Replicao do

DNA

A citosina no DNA
desamina
espontaneamente
originando uracila
Esta reao
potencialmente
mutagnica porque a
citosina pareia com a
guanina, mas a uracila com
a adenina
Na hora da replicao ou transcrio, ocorreria um erro!
Para evitar o erro, existe um sistema de reparo, que
substitui a uracila por uma citosina (uracil DNA-glicosidase)
O grupo metila que distingue a timina da uracila um sinal de
reconhecimento; sem este sinal seria impossvel distinguir a
uracila corretamente presente da uracila resultante da
desaminao da citosina.

A modificao mais
comum a metilao
Tambm o RNA tem muitas
bases modificadas

As bases modificadas pareiam da mesma forma que as

bases originais

Organismo
.

Nmero de pares
de bases (kb)

Contorno
(m)

.
5,1
48,6

.
1,7

Virus:
Polioma, V40
Bacterifago
Bacterifagos T2, T4, T6
Bactrias:
Mycoplasma hominis
Eschericchia coli

Eucariotos (em nmero

haplide de cromossomos):
Levedura
Drosfila
Humanos
Peixe pulmonado

..

760

166

17

55

.
4.000

.
13.500
165.000
2.900.000
102.000.000

260
1.360
.
4.600
56.000
990.000

A hidrlise bsica depende de

uma desprotonizao do grupo
2'-OH da ribose, com formao
de um composto cclico
intermedirio
A falta da hidroxila 2' na
deoxirribose torna o DNA muito
mais resistente hidrlise em
meio aquoso
Este o provvel motivo pelo
qual o DNA e no o RNA evoluiu
como arquivo gentico celular

Replicao
do DNA
O mecanismo de
replicao est
baseado no
pareamento das
bases da dupla
hlice do DNA.
A estrutura do
DNA contm a
informao
necessria para
perpetuar sua
sequncia de
bases

A replicao do DNA semi-conservativa

Cultivo em meio

NH4Cl

15

Experimento realizado
por Meselson & Stahl
em 1958

Cultivo em meio
14

NH4Cl

Purificao do DNA
seguida de
centrifugao em
gradiente de CsCl

A replicao
semi-conservativa foi provada
em experimentos
nos quais o DNA
de Eschericchia
coli foi inicialmente marcado
com 15N, mais
pesado; nas
geraes
sucessoras,
cultivadas sem
15
N, formaram-se
DNAs hbri-dos,
que no se
formariam se a
replicao no
fosse semiconservativa

Diferenciao autoradiogrfica da replicao

unidirecional e bidirecional
do DNA
Aps marcao fraca com
[3H]timidina, uma suspenso de
E. coli recebe um pulso de
grande quantidade de
[3H]timidina. Alguns segundos
aps isola-se o DNA para fazer
autorradiografia. Espera-se
padres diferentes para cada
tipo de replicao

A replicao
bidirecional

A replicao do cromossomo circular

Replicon: Unidade do DNA onde est ocorrendo um

evento de replicao
Replicon:
1. Origem + Trmino
2. Ativados apenas uma nica vez em cada ciclo
celular
3. O genoma de uma clula procaritica constitue um
nico replicon
4. Cada cromossomo eucaritico constitue vrios
replicons e todos so ativados uma nica vez no
ciclo celular ainda que no simultaneamente

A replicao semiconservativa se d a partir de

forquilhas de replicao
Auto-radiografias obtidas com
[3H]timidina revelam a estrutura
(olho de replicao)

A replicao vista como um olho flanqueado

por DNA no replicado

O genoma bacteriano circular constitue um nico replicon

A velocidade da forquillha de
replicao bacteriana
50000pb/min
Um nica origem de replicao
em E.coli (OriC, 245 pb)

Origem de Replicao em bactrias: Somente origens

completamente metiladas podem iniciar a replicao

O genoma eucaritico constitue vrios replicons

A velocidade da forquillha de replicao eucaritica 2000pb/min

Os replicons eucariticos tem 40-100 kb e so iniciados em
tempos diferentes
Fase S demora ~ 6hrs em uma clula somtica

Forquilha de replicao: Regio do DNA onde ocorre a

transio do DNA parental fita dupla para as novas
fitas filhas duplas

Fita contnua (lder)

Fita descontnua

Todas as DNA polimerases operam na direo

5' 3' a partir de um molde antiparalelo

Polimerases de DNA:
As enzimas que
sintetizam DNA
A sntese de DNA
ocorre pela adio de
nucleotdeos a
extremidade 3OH da
cadeia em crescimento. O
precursor da sntese o
desoxiribonucleosdeo 5
trifosfato
Sentido da sntese
sempre 5 3
A replicao um
processo extremamente
fiel. As DNApolimerases tem atividade
revisora

Desoxiribonucleosd
eo 5trifosfato
(precursor)

Fita sendo
polimerizad
a

Fita molde

As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador

previamente pareado ao molde que ser copiado

correto

Pareamento de
bases

incorret
o

Atividade revisora 3 5 garante a fidelidade da replicao

Modelo da estrutura das DNA-polimerases

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas

Pol I
+
+
+

PolII
+
+
-

Nmero de subunidades
Tamanho em kDa

1
103

4
90

10
~900

Velocidade de
Polimerizao(nt/seg)

16-20

40

250-1000

Polimerizao 5 3
Exonuclease 3 5
Exonuclease 5 3

Processividade
3-200
(nt adicionados antes
da dissociao do molde)

1500

PolIII
+
+
-

500000

DNA-polimerase III uma holoenzima de mais de 10

cadeias de estrutura dimrica

A subunidade
Beta da
DNApolimerase
III envolve o
duplex das
fitas-filhas

OriC do
cromossomo
de E.coli

Protenas presentes na origem de Replicao de E.coli

DnaA
DnaB (helicase)

Reconhece a origem e abre a dupla fita em

stios especficos
Desenrola o DNA

DnaC

Auxilia a ligao de DnaB na origem

HU

Protena do tipo histona que estimula a

iniciao
Sintetiza os primers de RNA

Primase (DnaG)

Single strand binding Liga a fita simples de DNA

(SSB)
RNA polimerase
Facilita a ao da DnaA
DNA girase
Dam Metilase

Alivia a tenso torsional gerada pela

abertura da dupla-fita
Metila as sequncias GATC na OriC

Todas as DNA
polimerases
precisam de um
grupo 3'-OH
para estender a
cadeia de DNA
Como, ento, se
inicia a sntese
de DNA?
Uma enzima
chamada primase
(insensvel
rifampicina)
sintetiza um
PRIMER de RNA
tanto na fita
lider como nos
fragmentos de
Okasaki

Uma RNA polimerase pode sintetizar tambm um

primer da fita lder

Todas as DNA polimerases conhecidas so capazes de estender fitas

de DNA apenas na direo 5' 3'
Como, ento, se d a sntese na direo 3' 5' da forquilha de
replicao?

A sntese do DNA semi-descontnua e requer um

iniciador (primer) de RNA
Sntese da Fita descontnua

Fita descontnua
Fita contnua

Sntese da Fita Contnua

Fragmentos
de Okasaki
ocorrem na fita
descontnua
A DNA
polimerase III
responsvel
pela sntese da
maior parte do
DNA
A DNA
polimerase I
remove o
primer de RNA
e preenche as
lacunas
A DNA
ligase sela as
quebras

A DNA ligase sela as quebras

Mecanismo de ao da DNA ligase

Protenas presentes na forquilha de Replicao de E.coli

SSB

Liga a fita simples de DNA

DnaB (helicase)

Desenrola o DNA

Primase (DnaG)

Sintetiza os primers de RNA

DNA Polimerase III

Sintese da fita nova

DNA Polimerase I

Preenche as lacunas e excisa os primers

DNA Ligase

Liga os fragmentos

DNA girase

Superenrolamento

Sntese das fitas contnua e descontnua independente

O complexo de
replicao
A protena DNA B
(helicase) responsvel
pelo movimento para
frente da forquilha
Cada core cataltico
da DNA PolIII sintetiza
uma das fitas-filhas
O primossomo afasta
uma das fitas molde
Protenas SSB
mantem as fitas
parentais separadas

Forquilha
sentido
antihorrio

Terminao

Forquilha
sentido
horrio

Terminao

Duplicao dos
cromossomos

Separao dos
cromossomos e
diviso celular

Provvel sequncia de eventos

durante a iniciao da replicao em E. coli na regio oriC
Os tetrmeros da protena
DnaA ligam a cada um dos 9
pb repetidos no oriC
Molculas adicionais de DnaA
ligam para formar uma
espcie de nucleossomo
As trs regies de 13 pb ricas
em A-T so ento "fundidas"
A protena DnaB separa-se do
complexo DnaB-DnaC e entra
na regio em fuso e a
atividade helicase da DnaB
mantm a conformao
randmica
A protena SSB liga para
estabilizar as fitas separadas

Representao do
conjunto
replissomo
em cada
forquilha
de
replicao

PROTENA

FUNO

DNA girase
SSB
HU

Desespiraliza o DNA
Ligao e estabilizao da fita simples do DNA
Fator de iniciao
Ligao e estabilizao do DNA (semelhante a histonas)

PriA
PriB
PriC
DnaB
DnaC
DnaT
Primase (iniciase)
DNA polimerase III
DNA polimerase I
DNA ligase
Ter

Montagem do primosso, 3'5' helicase

Montagem do primossomo
Montagem do primossomo
3'5' helicase (desespiraliza o DNA)
Chaperona DnaB
Auxilia o DnaC na liberao do DnaB
Sntese do primer de RNA
Elongao (sntese propriamente dita do DNA)
Elimina o primer de RNA, preenchendo com DNA
Liga covalentemente os fragmentos de Okazaki
Trmino

DnaA

DNA-polimerases
dirigidas por RNA
ocorrem em vrus
(transcriptase reversa)

RNA-polimerases
dirigidas por RNA
ocorrem em vrus
e plantas

A enzima de E. coli complexa (450 kd)

SUBUNIDADE

'

NMERO

MASSA
(kd)

FUNO

2
1
1
1

37
151
155
50

Incerta
Forma ligaes fosfodiester
Liga o molde de DNA
Reconhece o promotor e inicia a sntese

Ela executa vrias funes:

1. Procura por stios de iniciao (stios promotores) no DNA
2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hlice do DNA para liberar um
molde de fita nica
3. Seleciona o ribonucleosdeo fosfato correto e catalisa a formao de
uma ligao fosfodiester; este processo repetido muitas vezes
medida que a enzima se move ao longo do DNA
4. Detecta sinais de terminao
5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da
transcrio

Sede da
informao

cido
desoxirribonuclico

A biossntese
de protenas
insere-se no
dogma central
da biologia
molecular

Processo
comprovado
cido
ribonuclico

Processo no
comprovado