Laboratório de Química e Bioquímica Vegetal - LQBV

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
Departamento de Química e Bioquímica
Análises Químicas e Bioquímicas em vegetais
Eng. Agrônomo Me. Gean Charles Monteiro
Eng.ª Agrônoma Ma. Marla Sílvia Diamante
Prof.ᵃ Dr.ᵃ Giuseppina Pace Pereira Lima

Flavonoides totais

1. INTRODUÇÃO
Os flavonoides são um grupo representativo de metabólitos secundários que são
sintetizados pelas plantas, geralmente com um propósito específico. Uma série de
subgrupos dos flavonoides, como flavonóis, chalconas, flavonas, isoflavonas, flavanonas,
antocianidinas e antocianinas, são encontrados nas plantas. Na literatura tem sido relatado
várias funções nas plantas, principalmente nas que sofrem lesões ambientais. Os
flavonoides têm de fato a capacidade de absorver os comprimentos de onda solar mais
enérgicos, além de inibir a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), ao qual
extinguem após formadas.

2. MÉTODO
2.1. Reagentes e soluções
A) Ácido Acético 10%

- Para 250 mL: adicionar 25 mL de ácido Acético Glacial e completar com H2O
deionizada.
- Para 1 L: adicionar 100 mL de ácido Acético Glacial e completar com H2O deionizada.

B) Metanol 70%

- Metanol 70%: 700 mL de Metanol + 300 mL de água deionizada.

C) Metanol acidificado

➢ Metanol 70% + Ácido Acético 10% = Metanol acificado

✓ 850 mL + 150 mL =1L
✓ 85 mL + 15 mL = 100 mL
✓ 17 mL + 3 mL = 20 mL

D) Cloreto de Alumínio (5%)

- Para 250 mL: pesar 12,5g de cloreto de alumínio, diluir e completar com Metanol
acidificado.

2.2. Ensaio
Extração:
- Macerar a amostra em nitrogênio líquido, também podem ser utilizadas amostras
liofilizadas ou secas;

Método adaptado em 01/09/2017

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- Pesar 100 mg da amostra e anotar o peso;

- Colocar em tubo de plástico para centrifugar e adicionar 4 mL de Metanol acidificado;
- Homogeneizar e colocar em banho ultrassônico por 30 minutos;
- Após acrescentar 1 mL de Cloreto de Alumínio (5%), homogeneizar e deixar em
ambiente escuro por 30 minutos.
- Centrifugar a 6.000 a 10.000 rpm por 20-25 minutos em centrífuga refrigerada a 5 °C;
- Recomenda-se fazer todo processo da metodologia no escuro ou com luzes especiais.
Obs: O Al3+ intensifica a absorção de flavonoides e precipita fenólicos que podem
interferir na leitura. Se julgar necessário realizar duas vezes a extração (utilizando 2 mL
por vez de Metanol acidificado).

Reação:
Em tubos de ensaio pipetar da seguinte maneira:

Branco da solução Amostra

- 4 mL de Metanol acidificado - 4 mL da amostra
- 1 mL de Cloreto de Alumínio - 1 mL de Cloreto de Alumínio

- Retire o sobrenadante e realize a leitura (se julgar necessário filtre).

- Leitura a 425 nm (Espectrofotômetro).
Obs: Leitura em cubetas de vidro (G).

2.3. Cálculo
É realizada em cima de uma curva padrão.
✓ Pesar 0,025 g de Rutina ou Quercetina (dependente da amostra)
✓ Diluir em 21,25 mL de Metanol puro
✓ Após completar para 25 mL com Ácido Acético 10%
✓ Pipetar 5 mL dessa solução (Rutina ou Quercetina) e completar para 50 mL com
Metanol acidificado
Obs: Esse 50 mL é a Solução Padrão Final para curva (Rutina ou Quercetina)

Tabela 1. Modo de realização da curva padrão.

Tubo Solução Padrão Metanol acidificado Cloreto de Alumínio (5%)
(mL) (mL) (mL)
1 0,2 3,8 1,0
2 0,4 3,6 1,0
3 0,6 3,4 1,0
4 0,8 3,2 1,0
5 1,0 3,0 1,0
Branco - 4,0 1,0
- Aguardar 30 minutos e realizar a leitura em 425 nm.

Método adaptado em 01/09/2017

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Obs: Nesse caso a curva foi realizada com Quercetina.

Curva Padrão
- Fazer a curva padrão utilizando os dados obtidos (diluições x leituras).
- Cálculo:
✓ Realizado utilizando a equação da reta:

y = 0,0085x + 0,0045
- Digamos que:
- A leitura observada após os 1 hora foi de 0,25 Abs;
- Portanto, substituindo a leitura da amostra (0,25) na equação, vem:

X = (0,25 - 0,0045) = 28,88 ug/mL de quercetina

0,0085

A figura abaixo representa um exemplo de curva padrão:

0,9
0,8
y = 0,0085x - 0,0045 R² = 0,9989
Absorbância (425 nm)

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100
ug/mL de quercetina

Obs: É ainda necessário realizar os cálculos de diluição (usar peso da amostra e volume
do extrator).

Bibliografia
AWAD, Mohamed A.; DE JAGER, Anton; VAN WESTING, Lucie M. Flavonoid and
chlorogenic acid levels in apple fruit: characterisation of variation. Scientia
Horticulturae, v. 83, n. 3, p. 249-263, 2000.
SANTOS, MÁRCIA DÉBORA DOS; BLATT, CECÍLIA TERUMI TERADAIRA. Teor
de flavonóides e fenóis totais em folhas de Pyrostegia venusta Miers. de mata e de
cerrado. Brazilian Journal of Botany, v. 21, n. 2, p. 135-140, 1998.

Método adaptado em 01/09/2017