muitos tipos de
microrganismos em laboratrio, fazendo-os crescer e mantendo-os viveis. Os
microrganismos so cultivados em meios de cultura, que contm nutrientes, como dito
anteriormente. Alm disso, um meio fsico apropriado deve ser fornecido para um
crescimento timo. Os microrganismos apresentam grandes diferenas com relao s
condies fsicas requeridas para o crescimento. Dentre estas, destacam-se a
temperatura, oxignio, pH e luz.
A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres
humanos. No entanto, certas bactrias so capazes de crescer em temperaturas
extremas, onde a maioria dos organismos eucariticos no sobreviveria. Algumas
espcies crescem em temperaturas prximas a ponto de congelamento da gua, outras
crescem em temperaturas to altas quanto 110 oC. J o oxignio essencial para alguns,
porm txico para outros. A maioria das bactrias cresce melhor em pH neutro, mas o pH
preferido para o crescimento dos fungos o cido. Sendo assim, as condies fsicas
devem ser ajustadas no laboratrio para satisfazer as necessidades especiais de
crescimento das espcies. Uma vez que as necessidades fsicas e qumicas so
satisfeitas, possvel estudar o modo de crescimento e reproduo de uma espcie de
microrganismo. Os microbiologistas devem conhecer quais so as necessidades
especficas dos microrganismos para o crescimento, satisfazer estas necessidades e
verificar as culturas para ter certeza de que os microrganismos esto se desenvolvendo.

2. TEMPERATURA
A temperatura tem uma grande influncia no crescimento dos microrganismos.
Isso no surpresa, j que todos os processos de crescimento so dependentes de
reaes qumicas que so afetadas pela temperatura. Ao contrrio das clulas de um
mamfero, que crescem em uma variao de temperatura relativamente pequena (prximo
a 37 oC), os microrganismos podem crescer em uma faixa muito maior de temperatura.
Entretanto, esta variao pode ser maior para alguns que para outros. Por exemplo, a
variao para o Bacillus subtilis de 8 a 53 oC, uma variao de 45 oC.
Em temperaturas mais favorveis para o crescimento, o nmero de divises
celulares por hora, chamado de taxa de crescimento, geralmente dobra para cada

35
aumento de temperatura de 10 oC. Este comportamento de crescimento similar ao da
maioria das reaes catalisadas por enzimas, dando suporte ao princpio de que o
crescimento o resultado de uma srie de reaes enzimticas. A temperatura na qual
uma espcie de microrganismo cresce mais rapidamente a temperatura tima de
crescimento.
Cada espcie de microrganismo apresenta para seu crescimento uma temperatura
mnima, tima e mxima. Estas so conhecidas como temperaturas cardinais. As
temperaturas cardinais de uma espcie particular podem variar no ciclo de vida do
microrganismo e de acordo com o contedo nutricional do meio. A temperatura pode
afetar a taxa de crescimento, assim como o tipo de reproduo. A temperatura tima para
o crescimento pode no ser necessariamente a temperatura tima para toda atividade
celular.
Quando se elabora um grfico relacionando a resposta do crescimento com a
variao de temperatura, pode-se observar que a temperatura tima de crescimento est,
normalmente, deslocada para perto da variao mxima de temperatura e, acima desta a
velocidade de crescimento decresce rapidamente. Este decrscimo acontece
provavelmente porque a alta temperatura inativa sistemas enzimticos necessrios
clula.
O crescimento timo (reproduo mais rpida) representado pela parte superior
da curva. As velocidades de reproduo decrescem rapidamente quando a temperatura
est pouco acima do timo. Nas variaes extremas da temperatura a velocidade de
reproduo muito menor que na temperatura tima.
Os fungos mostram grande diversidade de comportamento nas variaes de
temperatura e ao poder de resistncia ao frio e ao calor. A temperatura no s influi no
crescimento da parte vegetativa como tambm no tamanho e nmero dos esporos. Os
fungos podem em temperaturas desfavorveis, principalmente frias, permanecer em
estado de vida latente, germinando ou voltando a desenvolverem-se desde que as
condies de temperatura se tornem propcias.
Em relao ao timo de temperatura de um fungo, importante considerar trs
fases do desenvolvimento: 1) germinao do esporo; 2) desenvolvimento do miclio e 3)
formao de novos esporos. A temperatura tima para o desenvolvimento do miclio pode
no ser tima para a formao dos esporos e germinao destes. Deste fato decorre
certa dificuldade para se determinar temperatura tima no desenvolvimento completo de
um fungo, levando naturalmente em conta a germinao do esporo, o desenvolvimento do

36
miclio e a formao de novos esporos. De maneira geral, o timo, para quase todos os
fungos, est compreendido entre 20 e 30 oC. As altas temperaturas provocam a morte das
o
clulas vegetativas, e em temperaturas superiores a 40 C poucos fungos se
desenvolvem. Alm disso, as altas temperaturas podem provocar as mutaes e
variaes comuns neste grupo de microrganismos. O estudo da resistncia dos fungos s
altas temperaturas e a determinao do ponto de morte pelo calor interessante para a
aplicao do calor no controle das doenas provocadas pelos fungos.

2.1. Classificao dos microrganismos quanto temperatura necessria para o


crescimento
Os microrganismos podem ser divididos em trs grupos primrios, de acordo com
a variao de temperatura na qual crescem melhor: 1) Psicrfilos ou microrganismos que
crescem em baixas temperaturas; 2) Mesfilos ou microrganismos que crescem em
temperaturas moderadas e 3) Termfilos ou microrganismos que crescem em altas
temperaturas (Figuras 11 e 12).

Psicrfilos: microrganismos que crescem melhor em temperaturas de 15 a 20 oC,

embora possam crescer em temperaturas mais baixas. Alguns morrem se forem expostos
temperatura ambiente (por volta de 25 oC) por um tempo curto. As razes fisiolgicas
para as baixas temperaturas requeridas por esse grupo estrito no so completamente
compreendidas. Entretanto, se a temperatura muito alta, certas enzimas e/ou a
membrana citoplasmtica podem ser danificadas. As enzimas de clulas psicrfilas so
catalisadoras mais eficientes nas reaes que ocorrem em temperaturas baixas. Tais
clulas tambm so capazes de transportarem solutos atravs da membrana
citoplasmtica em temperaturas baixas.
Existem bactrias, fungos, algas e protozorios que so psicrfilos. Eles so
encontrados em guas frias e solos tais como os oceanos e as regies polares. A maioria
dos microrganismos marinhos pertence a esse grupo. Em temperaturas de 4 a 10 oC, os
microrganismos psicrfilos deterioram o alimento estocado por perodos prolongados.
Entre as bactrias, muitas psicrfilas so membros do gnero Pseudomonas,
Flavobacterium e Alcaligenes.
Os psicrfilos foram inicialmente caracterizados como organismos capazes de
crescer a 0oC. No entanto, existem dois grupos diferentes capazes de crescerem nesta
temperatura. Um grupo, contendo somente os psicrfilos, pode crescer a 0 oC, mas sua
temperatura tima de crescimento se localiza em 15 oC. A maioria desses organismos

37
extremamente sensvel a altas temperaturas, sendo incapaz de crescer, por exemplo, a
20 oC. So os organismos encontrados principalmente nas profundezas dos oceanos e
em certos locais da regio rtica e, em geral, no causam problemas na preservao dos
o
alimentos. O outro grupo de organismos capaz de crescer a 0 C apresenta seu
o
crescimento timo nas temperaturas de 20 a 30 C. Estes tipos de organismos aparecem
mais freqentemente que os psicrfilos e como podem crescer em temperaturas utilizadas
em refrigeradores so mais encontrados em alimentos estragados. Esses organismos so
conhecidos como psicrotrficos e so responsveis pela degradao dos alimentos.

Mesfilos: A maioria dos microrganismos mesfilo, crescendo melhor em

temperaturas que variam de 25 a 40 oC. As bactrias saprfitas, os fungos, as algas e os


protozorios crescem no limite mnimo da variao de temperatura mesoflica. Os
microrganismos parasitrios de humanos e animais crescem no limite mximo dessa
variao. Aqueles que so patognicos para o homem crescem melhor em torno da
temperatura corporal, que 37 oC. A temperatura tima de crescimento de muitas
bactrias patognicas fica em torno de 37 oC e, portanto, as incubadoras empregadas em
laboratrios clnicos utilizam normalmente esta temperatura. A temperatura elevada de
uma febre pode inibir o crescimento de alguns patgenos.
Entre os mesfilos encontramos a maioria dos organismos que comumente
degradam os alimentos e que so patognicos.

Termfilos: A maioria dos termfilos cresce a temperaturas em torno de 40 a 85 oC,

mas eles crescem melhor entre 50 e 60 oC, aproximadamente temperatura da gua


presente em uma panela de gua quente. Esses microrganismos podem ser encontrados
em reas vulcnicas, em mistura de fertilizantes e em nascentes quentes. A maioria dos
microrganismos termoflicos procaritico, sendo que nenhuma clula eucaritica
conhecida cresce em uma temperatura superior a 60 oC (Figura 12).
Um fato impressionante que muitos termfilos no so capazes de crescer em
temperaturas abaixo de 45 oC. Existem muitos fatores que capacitam os termfilos, como
o Bacillus stearothermophilus, a crescer em temperaturas elevadas. As enzimas dos
termfilos so produzidas mais rapidamente que as enzimas dos mesfilos, por isso
aquelas que so danificadas pelas altas temperaturas so rapidamente substitudas.
Entre os procariotos, certas arqueobactrias so capazes de crescer acima do ponto de
ebulio da gua. Por exemplo, o Pyrodictium occultum pode crescer a 110 oC, o
Pirococcus woesei cresce a 104,8 oC e o Thermococcus celer cresce a 103 oC. Estes

38
organismos tm sido isolados de sedimentos prximos s fendas do solo ocenico, que
esguicham guas superaquecidas. Os ribossomos, as membranas e as vrias enzimas
das bactrias termfilas funcionam melhor a altas temperaturas que a baixas
temperaturas. A perda de funo da membrana citoplasmtica em baixas temperaturas
pode ser o que determina a temperatura de crescimento mnimo dos termfilos.
Os endsporos formados pelas bactrias termoflicas normalmente so resistentes
ao calor podendo sobreviver ao tratamento por aquecimento utilizado em alimentos
enlatados. A elevao da temperatura nos alimentos estocados pode permitir a
germinao destes endsporos, desta forma degradando os alimentos. No entanto, estes
termfilos no so considerados um problema de sade pblica.
A figura 12 classifica alguns microrganismos quanto temperatura necessria
para o seu crescimento. Os procariotos so mais versteis, com a habilidade de crescer
entre a temperatura de 0C a 100 C. Os nicos microrganismos capazes de crescer em
temperatura acima de 92 C so as Archaea.

Figura 11. Curvas de crescimento caractersticas de diferentes microrganismos em


resposta variao na temperatura

39
Figura 12. Temperatura tima de crescimento para diversas formas de vida.

3. LUZ
Para os organismos auttrofos fotossintetizantes, a luz necessria. Por outro
lado tem pouco efeito evidente no crescimento da maioria das bactrias e fungos, embora
possa ter um efeito muito importante na disperso de esporos e na maturao de fungos.
sabido que o raio ultravioleta do espectro solar tem grande poder germicida. As
bactrias e muitas outras clulas vivas so suscetveis luz ultravioleta (tambm aos
raios-X), que prontamente as matam. A exposio a doses subletais pode causar
mutaes. A luz ultravioleta freqentemente utilizada para esterilizao.
impossvel generalizar sobre o efeito da luz no crescimento dos fungos. Muitas
espcies crescem igualmente na luz ou no escuro, outras so estimuladas definitivamente
pela luz, ainda outras so afetadas negativamente pela luz. Podemos afirmar que a luz
influi diferentemente sobre o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo; na primeira fase,
os fungos preferem a obscuridade ou luz difusa para desenvolver o miclio, e, na

40
segunda, procuram a luz para formar as frutificaes. Certos fungos hialinos, quando
expostos diretamente luz, morrem.
Denomina-se fototropismo a influncia da luz na direo do crescimento. Os
corpos de frutificao de alguns fungos so orientados para a luz, e possvel que em tal
caso o fototropismo represente uma adaptao para melhor disseminao dos esporos. O
desenvolvimento vegetativo quase sempre negativamente fototrpico. Estas respostas
ao estmulo da luz so admiravelmente adaptadas a fim de permitir aos rgos de
reproduo, que so produzidos ou dispostos irregularmente no substrato, liberar seus
esporos, de maneira que escapem livremente para o ar. De maneira geral, a luz mostra
ao fungo o caminho para o espao onde ele deve lanar seus esporos.
prtica comum nos laboratrios expor as placas contendo fungos luz, a fim de
provocar a formao das frutificaes em fungos que na escurido ou luz difusa s
formam o sistema vegetativo.

4. OXIGNIO
Os microrganismos variam em sua necessidade ou tolerncia a oxignio. Dessa
forma, os microrganismos podem ser divididos em quatro grupos dependendo da resposta
ao oxignio. 1) Aerbios so espcies que normalmente requerem O2 para o crescimento
e podem crescer em atmosfera padro de 21 % de O2; 2) Microaerfilos so organismos
que, assim como os aerbios, podem utilizar O2 nas reaes qumicas para a produo de
energia. Entretanto, ao contrrio daqueles, eles no podem resistir a nveis de O2 (21 %)
presentes na atmosfera e normalmente crescem melhor em nveis de O2 variando de 1 a
15 %; 3) Anaerbios so espcies que podem ser mortos pelo oxignio, no podem
crescer em presena do ar e no utilizam oxignio para as reaes de produo de
energia. Alguns anaerbios podem tolerar baixas concentraes de O2, mas anaerbios
estritos so mortos por uma breve exposio ao gs; 4.) Facultativos so aqueles que
crescem na presena de O2 ou podem tambm crescer em anaerobiose. Eles no
requerem oxignio para o crescimento, embora possam utiliz-lo para a produo de
energia em reaes qumicas. Sob condies anaerbicas, eles obtm energia por um
processo metablico chamado fermentao. Ex. gneros da famlia bacteriana
Enterobacteriacea (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisae).

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5. PH
Ao contrrio da temperatura tima, o pH timo para o crescimento encontra-se no
valor mediano da variao de pH sobre o qual o crescimento acontece. O pH timo
normalmente bem definido para cada espcie. A maioria dos ambientes naturais possui
valores de pH entre 5 e 9, e dentro desse alcance, encontram-se a maioria dos
microrganismos. Poucas espcies podem crescer em valores de pH abaixo de 2 ou maior
que 10. Os organismos que sobrevivem em pH baixo so denominados de acidfilos. E
os que sobrevivem em pH alto, s vezes superior a 10-11, so conhecidos como
alcalfilos.
Para o microrganismo crescer em meio cido ou bsico (alcalino), este deve ser
capaz de manter o seu pH intercelular prximo neutralidade a fim de prevenir a
destruio de macromolculas na clula, sendo que, o pH timo ao crescimento
representa o pH do ambiente extracelular.
Entre as Eubacterias e Archaea h uma ampla variao do pH timo para o
crescimento, podendo variar de 0 a 11. J crescimento da maioria das bactrias de solo
requerido o pH prximo ao neutro. Fungos filamentosos crescem melhor na variao de
pH de 4 a 6.
Quando os microrganismos em crescimento ativo so cultivados em meio de
cultura, o pH do meio sofrer alteraes medida que os compostos cidos ou alcalinos
so produzidos. Esta mudana no pH pode ser to grande que o crescimento posterior
inibido; tais variaes so prevenidas pela adio de tampo ao meio.

6. EXERCCIOS
1) Influncia da temperatura
Placas de Petri contendo BDA devero receber um disco de meio contendo miclio
(0,5 cm dimetro) de Sclerotinia sclerotiorum. As placas, em nmero de 3 por balco,
sero marcadas (turma/balco/temperatura) e incubadas no escuro a 5, 20 e 30 oC
durante duas semanas. Aps o perodo de incubao, o crescimento vegetativo (dimetro
da colnia em cm) nas diferentes temperaturas ser avaliado em aula, sendo os
resultados obtidos discutidos no tocante ao efeito da temperatura nesses processos.

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Avaliao dos resultados Anotar no quadro a seguir o dimetro (em cm) do
crescimento da colnia fngica nas diferentes temperaturas.

Dimetro (cm)
Balco 5 oC 20 oC 30 oC
1
2
3
4
5
Mdia

2) Descreva os trs grupos de microrganismos conforme a variao de temperatura na


qual eles crescem.

3) Influncia da luminosidade
Placas de Petri contendo BDA devero receber um disco de meio contendo miclio
(0,5 cm dimetro) de Alternaria tenuis. As placas, em nmero de 2 por balco, sero
marcadas (turma/balco) e incubadas sob fotoperodo c/ luz UV ou escuro (embrulhar a
placa de Petri c/ papel alumnio) a 20-22 oC durante duas semanas. Aps o perodo de
incubao, o crescimento vegetativo (dimetro da colnia em cm) e o nmero de
esporos/mL sero avaliados em aula, sendo os resultados obtidos, discutidos no tocante
ao efeito da luz nesses processos.
Clculo do no de esporos / campo adicionar volume fixo de gua (1-5 mL) nas placas,
raspar a superfcie da colnia com ala de vidro e contar o nmero de esporos / campo
(escolher aumento adequado).

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Avaliao dos resultados: Anotar na tabela a seguir, o dimetro (em cm) do crescimento
da colnia fngica e a esporulao na presena e na ausncia de luz.

BALCO COM LUZ SEM LUZ


Dimetro Esporulao Dimetro Esporulao
(cm) (n esporos/campo) (cm) (n esporos/campo)
1
2
3
4
5
Mdia

3) Influncia do oxignio

Placas de Petri contendo BDA devero receber 30 L de suspenso bacteriana,

que severa ser espalhada com o auxilio da ala de Drigalsk. Em seguida, devero flambar
3 lamnulas e coloc-las sobre o meio de cultura. As placas, em nmero de 2 por balco,
sero marcadas (turma/balco) e incubadas por uma semana em temperatura ambiente.
Aps esse perodo as placas sero avaliadas em aula.

4) Descreva os quatro grupos fisiolgicos dos microrganismos baseados na resposta ao


oxignio livre.

5) Qual a variao de pH ideal para o crescimento da maioria das bactrias? E dos


fungos?

6) Considerando o pH do ambiente e o da clula, qual a diferena entre acidfilo e


alcalfilos? Em qual condio eles so similares?

44
6 - CONTROLE QUMICO E FSICO DE MICRORGANISMOS

1. INTRODUO
Podemos citar inmeras funes benficas de microrganismos para o ambiente,
dentre elas, a produo de antibiticos, reciclagem de matria orgnica na natureza,
simbiose com espcies vegetais, e vrios outros exemplos. Entretanto, sabe-se que
muitos microrganismos podem ser prejudiciais em diversas situaes, podendo atuar
como agentes patognicos ou como agentes degradantes de materiais de importncia
econmica (tecidos, madeiras, alimentos, etc). Sendo assim, torna-se necessrio
tomada de medidas que atuem no controle de microrganismos. As principais razes para
o controle de microrganismos podem ser resumidas como se segue:
 Prevenir a transmisso de doena e infeco;
 Prevenir a contaminao ou crescimento de microrganismos nocivos;
 Prevenir a deteriorao e dano de materiais por microrganismos.
Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por diferentes
agentes qumicos ou fsicos. Uma grande variedade de tcnicas e de agentes pode ser
utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu prprio limite de aplicao prtica.
Esses agentes antimicrobianos inibem ou matam os microrganismos pela
destruio de certas estruturas das clulas, como a parede celular ou a membrana
citoplasmtica ou substncias presentes no citoplasma, como enzimas, ribossomos ou
material nuclear. O conhecimento do mecanismo de ao de uma agente antimicrobiano
de grande valor para tomar decises de aplicaes prticas.

2. AGENTES QUMICOS
Os agentes qumicos so usados para matar ou inibir o crescimento de
microrganismos em tecidos vivos (como anti-spticos) e em objetos inanimados (como
desinfetantes). H centenas de diferentes produtos qumicos utilizados para o controle de
microrganismos. No entanto, nenhum agente qumico nico o melhor ou o ideal para
qualquer ou toda finalidade. Dessa forma, algumas especificaes podem orientar a
preparao de novos compostos e devem ser consideradas nos mtodos de avaliao
dos desinfetantes destinados ao uso prtico. Essas especificaes so:
- atividade antimicrobiana em baixas concentraes;
- solubilidade em gua ou em outros solventes (como o lcool);
- estabilidade;

45
- ausncia de toxicidade ao homem e animais;
- homogeneidade;
- inativao mnima por material estranho (protenas ou orgnicos);
- atividade em temperatura ambiente ou corporal;
- poder de penetrao;
- ausncia de poderes corrosivos e tintoriais;
- desodorizante;
- capacidade detergente;
- disponibilidade e baixo custo.
Os agentes antimicrobianos utilizados para desinfeco ou anti-sepsia so
divididos em vrios grupos: fenol e compostos fenlicos, lcoois (lcool etlico e
isoproplico), corantes, halognios (iodo e cloro), metais pesados e seus compostos,
detergentes, compostos quartenrios de amnio, biguanidas, e aldedos (formaldedos e
glutaraldedos). A Tabela 1 apresenta um resumo dos principais agentes qumicos e seu
mecanismo de ao no controle de microrganismos.

TABELA 1. Mecanismo de ao de alguns agentes qumicos.

Agente Mecanismo de ao
lcool Desnaturam protenas e rompem a membrana lipdica.
Aldedos Inativam protenas formando ligaes cruzadas covalentes
com vrios grupos funcionais orgnicos.
Compostos quart. de Desnaturam protenas das clulas, interferncia com os
amnio processos metablicos e leso da membrana citoplasmtica.
Fenol e seus derivados Lesam as clulas microbianas pela alterao da
permeabilidade seletiva da membrana citoplasmtica,
causando perda das substancias intracelulares vitais, alm
disso, desnaturam e inativam as protenas.
Halognios O iodo e seus componentes destroem compostos metablicos
essenciais por meio da oxidao. O cloro e seus derivados
impedem o funcionamento do sistema enzimtico celular.
Metais pesados Inativam as protenas celulares combinando-se com algum
componente da protena, por exemplo, o cloreto de mercrio
inativa enzimas que contm grupos sulfidrilas (-SH).

46
3. AGENTES FSICOS:
Em condies naturais, as alteraes das condies ambientais podem apresentar
efeitos inibitrios seletivos ou mesmo letais aos microrganismos, no entanto, a proporo
dessa inibio ou morte de microrganismos depende, em parte, da intensidade das
condies fsicas. Devido necessidade de eliminao de populaes microbianas,
numerosos agentes fsicos podem ser escolhidos para essa finalidade. A Tabela 2 lista
alguns desses agentes e seu mecanismo de ao.

TABELA 2. Mecanismo de ao dos agentes fsicos.

Agentes Mecanismo de ao
Temperatura alta
1. Calor mido - vapor dagua Desnaturao protenas
2. Calor mido - gua fervente Desnaturao protenas
3. Calor mido - pasteurizao Desnaturao protenas
4. Calor seco - chama direta Queima os contaminantes at se tornarem cinzas
5. Calor seco - incinerao Queima at se tornarem cinzas
6. Calor seco - ar quente Oxidao
Temperatura baixa
1. Refrigerao Reduo das reaes qumicas e possveis
alteraes nas protenas
2. Congelamento Reduo das reaes qumicas e possveis
alteraes nas protenas
3. Liofilizao Reduo das reaes qumicas e possveis
alteraes nas protenas
Radiao
1. Ionizante Destruio do DNA por raios gama e raios X
2. No ionizante Leso ao DNA pela luz UV com lmpada UV
(germicida)
Filtrao Separao das bactrias do lquido de suspenso
Dessecao Interrupo do metabolismo
Presso osmtica Plasmlise

47
3.1. Temperatura
Altas e baixas temperaturas realizam papel importante no controle de
microrganismos. A temperatura elevada, combinada com alto grau de umidade representa
um dos mtodos mais efetivos para a destruio dos microrganismos. Em qualquer
processo antimicrobiano, importante distinguir o calor seco e mido. O calor mido
(vapor dgua sob presso, gua fervente, pasteurizao) mata os microrganismos por
coagulao de suas protenas e muito mais rpido e eficiente do que o calor seco
(forno), o qual destri os microrganismos por oxidao de seus constituintes qumicos. O
mtodo que utiliza temperaturas extremas para matar os microrganismos a incinerao,
o qual utilizado para a eliminao de carcaas de animais de laboratrio infectadas ou
de materiais contaminados. A destruio de microrganismos pelo calor direto , tambm,
praticada rotineiramente quando a agulha de inoculao (ou ala de platina) levada
chama de um bico de Bunsen.
As temperaturas inferiores ao ponto timo de crescimento diminuem o ritmo
metablico e, sendo a temperatura suficientemente baixa, cessa o metabolismo e o
crescimento, entretanto, no mata o microrganismo.

3.1.1. Calor mido


O aparelho mais usado para esterilizar vidrarias e meios de cultura a autoclave
(Figura 13). As autoclaves trabalham semelhana de panelas de presso domsticas.
As autoclaves de laboratrio operam normalmente sob uma presso de 1 atmosfera a
uma temperatura de 121 C, esterilizando a maioria dos materiais em 15-30 minutos.
Sendo a variao do tempo de esterilizao devida relao superfcie/volume dos
materiais a serem esterilizados.
Aspectos da esterilizao por calor mido:
- Temperatura
Uma temperatura de 121 C oferece uma boa margem de segurana se for
mantida durante um perodo de tempo apropriado. Os endsporos das bactrias so as
formas de vida mais resistentes ao calor, e a sua destruio pode ser conseguida se for
aplicado vapor sob presso.
- Umidade
A umidade em conjunto com temperaturas amenas coagula o protoplasma
bacteriano, e medida que esta removida, a temperatura necessria para haver

48
coagulao deve ser elevada rapidamente. Se o vapor for sobre aquecido ficar mais
"seco", o que ocasionar um aumento da temperatura e do tempo de exposio para a
esterilizao, que em situao extrema de esterilizao em calor seco ser de 170 C
durante uma hora. Em concluso, vapor excessivamente quente perde alguma da sua
eficincia como agente letal alm de poder danificar os materiais a serem tratados.
- Presso
A presso, nos valores usados na autoclave, por si s no exerce qualquer efeito
na esterilizao, sendo til para elevar a temperatura do vapor acima dos 100 C.
- Tempo
O tempo necessrio para que o vapor penetre e aquea os materiais a serem
esterilizados. Mesmo quando as temperaturas de esterilizao so atingidas, os esporos
(e as clulas vegetativas) no so todos mortos de uma vez. A velocidade de morte
uma constante a uma dada temperatura, e para cada unidade de tempo de exposio ao
agente letal, uma proporo constante de uma dada populao morta. Normalmente
so necessrios de 11 a 12 minutos a 121 C (calor mido) para matar os endsporos das
bactrias termoflicas.
- Purga
O ar relativamente frio na cmara de esterilizao muito mais pesado que o
vapor temperatura de esterilizao. Se no for permitida a sada do ar cria-se uma
estratificao na autoclave que conduz a uma falta de uniformizao das temperaturas
desenvolvidas. Uma vez que o ar e o vapor so lentos a misturarem-se, a diferena de
temperatura entre camadas pode ser muito grande, por isso a necessidade de se
substituir todo o ar por vapor (purga).
- Natureza do carregamento
Geralmente, os materiais mais volumosos requerem um maior tempo de
esterilizao, sendo prefervel esterilizar pequenos volumes de cada vez (Tabela 3). Por
exemplo, prefervel esterilizar 5 bales de um litro cada do que esterilizar apenas um
balo com cinco litros. Os frascos devem ser tapados com algodo ou papel. Se for
necessrio usar rolhas rosqueadas, estas devem ir pouco apertadas para a autoclave, de
modo a permitirem a troca de gases, evitando-se assim a quebra de frascos na autoclave.

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TABELA 3. Tempo requerido para esterilizao de lquidos em autoclave de acordo com o
volume.
Volume do recipiente Minutos de exposio a 120 C e 1 atm.
Erlenmeyer de 1000 mL 17-20
Erlenmeyer de 500 mL 15-17
Erlenmeyer de 250 e 125 mL 12-15
Tubos de ensaio 12-15

Figura 13. Esquema de autoclave usada em aula prtica.

Procedimento para operao da autoclave:


- Verificar as tampas dos frascos (no apertadas, para permitir a troca de gases com o
exterior);
- Introduzir na autoclave o material a esterilizar;
- Fechar a autoclave e apertar a tampa seguindo os cuidados adequados recomendados;
- Abrir a torneira de sada de vapor para permitir a purga do ar no interior;

50
- Ligar a corrente eltrica e colocar o termostato para a posio mxima;
- Aguardar que a corrente de vapor que sai pela torneira seja bastante intensa;
- Fechar a torneira de sada do vapor;
- Aguardar que o termmetro atinja a temperatura de esterilizao desejada (121 C), ou
que o indicador de presso marque 1,02 Bar;
- Reduzir a potncia do termostato de modo a manter constante a temperatura;
- Atingida a temperatura de esterilizao, iniciar a contagem do tempo (por exemplo, 20
minutos);
- Desligar a autoclave;
- Aguardar at o indicador de presso indicar 0;
- Abrir a torneira de purga (pode ainda haver presso e o ar estar muito quente);
- Abrir cuidadosamente a autoclave. Remover os materiais esterilizados, (ATENO: os
materiais esterilizados podem estar muito quentes);
- Depois do arrefecimento conveniente fechar os frascos mal rosqueados.

3.1.2. Calor Seco


O calor seco usado para esterilizar material de vidro, outros materiais slidos
termoestveis e alguns componentes de meios ou alimentos que ficariam imprprios se
expostos ao vapor. Trata-se tambm de um dos mtodos de esterilizao mais usados e
de fcil aplicao. O equipamento indispensvel uma estufa de alta temperatura (160
200 C). Geralmente, a esterilizao feita a 180 C, durante duas horas. Entretanto,
outras temperaturas podem ser indicadas (Tabela 4).

TABELA 4. Temperatura e tempo necessrios para esterilizao de vidrarias em estufa.


Temperatura (C) Tempo de exposio (min)
170-180 60
160 120
150 150
140 180
121 Durante 1 dia ou 1 noite

O calor seco necessrio para remover toda umidade do material. Antes do


processo de esterilizao, deve-se ter o cuidado de envolver o material com papel jornal
ou outro tipo, para evitar contaminaes posteriores, quando da estocagem da vidraria.

51
A esterilizao de objetos metlicos tais como, pina, ala de platina, escalpelo e
outros, pode ser feita atravs do calor seco, fornecido pela chama de um bico de Bunzen
ou similar. A passagem do material na chama comumente conhecida como flambagem.

3.2. Esterilizao por gases


O recente incremento do uso de material de plstico descartvel, como seringas,
placas de Petri, tubos de cultura, filtros, etc, levou ao desenvolvimento de uma nova forma
de esterilizao que usa gases txicos para a eliminao dos microrganismos de
materiais termo-sensveis. A aplicao desta tcnica requer a utilizao de equipamentos
prprios, que forcem a circulao do gs txico atravs de todas as superfcies dos
materiais, o que a torna de difcil utilizao em laboratrios de tipo no industrial.
O xido de etileno o gs usado com maior freqncia neste tipo de esterilizao.
Este gs, ao contrrio de muitos produtos qumicos txicos, pouco corrosivo e no
altera os materiais a serem esterilizados, sendo facilmente removido por arejamento. As
suas desvantagens incluem a necessidade de longos perodos de exposio para se
obter esterilizao (vrias horas), a reatividade com componentes do meio e certos tipos
de plsticos e a necessidade de equipamentos prprios e disponibilidade do gs.

3.3. Radiaes
A radiao tem vrios efeitos sobre as clulas, dependendo de seu comprimento
de onda, intensidade e durao. Existem dois tipos de radiao que mata
microrganismos: ionizante e no-ionizante. A radiao ionizante, como os raios gama e X,
possui um comprimento de onda mais curto que 1 nm. A radiao no-ionizante , como a
luz ultravioleta (UV), tem comprimento de onda entre 1 nm e cerca de 380 nm, onde o
espectro visvel comea.
Radiao ionizante tem energia suficiente para causar a ionizao de molculas,
isto , conduzir eltrons constantemente e romper as molculas em tomos ou grupo de
tomos. Por exemplo, molculas de gua so quebradas em radicais hidroxilas (OH-) e
ons de hidrognio (H+), e os radicais hidroxila so altamente reativos e destroem
compostos celulares como DNA e protenas. As radiaes ionizantes podem tambm
atuar diretamente nos constituintes vitais da clula, inclusive os microrganismos. Dessa
forma, a grande vantagem desse agente a capacidade de penetrar em pacotes e
produtos e esterilizar seus interiores.

52
Radiao no-ionizante excita os eltrons, resultando em uma molcula que reage
diferentemente das molculas no-irradiadas. A luz UV danifica o DNA das clulas
expostas, produzindo ligaes entre as timinas adjacentes nas cadeias de DNA. Estes
dmeros de timina inibem a replicao correta do DNA durante a reproduo da clula.
Lmpadas especiais que emitem luz UV tm pouca capacidade de penetrar na
matria e somente microrganismos da superfcie de um objeto so mortos pela radiao.
Uma camada fina de vidro ou gua pode impedir a ao da luz. Ainda assim, esta forma
de radiao comumente utilizada para reduzir o nmero de microrganismos no ar, em
superfcie de salas cirrgicas e em cmaras asspticas onde produtos esterilizados so
distribudos em garrafas ou ampolas estreis, no entanto, no pode ser operada quando
pessoas esto presentes.

3.4. Filtrao
A filtrao a passagem de um lquido ou gs atravs de material semelhante a
uma tela, com poros pequenos o suficiente para reter os microrganismos. Um vcuo que
criado no frasco de recepo auxilia a gravidade a puxar o lquido atravs do filtro
(Figura 14). Os filtros so utilizados no laboratrio e na indstria para esterilizar materiais
sensveis ao calor, como protenas, acares, soros animais, e algumas vitaminas ou
antibiticos.

Figura 14. Conjunto com membrana filtrante utilizada para filtrao de lquidos sob
presso negativa (bomba a vcuo) (Fonte: Madigan et al., 1996).

53
3.5. Presso Osmtica
Altas concentraes de substncias, como sais e acares, dissolvidas em um
lquido resultam em solues que exercem um efeito osmtico marcante sobre as clulas.
Muitos microrganismos quando colocados em um meio ou soluo contendo elevadas
quantidades de material dissolvido tem o crescimento paralisado em virtude da
possibilidade do estabelecimento de um equilbrio entre a soluo no interior da clula e a
soluo no meio externo. A gua passar do interior da clula para a soluo externa.
Como resultado, as clulas tornam-se desidratadas, o que evita o crescimento.
Entretanto, alguns microrganismos mostram-se capazes de tolerar altssimas
concentraes de sal ou acar.
A turgidez celular caracterizada pela maior concentrao de solutos dissolvidos
em seu interior, quando comparado com o meio externo. Estes solutos so mantidos na
clula pela presena de uma membrana semipermevel. Sendo assim, a gua pode se
difundir livremente pela membrana, igualando as concentraes da soluo intra e
extracelular. Partindo-se destas informaes, pode-se afirmar que a adio de solutos (sal
ou acar) no meio pode ocasionar um desequilbrio na presso osmtica celular,
podendo causar uma ruptura na sua estrutura.
Em sua maior parte, contudo, os microrganismos so inibidos por altas
concentraes de sal (10 a 15 %) e de acar (50 a 70 %), fato que fundamenta os
mtodos de conservao de alimentos por salgamento ou por solues concentradas de
acar. Em tais situaes, o mecanismo de inibio microbiana a plasmlise: as clulas
so desidratadas, tornando-se inaptas para metabolizar ou crescer, o que pode levar
morte.

4. EXERCCIO
1) Material a ser preparado na aula. Repicar a bactria Bacillus subtilis para tubos de
ensaio contendo caldo glicosado com as seguintes concentraes de NaCl, em
porcentagem: 0; 5; 15; 25%. Colocar uma ala de inculo da bactria / tubo. Incubar para
a prxima aula.

2) Compare a eficcia do calor seco e do calor mido como mtodos de esterilizao.

3) O que significa autoclavagem? O que uma autoclave?

54
7 - CONTROLE BIOLGICO DE MICRORGANISMOS ANTAGONISMO

O antagonismo a inibio de uma espcie de microrganismo por outra atravs de


um ou mais mecanismos de interaes antagnicas.
A produo de um antibitico por um microrganismo um exemplo clssico de
antagonismo microbiano. Entretanto, existem muitas outras formas de antagonismo, como
por exemplo, no caso de alguns fungos que produzem cianeto em concentraes que so
txicas para outros microrganismos, e algumas algas que produzem cidos graxos
antibacterianos. O metano, o sulfeto e compostos volteis que contm enxofre,
produzidos por alguns microrganismos do solo podem inibir outras espcies.
Antibiticos, por sua vez, so substncias orgnicas produzidas por
microrganismos que, em concentraes baixas, so deletrias ao crescimento ou
atividade metablicas de outros microrganismos, podendo ser especficos ou de amplo
espectro de ao. Entre os efeitos provocados pelos antibiticos, podem ser observadas a
reduo ou paralisao do crescimento e esporulao, reduo na germinao de
esporos, alm de distores na hifa.
Metablitos antifngicos so, muitas vezes, produzidos por microrganismos que
sobrevivem no solo, principalmente fungos, bactrias e actinomicetos, e exercem um
grande papel no antagonismo entre microrganismos. Dentre os fungos que possuem
informao gentica para a produo de substncias inibidoras, antibiticas ou no,
destacam-se os gneros Trichoderma e Penicillium. Os primeiros trabalhos cientficos
provando a produo de antibiticos por Trichoderma spp. foi demonstrado na dcada de
70 que isolados deste gnero foram capazes de produzir metablitos volteis e no
volteis, com efeito inibitrio sobre o crescimento de vrios fungos.
O termo antagonista empregado para designar agentes biolgicos com potencial
para interferir nos processos vitais dos fitopatgenos, estando estas raas ou espcies de
microrganismo adaptadas ecologicamente ao mesmo tecido das plantas que os ocupados
pelos patgenos, mas no sendo patognicas s mesmas, enquanto que, o termo formas
de antagonismo designa os mecanismos pelos quais os antagonistas agem sobre os
patgenos.
Os mecanismos bsicos de antagonismo podem ser divididos em:
 Antibiose: interao entre organismos, na qual um ou mais metablitos produzidos
pelo antagonista tm efeito negativo sobre o outro microrganismo, resultando na
inibio do crescimento e/ou germinao (Figura 15);

55
Figura 15. Antibiose de isolados de Pseudomonas sp contra Dreshlera avenae

 Competio: interao entre dois ou mais organismos empenhados na mesma ao,


ocorrendo principalmente por alimentos (carboidratos, nitrognio e fatores de
crescimento), por espao e por oxignio;
 Parasitismo: fenmeno em que determinado microrganismo estabelece relaes em
nvel celular com um hospedeiro e se nutre das estruturas vegetativas e/ou
reprodutivas do mesmo. Essas interaes fsicas entre parasita e fitopatgenos tm
como conseqncia alteraes, tais como: perfuraes de hifas, destruio de
estruturas de resistncia e de reproduo dos fitopatgenos (exemplo, Trichoderna
harmazianum parasitando Rhizoctonia solani (Figura 16);

Fonte: Mello (1998)


Figura 16. Trichoderma harmazianum parasitando Rhizoctonia solani

 Hipovirulncia: literalmente significa virulncia subanormal, ou seja, introduo de


linhagem do patgeno menos agressiva ou no patognica, que pode transmitir esta
caracterstica para as linhagens patognicas;
 Predao: quando um organismo obtm alimento a partir de outro organismo. Ao
contrrio do parasitismo, os participantes no estabelecem relaes celulares (por
exemplo, amebas so encontradas predando Gaumannomyces graminis f. sp. e
outros fungos);

56
 Induo de resistncia: um fenmeno onde a resistncia de plantas contra
patgenos induzida sistematicamente atravs do tratamento com microrganismos ou
seus metablitos ou atravs de compostos orgnicos ou inorgnicos.
Apesar destas divises, um antagonista pode atuar atravs de um ou mais
mecanismos, o que constitui uma caracterstica muito desejvel, pois as chances de
sucesso no caso do controle biolgico sero aumentadas. Alm disso, os mecanismos
no so mutuamente exclusivos ou excludentes, pois sua importncia relativa pode variar
com as condies ambientais e estados de desenvolvimento do agente biocontrolador e
do fitopatgeno.

EXERCCIO
Interao antagnica (antibiose) envolvendo Bacillus sp. e fungos fitopatognicos.

Transferir assepticamente para o centro de uma placa de Petri, contendo o meio


de BDA, um disco de um dos fungos fitopatognicos (inculo) fornecido na prtica.
(IMPORTANTE: Se possvel utilizar fungos fitopatognicos diferentes em cada
balco) retirado da cultura fornecida (fungos em placa de Petri com meio BDA). A seguir,
transferir o inculo bacteriano (fornecido em tubo de ensaio ou placa contendo meio para
crescimento de bactrias) para quatro pontos da placa e a 2 cm dos bordos da mesma.
Preparar uma placa testemunha contendo apenas o fungo fitopatognico usado pelo
balco (sem antagonista) / balco. Anotar o no do balco e a turma na placa. Incubar em
condies de laboratrio e avaliar na semana seguinte.
Exemplo:

B F = Fungo
B = bactria (Bacillus)
B F B Avaliao dos resultados (prxima aula)

1) Esquematize o desenvolvimento diferenciado observado para as colnias fngicas na


placa testemunha e na placa contendo a Bactria (Bacillus sp).

2) Demonstre experimentalmente um mecanismo de interao antagnica?

57
3) Quais as principais estratgias na utilizao do controle biolgico de doenas de
plantas?

58
8 - PRODUO DE EXOENZIMAS

1. INTRODUO
Os microrganismos fitopatognicos geralmente necessitam de seus respectivos
hospedeiros para garantir a sua sobrevivncia. Sendo assim, a maioria deles retira seus
nutrientes do hospedeiro utilizando-os para seu prprio metabolismo. Porm, muitos
desses nutrientes encontram-se no interior do protoplasma das clulas vegetais, e para
alcan-los, os patgenos devem vencer as barreiras externas formadas pela cutcula
e/ou parede celular, assim como promover a colonizao interna dos tecidos da planta.
Os patgenos podem ganhar acesso ao interior dos hospedeiros atravs da
penetrao direta, aberturas naturais da planta ou ferimentos. A penetrao direta pode
ocorrer exclusivamente atravs de fora mecnica aplicada por estruturas especficas de
alguns poucos fungos sobre o hospedeiro. Porm, quase na sua totalidade, este processo
acompanhado pela secreo de enzimas. Depois de penetrar na planta, os patgenos
podem se espalhar e colonizar o tecido do hospedeiro, sendo este processo normalmente
caracterizado pela degradao celular e pela utilizao de nutrientes, resultando em
alteraes na morfologia e no metabolismo, levando ao aparecimento dos sintomas da
doena.
Dessa forma, para um patgeno infectar uma planta, necessrio que ele consiga
penetrar e colonizar os tecidos do hospedeiro, retirar os nutrientes necessrios para sua
sobrevivncia, bem como neutralizar as reaes de defesa da planta, utilizando para isso
substncias como enzimas, toxinas e hormnios. A importncia dessas substncias varia
grandemente nas interaes hospedeiro-patgeno. Por exemplo, no caso das podrides
moles, as exoenzimas so aparentemente as substncias mais importantes.
Entre os fitopatgenos conhecidos, com exceo dos vrus e virides, todos
produzem enzimas, hormnios e, possivelmente, toxinas, sendo que, de maneira geral, as
enzimas produzidas por fitopatgenos so promotoras da desintegrao dos
componentes estruturais das clulas do hospedeiro, degradando substncias presentes
nas clulas ou afetando diretamente o protoplasto.

2. EXOENZIMAS:
Exoenzimas so enzimas produzidas por microrganismos que atuam no ambiente
externo, degradando molculas orgnicas complexas (polissacardeos, protenas, etc), a
partir das quais so formadas molculas mais simples (monossacardeos, aminocidos,

59
etc), assimilveis pelos microrganismos. Como exemplos de exoenzimas podem-se citar:
celulases (celulose), quitinases (quitina), pectinases (pectina), proteases (protenas),
amilases (amido), etc.
A produo de exoenzimas pode ser facilmente verificada nos microrganismos
produtores de amilase. Nesse caso, os microrganismos devem crescer em meio de cultivo
contendo amido como fonte de carbono (energtica). Com seu desenvolvimento e com a
produo de amilases, parte do amido degradado (originando dextrinas, maltose e
glicose), sendo essa degradao visualizada atravs de um indicador de amido (iodo). O
amido no hidrolisado fica azul, o hidrolisado no corado. As zonas claras so as
testemunhas da atividade enzimtica da -amilase. As zonas vermelhas indicam uma
hidrlise parcial do amido em dextrinas (polissacardeos com cadeias de tamanho
intermedirio) devido atividade de -amilase.

amilase
Amido + H2O dextrinas + maltose + glicose

2.1 DEGRADAO DA CUTCULA:


As paredes das clulas epidrmicas dos vegetais em contato com o meio exterior
mostram-se recobertas por uma camada lipdica contnua, conhecida como cutcula, a
qual fica aderida parede celular atravs de uma camada intermediria rica em
substncias pcticas. A cutcula recobre folhas, frutos e talos jovens, tendo como funes
bsicas evitar a difuso de gua e nutrientes para o meio externo, bem como proteger a
planta contra os efeitos adversos do meio ambiente. A espessura e a morfologia da
cutcula variam dependendo da espcie vegetal, do rgo envolvido, do estdio de
desenvolvimento do tecido e das condies do ambiente. A cutcula pode ser separada da
parede celular por meio de tratamento qumico ou enzimtico, produzindo dois
componentes lipdicos principais, as ceras e a cutina.
A cutcula consiste basicamente de cutina impregnada com cera e freqentemente
recoberta por placas cerosas. Alm das funes j mencionadas, tambm serve como
barreira protetora contra microrganismos. Os fungos que penetram atravs da superfcie
intacta da planta mostram-se aptos para degradar enzimaticamente essa barreira atravs
da produo de cutinases, o que constitui, para alguns, em fator chave na patogenicidade.
Alm dessa funo, aparentemente as cutinases tambm podem estar envolvidas na
determinao da especificidade de fungos fitopatognicos com os tecidos do hospedeiro.

60
As cutinases so esterases que rompem as ligaes steres entre as molculas
presentes na cutina, substrato natural da enzima, liberando como produto da ao
enzimtica monmeros e oligmeros derivados de cidos graxos.
Em funo de sua importncia para certos patgenos na penetrao do
hospedeiro, a cutinase constitui-se em alvo potencial para o controle de doenas vegetais.
A desativao da enzima (inibio de sua ao e/ou sntese-excreo), ao nvel de
superfcie do hospedeiro, evitaria a penetrao e, conseqentemente, protegeria as
plantas contra algumas doenas fngicas.

2.2 DEGRADAO DOS COMPONENTES DA PAREDE CELULAR:


As paredes celulares so estruturas complexas e dinmicas, circundando o
protoplasto, externamente membrana plasmtica. Podem estar envolvidas na expanso
celular, influenciando a forma da clula e, conseqentemente, a morfognese de tecidos
vegetais. De maneira geral, so divididas em trs regies estruturais: lamela mdia
(regio entre as paredes de clulas vizinhas), parede primria (entre membrana
plasmtica e a lamela mdia, formada somente por clulas em ativo processo de
crescimento, aps a diviso celular ser completada) e parede secundria (localizada
internamente parede primria, formada aps o trmino da expanso celular).
A lamela mdia constituda principalmente por substncias pcticas, que so
polissacardeos. Em funo da capacidade de formarem gis, devido s ligaes entre
cadeias por meio de ons clcio, as substncias pcticas atuam como uma espcie de
cimento intercelular, mantendo coesos os tecidos vegetais. Vrias enzimas conhecidas
como pectinases ou enzimas pectolticas, degradam substncias pcticas.
Os polissacardeos constituintes das paredes celulares tm sido tradicionalmente
divididos em substncias pcticas, hemiceluloses e celulose, com base na solubilidade, e
no na composio qumica. As hemiceluloses so encontradas na matriz das paredes
primria e secundria e a sua degradao em constituintes monomricos requer a
atividade de vrias enzimas, genericamente conhecidas como hemicelulases. Os nomes
especficos dessas enzimas variam em funo do substrato e dos monmeros liberados.
A celulose constitui-se no principal componente estrutural das paredes celulares dos
vegetais (20-30 % nas paredes primrias e acima de 40 % na parede secundria de
plantas lenhosas) e mostra-se como uma substncia cristalina e insolvel em sua forma
nativa. A degradao desse polmero, com a produo final do monossacardeo glicose,

61
resulta da ao de diferentes celulases como -1,4 D-glucanase, -1,4-D-glucana
celobiohidrolase e -glucosidase.
As enzimas que degradam a parede (EDP) esto provavelmente envolvidas na
maioria das doenas de plantas. A contribuio dessas enzimas na patognese pode
envolver a extensiva destruio dos tecidos vegetais por patgenos necrotrficos (por
exemplo, enzimas pectolticas), bem como alteraes especficas e localizadas nas
paredes celulares por patgenos biotrficos (por exemplo, glicanases e glicosidases).
Embora estejam ligadas degradao dos componentes da parede, a comprovao do
envolvimento das EDP na patognese deve preencher alguns critrios, como: capacidade
do patgeno em produzir as EDP in vitro; deteco das EDP em tecido infectado;
correlao da produo das EDP com patogenicidade; alteraes nas paredes de tecidos
infectados observveis com o uso de tcnicas de microscopia; reproduo das alteraes
na parede ou sintomas da doena com o uso de EDP purificadas.

2.3 DEGRADAO DE COMPONENTES DA MEMBRANA PLASMTICA:


A membrana plasmtica (plasmalema) separa o interior da clula do ambiente
externo, enquanto as membranas de organelas delimitam compartimentos no interior
celular. Extenses da membrana plasmtica (plasmodesma) atravessam a parede celular
e promovem conexes com as clulas vizinhas. As membranas vegetais contm
protenas (40-50 %) e lipdios (40 %), sendo que a maioria pode tambm conter
carboidratos (0-10 %) na forma de glicolipdios e glicoprotenas. Apresentam uma
estrutura unitria dupla (camada lipdica dupla), formando uma matriz, na qual os
componentes proticos se integram. A camada lipdica contm trs tipos de lipdios, os
fosfolipdios, os lipdios neutros (colesterol) e os glicolipdios. As protenas podem ser de
diferentes classes e tamanhos, sendo de maneira geral designadas como intrnsecas
(voltadas para o citoplasma) ou extrnsecas (voltadas para a parede celular). Os
carboidratos das membranas, glicolipdios ou glicoprotenas, normalmente so orientados
em direo superfcie externa.
Em funo da composio, as membranas podem sofrer ao destrutiva de
enzimas como fosfofolipases (liberam cidos graxos a partir de molculas de fosfolipdios)
e proteases (liberam peptdeos e aminocidos a partir da ruptura das ligaes peptdicas
em molculas de protenas).
A maioria dos fitopatgenos obtm os nutrientes necessrios para o crescimento e
a reproduo a partir de protoplastos dos hospedeiros. Alguns dos nutrientes, como

62
acares (monossacardeos) e aminocidos, podem ser utilizados diretamente pelas
bactrias e fungos. Outros constituintes das clulas vegetais, porm, como amido,
protenas e lipdios necessitam ser degradados por enzimas secretadas por esses
microrganismos. Todos os fitopatgenos podem degradar, atravs da ao de enzimas
proteolticas, diferentes tipos de protenas, o que resulta em profundas alteraes na
organizao e funo celulares no hospedeiro. O amido, um polmero de glicose,
constitui-se no principal polissacardeo de reserva nas clulas vegetais. A maioria dos
patgenos produz amilases, as quais degradam esse polmero em molculas de glicose
diretamente utilizveis nas atividades metablicas desses microrganismos. Diferentes
tipos de lipdios so encontrados nas clulas vegetais, como leos, gorduras presentes
principalmente nas sementes, ceras, na cutcula, e, fosfolipdios e glicolipdios presentes
nas membranas. Vrias bactrias e fungos podem degradar esses compostos atravs da
ao de enzimas lipolticas (lpases, fosfolipases, etc), liberando cidos graxos que
podem ser utilizados diretamente por esses patgenos.

3. EXERCCIO
1) Esquematize o exerccio visando a deteco da produo de exoenzimas (amilase)
pela levedura (Saccharomyces) e pela bactria (Bacillus).

2) Comente os resultados obtidos no teste de produo de amilase.

63
9 - ISOLAMENTO DE FUNGOS E BACTRIAS DO SOLO

Um isolamento bem sucedido de um microrganismo depende basicamente da


capacidade da tcnica de separar um determinado organismo de outro. Os mtodos
descritos para isolamento de grupos de microrganismos (bactria, fungo e actinomicetos)
possuem pelo menos uma limitao em comum, por exemplo, alguns membros do grupo
podem exigir componentes no meio de cultivo utilizado para isolamento. Por isso,
preciso conhecer as condies ideais para cada microrganismo que se quer estudar e
utilizar tcnicas adequadas para este fim. Outro fator importante, o correto manuseio
das amostras de solo que sero utilizadas, visto que, uma amostra manuseada
inadequadamente no mantm as caractersticas biolgicas do momento da amostragem,
mesmo porque, as condies de preservao e o perodo de armazenamento das
amostras de solo influenciam nas atividades e nas densidades das populaes
microbianas.
na seleo de meios de cultura, deve-se considerar a presena de nutrientes na
forma assimilvel, que servem como fonte de energia e de carbono para os
microrganismos, sendo que as necessidades nutricionais geralmente so especficas.
Tem-se observado que, normalmente, as populaes fngicas se desenvolvem melhor
em meios com alta relao carbono-nitrognio, enquanto que, para as populaes
bacterianas o melhor desenvolvimento acontece em meios com baixa relao carbono-
nitrognio. Na comunidade bacteriana, tambm existe variabilidade entre as populaes
de bactrias em geral e de actinomicetos, em relao utilizao dos nutrientes
presentes no meio de cultura. Assim, substncias qumicas inibidoras do crescimento de
determinadas populaes de microrganismos devem ser adicionadas ao meio para tornar
as avaliaes mais especficas.
Existem diversas maneiras de isolar microrganismos, variando de acordo com o
hbito de crescimento, o modo de reproduo e a ecologia do microrganismo. Assim,
vrias tcnicas podem ser utilizadas no isolamento de fungos e bactrias, utilizando
partes da planta (caule, rizomas, razes, folhas, frutos, sementes) ou mesmo o solo.
Dentre os mtodos existentes, temos: mtodo de diluio em srie, mtodo de
plaqueamento e mtodo armadilha ou isca.
Uma grande variedade de fungos e bactrias pode ser obtida pelo emprego do
mtodo de diluio em srie, possibilitando conhecer a sua populao em diferentes

64
perfis do solo, em condies secas ou midas e tambm, em reas pobres ou frteis,
para estudos ecolgicos comparativos.
O mtodo de plaqueamento mais utilizado para isolamento de patgenos de
plantas presentes em solo. Nesse caso, utilizam-se pequenas pores de solo suspeito
de conter o patgeno numa placa com meio de gar, usando a ponta de uma esptula ou
escalpelo esterilizados numa chama de lcool. Aps, colocam-se as placas numa
incubadora, observando-as em intervalos regulares.
Por outro lado, alguns fungos de solo so mais facilmente isolados utilizando-se o
mtodo de armadilha ou isca. Onde, algumas partculas de solo so colocadas sobre a
superfcie de uma rodela de cenoura esterilizada, as placas so incubadas e observadas
at uma semana mais tarde.

EXERCCIO
O isolamento de microrganismos do solo ser realizado atravs do mtodo de
diluio em srie, conforme etapas descritas a seguir:
 coletar pelo menos cinco amostras de solo e fazer uma amostra composta, misturando
rigorosamente e peneirando;
 colocar 10 gr do solo seco ao ar em um Erlenmeyer de 250 mL e, em seguida,
adicionar 90 mL de gua estril;
 agitar por 30 minutos;
 transferir 1 mL da suspenso para 9 mL de gua estril (diluio 1:100) e agitar
brevemente;
 transferir 1 mL desta suspenso para 9 mL de gua estril (diluio 1:1000) e agitar
brevemente;
 repetir a operao at obter a diluio desejada. A quantidade de solo e gua utilizada
pode variar, de acordo com a necessidade, bem como o volume transferido (sempre
respeitando a diluio), como visto na Figura 17.
 transferir 0,1 mL de cada diluio do solo para placas Petri contendo meio solidificado,
espalhando a suspenso com uma ala de Drigalski.

65
DILUIO SERIADA

10g DE SOLO + 90 ml DE GUA


1 10
mlgr de solo +
90 ml H2O
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9ml de
gua

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Meio de Martin 0,1 ml


(Fungos)

Meio de Extrato de Solo (Bactrias)

Figura 17. Esquema das diluies e distribuio das suspenses em placas de Petri
contendo meio de cultura.

 incubar as placas em condies de temperatura e luminosidade adequadas; para


quantificao dos fungos ou bactrias, multiplicar o nmero mdio de colnias pelo
fator de diluio, obtendo-se o nmero por grama de amostra de solo original.

UFC* = (n de colnias) x 10** x (diluio utilizada para contagem)

* UFC significa Unidade Formadora de Colnia, uma vez que a


contagem feita referente s colnias e no s clulas
presentes.
** 10 um fator de correo.

EXEMPLO:
Se so contadas 105 colnias em uma placa onde foi feita diluio de
10-2 o clculo final ser:

UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/mL

66
1) Faa o clculo de UFC (Unidade formadora de colnia) de pelo menos uma diluio
utilizada.

2) O que se pode concluir a respeito da quantidade e grupo de microrganismos


encontrados nas amostras de solo utilizadas?

67
10 - ANLISE MICROBIOLGICA E TRATAMENTO DA GUA

1. INTRODUO
A gua um importante meio de transmisso de MICRORGANISMOS,
principalmente intestinais. As infeces intestinais so geralmente transmitidas de uma
pessoa para outra atravs da ingesto da gua ou consumo de alimentos contaminados.
Essas doenas tambm podem resultar do emprego de gua poluda para pesca,
irrigao e recreao. Os microrganismos patognicos responsveis por infeces do
trato intestinal e outras chegam gua atravs dos excrementos do homem e animais de
sangue quente.
Uma srie de doenas veiculadas pela gua so causadas por bactrias, fungos,
protozorios, helmintos e vrus. Entre as doenas causadas por bactrias, so mais
freqentes: a febre tifide, causada pela Salmonella typhi; a febre paratifide pelas S.
paratyphi, S. schottmuelleri; a clera pelo Vibrio cholerae; as desinterias bacilares
causadas pelas Shigella dysenteriae, S. sonnei, S. flexneri e S. bodyii. A Leptospira entra
na gua atravs da urina de animais, sendo o rato o mais comum agente da leptospirose.
Algumas bactrias so capazes de conduzir a infeces externas ao corpo, com um
simples contato com a gua contaminada, como o Staphylococus aureus, que promove
intoxicao alimentar, infeces cutneas e da garganta, e a Pseudomonas aeruginosa,
que pode provocar infeces nos olhos e ouvidos, importante agente de infeces
hospitalares.
Entre os fungos est a levedura Candida albicans, que pode provocar candidase.
Entre os protozorios encontramos Giardia lambia e a Entamoeba hystolytica. Doenas
como verminoses intestinais podem ser transmitidas atravs da gua, sendo as mais
importantes a ascaridase (Ascaris lumbricoides), ancilostomose (Ancyloma duodenale),
tricurose (Trichuris trichiura) e esquistossomose (Schistosoma mansoni), entre outras. No
tocante a doenas ocasionadas por vrus entricos presentes em gua contaminada por
fezes, tm a hepatite tipo A, gastroenterite e doenas causadas por Adenovrus,
Echovrus, vrus Coxsackie, entre outros.
Raramente possvel isolar patgenos intestinais diretamente da gua que sofreu
contaminao, porque eles geralmente esto presentes em nmero relativamente baixo, a
menos que a gua tenha sido recente e maciamente contaminada por um portador de
doena intestinal. Qualquer abastecimento de gua que esteja contaminado com matria
fecal constitui uma fonte potencial de doenas intestinais. Como a Escherichia coli um

68
habitante constante do trato intestinal humano e de animais superiores, apresenta taxa de
sobrevivncia semelhante ao das bactrias enteropatognicas e seu nmero bastante
grande, embora no seja um agente causal de doena intestinal, sua presena na gua
constitui indicao de contaminao fecal. Assim, a deteco de E. coli na gua o
melhor meio de se demonstrar a qualidade da gua usada para consumo.

2. MICRORGANISMOS SAPRFITOS E PATOGNICOS NA GUA


Historicamente, a maioria das nossas preocupaes sobre a pureza das guas
tem sido relacionada com a transmisso de doenas. A qualidade da gua dos nossos
rios, lagoas e outros reservatrios comprometida pelos poluentes nela lanados. Estes
so provenientes de esgoto domstico ou efluente industriais, ou de outras fontes
decorrentes do carreamento de contaminantes pela gua de chuva que escoa pela
superfcie do solo ou pavimentao.
Em cidades onde no existe um sistema eficiente de tratamento do esgoto, o
esgoto domstico um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando
o crescimento de microrganismos. A assimilao destes contaminantes orgnicos
biodegradveis realizada com o concurso de bactrias presentes, por meio de um
processo que consome o oxignio dissolvido na gua dos rios ou reservatrios.
Quando a carga contaminante dos esgotos superior a capacidade de
autodepurao do rio ou aude, estes ficam sem oxignio, ocasionando odores ftidos e
impedindo a sobrevivncia de peixes. Esta condio medida por dois parmetros: a
Demanda Bioqumica de Oxignio, que determina a quantidade de matria orgnica
biodegradvel presente na gua, e o Oxignio Dissolvido, que mede a concentrao de
oxignio na gua. Existem indicadores de poluio para as guas destinadas ao consumo
humano e gua para fins de balneabilidade (recreao), entre outras.
A patogenicidade dos microrganismos relativa, dependendo de fatores como a
resistncia do hospedeiro, caractersticas de infectividade e produo de toxinas.
Qualquer microrganismo patognico em potencial, caso encontre um hospedeiro
debilitado. Entretanto, apenas um nmero limitado de espcies microbianas pode
provocar doenas em uma poro significativa de hospedeiros normais. Considerando os
motivos prticos, o homem o hospedeiro de preocupao primria, embora, as
enfermidades de outros organismos tambm possam ter importantes implicaes
econmicas.

69
A grande maioria das bactrias presentes na gua originria do solo. Uma
proporo considervel constituda pelas espcies nitrificadoras e fixadoras de
nitrognio, envolvidas no ciclo de decomposio da matria orgnica na natureza, alm
de outras que tm seu habitat no solo, entretanto no constituindo perigo sade.
As guas de abastecimento das cidades e as guas de irrigao de hortas e de
recreao apresentam do ponto de vista sanitrio, grande importncia com relao aos
microrganismos patognicos. Entretanto, a pesquisa destes microrganismos, no que se
refere ao isolamento e identificao, impraticvel, por serem caras, difceis de realizar e
demandarem bastante tempo.
Os testes para pureza de gua, usados atualmente, visam detectar organismos
indicadores em particular. Existem vrios critrios para um organismo indicador, o mais
importante que o organismo esteja consistentemente presente em nmero substancial
nas fezes humanas, de forma que, sua deteco seja uma boa indicao que resduos
humanos esto sendo introduzidos na gua. O organismo indicador tambm deve viver na
gua pelo menos to bem quanto os patgenos. Os organismos indicadores devem ser
detectveis atravs de testes simples que podem ser executados por pessoas com pouco
treino em microbiologia.
Os organismos indicadores usuais so as bactrias coliformes. Coliformes so
definidos como bastonetes Gram-negativos aerbios ou anaerbios facultativos, no
formadores de endsporos, que fermentam lactose com produo de gs em 48 horas de
incubao em caldo lactosado a 35 C. Como alguns coliformes no so enterobactrias,
mas sim bactrias encontradas em amostras de plantas e de solo, muitos padres para
alimentos e gua especificam a identificao de coliformes fecais. O coliforme fecal
predominante a Escherichia coli, que constitui uma grande proporo da populao
bacteriana intestinal humana. Existem testes especializados para distinguir entre
coliformes fecais e no fecais. Em condies normais, os coliformes podem no ser
patognicos, embora algumas linhagens possam causar diarrias e infeces urinrias
oportunistas. O grupo coliforme apresenta uma srie de vantagens como indicadores de
poluio fecal na gua, a saber; constncia e elevado nmero nas fezes, so fceis de
isolar e identificar, a concentrao de coliformes na gua alta. A presena de E. coli em
guas tambm poder representar srios riscos diretos sade, uma vez que existem
algumas linhagens que so capazes de provocar distrbios gastrintestinais em crianas e
adultos.

70
As bactrias empregadas como indicadoras de poluio fecal em guas so os
coliformes totais, os coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfrigens. As
mais utilizadas so pertencentes aos dois primeiros grupos.
Os mtodos mais comuns para determinar a presena de coliformes na gua so
baseados na habilidade das bactrias coliformes em fermentarem lactose. O mtodo dos
tubos mltiplos pode ser utilizado para estimar o nmero mais provvel, ou o mtodo da
filtrao, que mais direto na determinao e nmeros de coliformes.
Os coliformes tm sido organismos indicadores muito teis na sanitizao de
guas, porm, apresentam algumas limitaes. O crescimento da bactria coliforme nas
superfcies internas de canos de gua no considerado um perigo para a sade pblica.
Um problema mais srio que alguns patgenos so mais resistentes a desinfetantes do
que os coliformes. Dentre estes esto os vrus e cistos de protozorios. Amostras de gua
quimicamente desinfestadas, livres de coliformes, podem estar infestadas por vrus
entricos, e por alguns cistos que so resistentes clorao, sendo sua eliminao por
este mtodo impossvel, neste caso sendo necessria a filtrao da gua.

3. PADRES MICROBIANOS DE QUALIDADE DE GUA


Os padres microbianos de qualidade de gua so estabelecidos em funo do
uso. Contudo, os padres brasileiros foram baseados em dados obtidos de regies
temperadas, e para assegurar a sua aplicabilidade necessitam de estudos locais,
relevando nossa condio tropical.

A) GUA POTVEL
Os padres de gua potvel empregados em todo mundo so semelhantes e
baseados nos padres americanos. Exigem a ausncia de coliformes totais em 100 mL de
gua, em uma nica amostra. A presena de mais de 4 coliformes totais em 100 mL de
gua exige medidas imediatas para corrigir o problema e anlises de outras amostras
para confirmar a situao. Para compensarem falhas ocasionais na anlise do grupo
coliforme, tem sido recomendado o uso de indicadores suplementares. Quando a fonte de
gua no est grosseiramente contaminada, a aplicao do padro de coliformes totais
zero em 100 mL tem sido um objetivo realstico.

71
B) GUA DE CONTATO PRIMRIO
Algumas atividades envolvem contato direto da gua e superfcies do corpo, com
pouca ou nenhuma ingesto, como o banho e a natao. Nas regies tropicais a
recreao na gua economicamente significante e est relacionada indstria do
turismo. O risco de contrair infeces de patgenos entricos oriundos da contaminao
fecal reduzido porque no h ingesto. Por isso, padres de qualidade de gua so
menos rigorosos que os estabelecidos para a gua potvel. O padro internacional
estabelece uma mdia de 100-300 coliformes fecais/100 mL, contudo os mtodos de
avaliao imprecisa e anlise estatstica varivel criam esta diferena de valores. J os
padres brasileiros estabelecem o limite de 1000 coliformes fecais/100 mL, contudo,
devem ser considerados indicadores adicionais de patgenos no fecais como P.
aeruginosa e S. aureus.

C) MTODOS DE ANLISE
a) Teste presuntivo: colocar amostra de gua em tubos de ensaio, contendo caldo
lactosado, incubar a 37 C e observar a produo de gs. Caso seja formado gs,
presume-se que a gua esteja contaminada. Como E. coli e A. aerogens podem formar
gs, prossegue-se a anlise.
b) Teste de confirmao: o material do tubo semeado em meio de cultura
contendo eosina-azul de metileno (EMB), que permite separar as duas bactrias - E. coli:
colnia azul-brilhante; A. aerogenes: colnia rsea sem brilho.
c) Teste completo: o material de colnias de E. coli, plaqueada em EMB,
colocado em caldo lactosado visando observar a formao de gs e em gar para se
efetuar o teste de Gram.

D) TRATAMENTO DA GUA
O tratamento tradicional da gua potvel envolve uma combinao de mtodos
fsicos e qumicos, destinados remoo da turbidez causada pelos slidos em
suspenso, e a desinfeco para controlar os microrganismos patognicos. A gua
originria de poos profundos e de boa qualidade relativamente livre de
microrganismos. Os solos, especialmente os argilosos, atuam como filtros removendo os
microrganismos; sendo que, medida que a gua passa, no entanto, os solos arenosos
so menos eficientes nesta ao. A matria orgnica dissolvida na gua degradada
pelos microrganismos durante o movimento da mesma nas camadas do solo.

72
Um manancial aqutico bem mantido pode fornecer gua potvel sem tratamento,
entretanto, em reas residenciais densamente habitadas, as fontes de gua
freqentemente podem sofrer poluio com esgoto. As guas de superfcies so mais
susceptveis a contaminao fecal.
Quando a gua obtida de reservatrios no contaminados alimentados por
poos profundos, ela requer um mnimo de tratamento. Contudo, a maioria das cidades
obtm suas guas de fontes bastante poludas, tais como rios que receberam resduos
municipais ou industriais.
guas muito trbidas ficam paradas em um reservatrio pelo tempo necessrio,
para permitir a deposio da matria orgnica particulada suspensa. A gua passa ento
pelo processo de floculao, remoo de materiais coloidais como a argila, que poderia
ficar em suspenso indefinidamente. Um floculante qumico, como o sulfato de potssio e
alumnio, forma agregados de partculas finas suspensas em forma de flocos. Quando
estes agregados vo lentamente se depositando no fundo do reservatrio, carregam
consigo material coloidal. Grandes quantidades de vrus e bactrias so removidas
juntamente com o material depositado no fundo do reservatrio.
Aps a floculao, a gua tratada por filtrao, passa atravs de leitos de 33 a
132 cm de areia fina. Os microrganismos so adsorvidos superfcie das partculas de
areia. Os microrganismos no penetram atravs das rotas tortuosas entre as partculas,
mesmo assim os espaos devem ser maiores que os micrbios que esto sendo filtrados.
Limpezas peridicas so necessrias para evitar acmulos. A utilizao de carvo ativado
na filtrao tem como objetivo tanto a remoo de matria particulada quanto a maioria
dos poluentes qumicos orgnicos dissolvidos. Tratamentos qumicos devem ser feitos
para eliminar a dureza, cheiro e sabor da gua.
Antes de entrar no sistema de distribuio normal, a gua filtrada e clorada.
Como a matria orgnica neutraliza o cloro, deve-se prestar ateno para manter o nvel
de cloro efetivo. Quanto a possibilidade de que o cloro possa reagir com contaminantes
da gua e formar compostos carcinognicos, um risco aceitvel quando comparado
utilidade comprovada da clorao da gua. O cloro tem desvantagem de reagir
quimicamente com as substncias orgnicas presentes na gua, formando derivados
txicos e recalcitrantes, reduzindo a concentrao e poder desinfetante. A quantidade de
cloro necessria depende do pH e da presena de outras substncias na gua. Em pH
levemente cido, o equilbrio com a gua favorece a forma de hipoclorito, mais potente

73
para a desinfeco. O nvel de cloro residual de cerca de 1 mg/mL mata a maioria dos
microrganismos.

4. ESQUEMA DO SISTEMA DE TRATAMENTO DE GUA.

sulfato
alumnio

H2O tanque de tanque de tanque de filtro de clorao,


sedimentao floculao decantao areia pH, flor depsito

sedimentao agitao floculao filtragem clorao armazenagem

5. EXERCCIO
1) Esquematize o teste presuntivo para anlise microbiolgica da gua. Interprete os
resultados possveis.

2) Visita a estao de tratamento de gua da ESALQ.

74
11 - FERMENTAO ALCOLICA

1. INTRODUO
Na Antigidade, o homem j fazia uso da preservao de alimentos, envolvendo
inconscientemente manipulaes microbiolgicas. Documentos da histria antiga revelam
que o homem conhecia a arte de fabricar po, cerveja, vinho e iogurte. Muitos destes
alimentos produzidos por fermentaes, provavelmente descobertos acidentalmente, j
eram conhecidos pelo homem h 8.000 anos. Contudo, as verdadeiras causas que
regiam o processo de fermentao permaneceram ignoradas pelo homem at metade do
sculo XIX.
A confirmao por Pasteur, em 1857, de que a fermentao alcolica era causada
por leveduras, isto , por seres vivos, j havia sido sugerida por outros pesquisadores,
como Thenerd, Charles De La Tour, Schwan e Ktzing, que sofreram forte oposio por
parte dos qumicos influentes da poca, como Liebig, Berzelius e Whhler, que admitiam
aquele processo ser estritamente qumico. A constatao por Bnchner, em 1897, de que
extratos de clulas de leveduras possuem capacidade de provocar a fermentao
alcolica, serve de marco inicial do campo da Bioqumica, e fundamental para o
conhecimento do processo de fermentao alcolica. Fermentao o processo
bioqumico em que os microrganismos retiram do meio em que vivem o material nutritivo
que necessitam, ao mesmo tempo em que, sob a ao cataltica de enzimas, produzem
substncias das quais se utiliza a indstria.

2. FERMENTAO
Para muitos, fermentao simplesmente significa produo de lcool; gros e
frutas so fermentados para produzir cerveja e vinho. Outros definem como deteriorao
de alimentos por microrganismos, ou processo microbiolgico em grande escala
ocorrendo com ou sem ar. Em suma, fermentao pode ser definida como um processo
metablico que libera energia de acares ou molculas orgnicas, tais como
aminocidos e cidos orgnicos; que no requer oxignio, mas podendo ocorrer em sua
presena; no requer o uso do ciclo de Krebs ou uma cadeia de transporte de eltrons;
utiliza uma molcula orgnica como aceptor final de eltrons; produz somente pequenas
quantidades de ATP (somente uma ou duas molculas de ATP para cada molcula de
material inicial) devido ao fato de grande quantidade de energia original da glicose

75
permanecer nas ligaes qumicas dos produtos finais orgnicos, tais como cido ltico
ou etanol.
Na fermentao, o doador de eltrons e o receptor final de eltrons so compostos
orgnicos. Ambos so usualmente produzidos a partir de um nico substrato orgnico no
decurso do metabolismo intermedirio. Para ser fermentvel, um composto precisa ser
capaz de produzir intermedirios tanto oxidveis quanto redutveis, por isso, no pode ser
nem muito oxidado e nem muito reduzido. Os acares preenchem estas exigncias
admiravelmente e esto entre os compostos mais fcil e amplamente utilizados pelos
microrganismos fermentadores. Outras substncias, incluindo vrios cidos orgnicos,
aminocidos, purinas e pirimidinas podem ser fermentadas por algumas bactrias.
Os produtos finais de uma dada fermentao variam com o tipo de organismo,
natureza do substrato fermentvel e, em alguns casos, com os fatores ambientais
temperatura e acidez do meio.
Contudo, a utilizao de microrganismos fermentadores se presta devido
principalmente transformao de um alimento para outro com caractersticas mais
peculiares no sabor, textura, aparncia e digestibilidade, agregando-se assim valor a um
produto primrio, ou at produzindo um novo alimento sem perda ou utilizao de grandes
quantidades de energia, visto que se trata de um dos mecanismos de biossntese de
menor gasto energtico.
As fermentaes so controladas pelo homem atravs da escolha dos
microrganismos, dos substratos, da temperatura e pH adequados.

3. FERMENTAO DO CIDO LCTICO


O cido lctico, formado atravs do processo de fermentao lctica, produz nos
alimentos transformaes benficas, ou indesejveis. Como exemplos de transformaes
benficas, esto as que se verificam no leite, que possibilitam a criao de produtos
derivados, com excelentes qualidades organolpticas. Como ao indesejvel de
fermentao lctica, est aquela que ocorre nos sucos de frutas, cervejas e vinhos, que
podem ser alterados pela presena de turvaes.
O cido lctico, elaborado atravs da fermentao lctica, no s torna possvel a
obteno de aprecivel linha de produtos utilizados como complementos de refeies,
como tambm representam para estes, seu meio de conservao. Os picles, o chucrute e
a azeitona, constituem os mais populares alimentos conservados por meio da
fermentao lctica.

76
A fermentao lctica pode se processar de dois modos. A fermentao
homolctica, realizada por estreptococos e algumas espcies de Lactobacillus, resulta na
formao de apenas cido lctico. A fermentao heterolctica, realizadas por bactrias
do gnero Leuconostoc e algumas espcies de Lactobacillus, origina o cido lctico, CO2,
etanol, manitol e acido actico.
Assim, durante a gliclise, que a primeira fase da fermentao do cido lctico,
uma molcula de glicose oxidada a duas molculas de cido pirvico (Figura 18). Esta
oxidao gera energia que utilizada para formar as duas molculas de ATP. No prximo
passo, as duas molculas de cido pirvico so reduzidas por duas molculas de NADH
para formar duas molculas de cido lctico. Devido ao fato do cido lctico ser o produto
final da reao, ele no sofre mais oxidao, e a maioria da energia produzida pela
reao permanece armazenada no cido lctico. Ento, esta fermentao rende somente
uma pequena quantidade de energia. A equao geral para a fermentao conduzindo
um acar como a glicose formao de cido lctico pode ser descrita como:

O COOH
CH2OH C CHOH CHOH CHOH CH2OH 2CO2 + 2 CHOH
glicose CH3
cido lctico

Dois importantes gneros de bactrias do cido lctico so Streptococcus e


Lactobacillus. Devido ao fato desses microrganismos produzirem somente cido lctico,
eles so referidos como homofermentativos.

4. FERMENTAO ALCOLICA
O substrato ou matria-prima para a fermentao alcolica bastante varivel,
constituda por produtos aucarados (cana-de-acar, beterraba, mel, melao e frutas) e
amilceos (amido de gros, razes e tubrculos).
Os acares monossacardeos como glicose e frutose so fermentados
diretamente. J os dissacardeos como a sacarose, necessitam sofrer o fenmeno de
inverso, realizado pelas enzimas invertase; j os amidos necessitam ser sacarificados
qumica, enzimtica ou biologicamente, para que sejam disponveis acares
fermentveis.

77
A fermentao alcolica caracterstica dos tecidos vegetais de plantas
superiores, das leveduras, de alguns outros fungos, e de poucas bactrias. A equao
geral para a fermentao alcolica de um acar como a glicose pode ser descrita como:

O
CH2OH C CHOH CHOH CHOH CH2OH 2CO2 + 2CH3 CH2OH
glicose lcool

A fermentao alcolica tambm comea com a gliclise de uma molcula de


glicose para obter duas molculas de cido pirvico e duas molculas de ATP. Na
prxima reao, as duas molculas de cido pirvico so convertidas a duas molculas
de acetaldedo e duas molculas de CO2. As duas molculas de acetaldedo so
reduzidas por duas molculas de NADH para formar duas molculas de etanol. Outra vez,
a fermentao alcolica um processo de baixo rendimento energtico porque a maioria
da energia continua na molcula de glicose original pertencente ao etanol, o produto final
(Figura 18).
A fermentao alcolica realizada por algumas bactrias e leveduras. O etanol e
o dixido de carbono produzidos pela levedura Saccharomyces so resduos para as
clulas leveduriformes, mas so teis para os humanos. O etanol produzido pelas
leveduras forma o constituinte alcolico das bebidas alcolicas, e o dixido de carbono
produzido pelas leveduras causa crescimento na massa do po.

78
2 NAD+ Glicose 2 ADP

COOH
2 NADH 2 ATP
C=O

CH3
2 cido pirvico

2 NADH + 2 H+

2 CO2
2 NADH

COOH CHO
CHOH CH3
2 Acetaldedo
CH3 2 NADH +2H
+

2 cido ltico

2 NAD+
CH2OH
Fermentao
do cido ltico CH3
2 Etanol

Fermentao alcolica

Figura 18. Diagrama dos tipos de fermentao

5. A LEVEDURA
As leveduras so fungos unicelulares, ascomicetos no-filamentosos,
caracteristicamente esfricas ou ovais. Da mesma forma que os fungos filamentosos, as
leveduras so amplamente distribudas na natureza: so freqentemente encontradas
como um p branco cobrindo frutas e folhas. As leveduras se multiplicam por fisso
binria, como a Schizosaccharomyces, ou por brotamento, como Saccharomyces. As

79
leveduras que se multiplicam por brotamento formam uma protuberncia (broto) em sua
superfcie extrema, onde, a medida em que o broto se desenvolve, o ncleo da clula
parental se divide, e um dos dois ncleos migra para o broto. O material da parede celular
ento sintetizado entre o broto e a clula parental, e o broto eventualmente se separa
da clula me (Figura 19).

Figura 19. Representao da reproduo da levedura Saccharomyces cerevisiae.

W parede celular
Vac vacolo central
BS cicatriz de brotamento
M - mitocndrio
L - corpsculo de lipdeo
G aparelho de Golgi
ER retculo endoplasmtico
V vescula
SPB spindle-pole body equivalente ao centrolo em outros eucariotos
N ncleo

80
As leveduras so capazes de crescimento anaerbio facultativo podendo utilizar
oxignio ou um componente orgnico como aceptor final de eltrons. Este um atributo
valioso porque permite que estes fungos sobrevivam em vrios ambientes. Se dado
acesso ao oxignio, as leveduras respiram aerobicamente para metabolizar os hidratos de
carbono formando dixido de carbono e gua; na ausncia de oxignio, elas fermentam
os hidratos de carbono e produzem etanol e dixido de carbono. Esta fermentao
usada na fabricao de cerveja, do vinho e nos processos de panificao.
Os microrganismos por eles mesmos constituem um produto industrial. A levedura
utilizada em panificao produzida em grandes tanques de fermentao aerados. Ao
final da fermentao, o contedo do tanque de aproximadamente 4% de levedura
slida. As clulas so coletadas por centrifugao contnua, prensadas em blocos de
leveduras, e vendidas em supermercados para utilizao domstica.

6. OUTRAS FERMENTAES
Embora as fermentaes lctica e alcolica sejam os processos fermentativos
mais difundidos nos organismos vivos em geral, muitos outros tipos de fermentaes
existem, que diferem entre si com relao aos substratos fermentados ou a natureza dos
produtos finais formados (Tabela 5). particularmente entre as bactrias que uma grande
variedade de padres fermentativos encontrada, cada um deles caracterstico de um
grupo bacteriano especfico. Entre os produtos finais da fermentao de carboidratos h
numerosos compostos cidos e alcolicos, dixido de carbono e hidrognio gasoso. Os
produtos finais caractersticos definem uma srie de classes diferentes de fermentao.

81
TABELA 5. Usos industriais para diferentes tipos de fermentao.

Microrganismo Material inicial Uso comercial ou Produto final da


industrial fermentao
Saccharomyces cerevisiae Extrato de malte Cerveja Etanol
Saccharomyces cerevisiae var. Uva ou outros Vinho Etanol
Ellipsoideus sucos de frutas
Saccharomyces cerevisiae Refugos industriais Combustvel Etanol
Acetobacter Etanol Vinagre cido actico
Lactobacillus, Streptococcus Leite Queijo, iogurte cido lctico
Lactobacillus bulgaricus Gro, acar Po de centeio cido lctico
Lactobacillus plantarum Repolho Chucrute cido lctico
Pediococcus Carne Salsicha, lingia cido lctico
Propionibacterium freudnreichii cido lctico Queijo suo cido propinico e
dixido de carbono
Clostridium acetobutylicum Melao Usos farmacutico e Acetona e butanol
industrial
Saccharomyces cerevisiae Melao Usos farmacutico e Glicerol
industrial
Aspergillus Melao Sabor cido ctrico
Methanosarcina cido actico Combustvel Metano
Acetobacter Sorbitol Vitamina C Sorbose

7. EXERCCIOS

1) O que fermentao alcolica? Qual a finalidade do experimento com caldo de cana +


Saccharomyces cerevisiae e o tubo de Smith?

82
2) Esquematize, colocando legendas, as estruturas da levedura Saccharomyces
cerevisiae observada ao microscpio.
Fermento Biolgico Caldo de cana

83
12 FIXAO DE NITROGNIO

1. INTRODUO
O ar atmosfrico possui nitrognio e cerca de 78% da constituio gasosa da
atmosfera, formada por nitrognio molecular ou dinitrognio (N2). No entanto, os
organismos eucariontes so incapazes de absorver o N2 e convert-lo a uma forma
assimilvel. Assim, o N2 move-se para dentro da planta atravs dos estmatos, saindo
logo em seguida, sem que possa ser utilizado. Por esta razo, a transformao cclica de
compostos de nitrognio, incluindo a mineralizao da matria orgnica, de fundamental
importncia na transformao geral deste elemento na biosfera. Os principais aspectos do
ciclo do nitrognio esto ilustrados na Figura 20.

Figura 20. Ciclo do nitrognio (adaptado de Salisbury & Ross, 1992).

Os tomos encontram-se unidos de uma maneira muito estvel na molcula de


nitrognio e por esse motivo para que o N2 possa ser convertido a uma forma assimilvel
necessrio o fornecimento de temperatura e presso muito elevadas (fixao
industrial) ou a presena de um sistema enzimtico apropriado (fixao biolgica).

84
A fixao industrial do N2, chamada de processo de Haber-Bosch, utiliza
temperaturas em torno de 400-600oC e presses em torno de 100-200 atm, sendo
dispendiosa do ponto de vista energtico. Reao: N2 + 3 H2 ---> 2 NH3
J as bactrias fixadoras de nitrognio, possuem a enzima nitrogenase, sendo
esta um complexo de duas enzimas uma protena contendo ferro e outra contendo
molibdnio, que juntas catalisam a seguinte reao:
enzima nitrogenase
N2 + 6H+ + 6e+ + 12 ATP 2 NH3 + 12 ADP + 12 Pi

A reao catalisada pela nitrogenase requer no somente uma fonte de eltrons


para reduzir o N2 em NH3 como tambm grande quantidade de energia na forma de ATP.
Alm do mais, a nitrogenase facilmente inativada pelo oxignio. Algumas bactrias
fixadoras de nitrognio so anaerbicas e, normalmente, vivem em ambientes livres de
oxignio. Entretanto, outras so aerbias e utilizam vrios meios para manter o oxignio
distante da nitrogenase no interior da clula. Por exemplo, um Azotobacter respira to
rpido (reduz o oxignio gua rapidamente) na superfcie celular que o interior da clula
permanece livre de oxignio.
Assim, podemos caracterizar trs grupos de bactrias fixadoras de nitrognio ou
diazotrofos: diazotrofos de vida livre (que fixam o nitrognio para seu prprio uso);
diazotrofos associativos (que contribuem para o crescimento da planta sem a formao de
estruturas diferenciadas, no estabelecendo uma simbiose) e os diazotrofos simbiticos
(que estabelecem uma interao muito estreita entre o macro e microsimbionte, e em
alguns casos, so formadas estruturas diferenciadas denominadas ndulos).

2. MICRORGANISMOS SIMBITICOS
A capacidade de fixar nitrognio simbioticamente encontrada em vrios grupos
de microrganismos e, em alguns casos, observa-se a formao de estruturas
diferenciadas. Em relao ao rizbio, durante a sua associao com leguminosas, so
observadas estruturas chamadas ndulos. Esses microrganismos so tipicamente hbeis
para invadir as razes de plantas leguminosas de zonas temperadas e tropicais, fazendo
com que ocorra a formao do ndulo. Nos ndulos, o rizbio, na forma pleiomrfica
(bacteride) est normalmente envolvido na fixao do nitrognio atmosfrico dentro de
uma forma combinada (amnia), que pode ser utilizado pela planta hospedeira.
Atualmente, so conhecidos cinco gneros de diazotrofos da famlia Rhizobiaceae:

85
Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium e
Allorhizobium.
A taxa de fixao de nitrognio varia com a espcie, mas geralmente limitada
pelas condies abiticas do solo, como: a acidez do solo, o tipo de solo, textura e
composio, temperatura e umidade e metais pesados. Entretanto, em condies
favorveis, inoculando com o rizbio especfico, corrigindo deficincias dos demais
nutrientes e adequando a espcie s condies edafopedoclimticas, altas taxas de
fixao podem ser obtidas.
Os rizbios podem ser isolados dos ndulos, mas no so facilmente identificados
quando isolados do solo. Tradicionalmente, os rizbios so divididos em grupos, de
acordo com a velocidade de crescimento, como primeiro sugerido por Lonis & Hansen
(1921), os de crescimento rpido (Rhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium),
crescimento intermedirio (Mesorhizobium) e crescimento lento (Bradyrhizobium).
As bactrias pertencentes ao gnero Rhizobium so aerbias, Gram negativas,
usualmente produzem poli--hidroxibutirato, so mveis, com temperatura tima de
crescimento variando de 25-30C e pH 6,0-7,0. Algumas estirpes, porm, podem crescer
em extremos de temperatura (4 - 42,5C) e pH (4,5-9,5). So quimiorganotrficas,
utilizando uma srie de carboidratos e sais de cidos orgnicos como fontes de carbono,
sem a formao de gs. Celulose e amido no so utilizados. Produzem uma reao
cida em meio contendo sais minerais e manitol ou outros carboidratos e reao alcalina
oriunda de uma reao proteoltica. Sais de amnio, nitrato, nitrito e muitos aminocidos
podem servir como fontes de nitrognio. Peptona pobremente utilizada e a casena e o
gar no so hidrolizados.
O gnero Bradyrhizobium possui caractersticas semelhantes ao gnero
Rhizobium, diferindo nos seguintes aspectos: a reao que ocorre em meio contendo sais
minerais e manitol alcalina e, algumas estirpes podem crescer quimiolitotroficamente na
presena de H2, CO2 e baixos nveis de O2. Este gnero possui trs espcies: B.
japonicum, B. elkanii e B. lianingense.
O gnero Azorhizobium compreende apenas uma espcie A. caulinodans, capaz
de nodular a raiz e caule de Sesbania rostrata. Este gnero no assimila acares (exceto
glicose). Pode fixar nitrognio no estado de vida livre.
O gnero Mesorhizobium possui estirpes com clulas Gram-negativas, aerbias,
mveis (apresentam flagelo) podendo conter poli--hidroxibutirato. Todas as espcies
assimilam glicose, raminose e sacarose metabolizando-os em produtos cidos. O pH ideal

86
para crescimento est entre 4,0 e 10,0 e temperatura entre 37 a 40C. J foram descritas
as espcies M. loti (nodulando Lotus), M. huakuii (nodulando Astragalus sinicus), M. ciceri
e M. mediterraneum (nodulando Cicer arietinum), M. tianshanense, M. amorphi
(nodulando Amorpha sp.) e M. plurifarium (nodulando Cicer).
No gnero Sinorhizobium as clulas usualmente contm grnulos de poli--
hidroxibutirato, so Gram-negativas, aerbias e mveis. A temperatura tima de
crescimento varia entre 25 e 30C, mas muitas estirpes crescem a 35C e outras a 10C,
o pH timo est entre 6,0 e 8,0, porm, algumas estirpes crescem em pH 5,0 e outras em
pH 10,5. As bactrias so quimiorganotrficas, utilizando uma srie de carboidratos (mas
no celulose e amido) e sais de cidos orgnicos como fonte de carbono. Cloreto de
amnio e nitrato ao invs de aminocidos so preferidos como fonte de nitrognio, mas
algumas estirpes utilizam certos aminocidos. O gnero possui as seguintes espcies: S.
meliloti (nodulando Medicago) S. fredii (Glycine) S. saheli , S. teranga (Acacia) e S.
medicae (nodulando Medicago polymorpha).
O novo gnero Allorhizobium est representado pela espcie A. undicola, bactria
fixadora de nitrognio capaz de formar ndulos no caule de Neptunia natans, uma
leguminosa tropical de ocorrncia no Senegal. Foi demonstrado que este grupo
fenotipicamente e filogeneticamente separado das espcies descritas anteriormente,
sendo o seu vizinho mais prximo, o Agrobacterium vitis, com 96,2% de homologia,
deduzido pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. As clulas so Gram-negativas,
aerbias e mveis, quimiorganotrficas e utilizam uma srie de cidos orgnicos e
aminocidos como fonte de carbono para crescimento.
Alm dos rizbios, bactrias pertencentes ao gnero Frankia, tambm fazem
simbiose com diversas plantas. Essas bactrias so aerbias ou microaeroflicas, Gram-
positivas, embora as clulas mais velhas podem ser Gram varivel, pertencendo ordem
Actinomicetales, uma ordem de bactrias filamentosas, sendo a simbiose chamada de
actinorriza. H uma grande diversidade de plantas noduladas por Frankia incluindo mais
de 200 espcies distribudas em 24 gneros de oito famlias.
O processo de infeco por Frankia inicia-se como uma relao simbitica com a
planta hospedeira, podendo ser de dois tipos, infeco de razes e infeco via
penetrao intercelular, sendo estes modos anlogos aos observados nos legumes
simbiticos. Ao contrrio dos ndulos dos legumes que so limitados por oxignio,
ndulos actinorrizais mostram mxima velocidade de fixao de nitrognio em nveis
atmosfricos de oxignio. Plantas actinorrizais so mais numerosas e possuem maior

87
diversidade em regies temperadas, onde so freqentemente encontradas em solos
pobres em nitrognio.
Uma outra simbiose de grande importncia a que ocorre entre as cianobactrias
e vrias plantas. Elas so procariotos Gram-negativos, que fazem fotossntese, com
aspectos muito similares as plantas superiores. Possuem clulas especializadas em fixar
nitrognio, os heterocistos, pois a cianobactria faz na mesma clula a fotossntese
(processo oxignico) e a fixao de nitrognio (processo sensvel ao oxignio). A maior
parte das associaes de espcies dos gneros Nostoc e Anabaena. Alm disso,
fungos e algas formadoras dos lquens constituem alguns exemplos de simbiose (gnero
Collema, Peltigera, Leptogium, etc).

3. FIXAO ASSIMBITICA (ISOLAMENTO DE Azotobacter)


Em geral, j foram descritas espcies representantes de vrios grupos de
procariotos com a capacidade de fixar nitrognio, como as bactrias fotossintticas
(ex.:Rhodospirillum rubrum), as bactrias anaerbicas (ex.:Clostridium spp.), as
microaerbicas (ex.: Azospirillum spp., Herbaspirillum spp., Acetobacter diazotrophicus,
Azorhizobium caulinodans, Azoarcus spp., Burkholderia spp., etc), as bactrias aerbicas
(ex.: Azotobacter spp. e Derxia spp.) e tambm alguns representantes das cianobactrias
(algas verdes-azuladas) e actinomicetos (Frankia). Histrica e economicamente, vrios
diazotrofos tm sido amplamente utilizados como organismos modelos para investigaes
em laboratrios. Clostridium pasteurianum, Azotobacter vinelandii e Azotobacter
chroococcum foram muito utilizados para o isolamento e caracterizao da enzima
nitrogenase.
A maioria das bactrias diazotrficas de vida livre so heterotrficas, requerendo
ecossistemas capazes de prover uma fonte de carbono utilizvel, necessria para a
fixao de nitrognio. Os diazotrofos de vida livre foram os primeiros a serem
reconhecidos, como o caso de Beijerinkia fluminensis e Beijerinkia indica, isoladas da
rizosfera de plantas de cana-de-acar de solos tropicais, sendo demonstrado o seu
potencial na associao com Gramneas.
Bactrias do gnero Klebsiella e Enterobacter, da famlia Enterobacteriaceae, so
anaerbicas facultativas que fixam nitrognio, porm requerem compostos nitrogenados
para crescer sob condies estritamente anaerbicas.
A famlia Azotobacteraceae representada por dois gneros, Azotobacter e
Azomonas, sendo todos aerbicos, heterotrficos e fixadores de nitrognio. Dentre as

88
espcies de Azotobacter conhecidas, as mais comuns so A. chroococcum, A. vinelandii
e A. paspali, sendo esta ltima a mais estudada ecologicamente. Azomonas spp.
encontrada em habitats de gua corrente. Existe somente um relato na literatura sobre a
ocorrncia de uma espcie desse gnero em solo, a A. macrocytogenes.
Os microrganismos que realizam fixao assimbitica ou livre apresentam
contribuio relativamente pequena (12-75 Kg/hectare de solo anualmente). Entretanto,
este tipo de fixao est mais presente que a fixao simbitica, visto ser feita por
microrganismos livres ou independentes, que vivem no solo ou na gua. Dentre estes
microrganismos, podemos destacar as bactrias dos gneros Azotobacter e Beijerinckia.
O gnero Azotobacter tem como caractersticas ser bastonetiforme, parecendo
algumas vezes com leveduras. Suas clulas so flageladas peritrquias, no apresentam
endosporos, so Gram-negativas e aerbias obrigatrias, tendo como limites de
temperatura de 9-35 C. A temperatura tima de crescimento varia de 25 a 28 C, com a
temperatura letal variando de 45 a 50 C, numa exposio de 30 minutos. O pH pode
variar de 5,5 a 8,5, havendo variedades cido-tolerantes (pH = 4,6), sendo que estes
organismos esto presentes no solo e na gua. Uma Azotobacter tpica tem uma estrutura
celular muito caracterstica, onde seus bastonetes vegetativos so maiores do que a
maioria das eubactrias unicelulares e ocorrem aos pares. Alm disso, algumas espcies
formam clulas de repouso tpicas (cistos).
Alm de poder utilizar o Mtodo da diluio em srie, outro mtodo que pode ser
utilizado para isolar bactrias, como Azotobacter sp., seria o Mtodo da cultura de
enriquecimento.

3.1 MTODO DA CULTURA DE ENRIQUECIMENTO


Para o estudo de vrios tipos fisiolgicos de microrganismos existentes na
natureza, foi desenvolvida a tcnica da cultura de enriquecimento, ou seja, elabora-se um
meio de cultura com composio qumica definida e inocula-se-o com uma populao
microbiana mista, como por exemplo uma amostra de solo. Examina-se o crescimento
dos microrganismos neste meio, afim de observar quais microrganismos predominam.
Como sua predominncia decorre de sua capacidade de se desenvolver neste meio de
enriquecimento, esse tipo de microrganismo pode ser facilmente isolado pelo
plaqueamento em meio slido de composio idntica.
Para microrganismos que utilizam o nitrognio atmosfrico como nica fonte do
elemento nitrognio, deve-se preparar um meio isento de nitrognio combinado, mas que

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contenha todos os demais nutrientes necessrios ao seu crescimento. Uma amostra de
solo contendo este tipo de microrganismo inoculada neste meio, na presena de N2, e
sobre determinado conjunto de condies fsicas. Podem ser variados inmeros fatores,
como a fonte de carbono, temperatura, suprimento de energia, entre outros fatores. Sabe-
se que este tipo de meio descrito anteriormente altamente especfico para o isolamento
de trs grupos microbianos diferentes: as bactrias aerbias Azotobacter, certas algas
verde-azuladas e algumas bactrias verde-azuladas do gnero Clostridium.

4. EXERCCIO
1) Pesar 100 g de solo, previamente peneirado e homogeneizado; pesar 5 g de amido
(Maizena). Misturar solo + amido em recipiente plstico, utilizando um basto de vidro ou
esptula e adicionar gua da torneira, aos poucos. Misturando-se o material at que seja
obtida uma mistura pastosa, que apresente uma superfcie bem lisa, transferir parte da
mistura para uma placa de Petri esterilizada, moldando a massa de forma que a parte
central se apresente mais elevada que parte perifrica, situada nos bordos da placa.

Pasta de solo + amido

Alisar a superfcie com uma esptula, umedecendo-a sempre que necessrio.


Anotar o no do balco/turma na placa e incub-la em condies ambiente de laboratrio
at a prxima aula.
Comentar sobre as caractersticas do exerccio (meio seletivo para Azobacter sp -
meio isento de nitrognio combinado; desequilbrio da relao C/N).

2) Examinar o tipo de microrganismo predominante que se desenvolveu na superfcie da


pasta de solo colocado na placa de Petri;

3) Esquematizar as clulas de Azotobacter sp.

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4) Esquematize a seqncia do preparo do exerccio para o isolamento de Azotobacter do
solo. Qual a principal caracterstica de um meio seletivo para o isolamento de
Azotobacter?

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