UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS
PROFA. KARLA FLISTER

PRÁTICA 4: DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA, COCAÍNA, LIDOCAÍNA EM

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA

A. MATERIAL E REAGENTES
• Sílica Gel 60 GF 254
• Padrão de cafeína
• Acetona
• Clorofórmio

B. FUNDAMENTO DO MÉTODO

A cromatografia é uma técnica física para separação de substâncias, fundamentada na

migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a interações individuais com as fases
estacionária e móvel. O valor de Rf (“fator de retenção”) mede a distância percorrida pelo eluente em
relação à distância percorrida pela substância. Os valores de Rf devem ser menor do que a unidade.
Quando este for igual a zero, conclui-se que a substância não se deslocou, quando for igual a
unidade, conclui-se que a mesma se moveu junto com o solvente. Para ambos os casos, a escolha do
eluente não foi apropriada, devendo-se procurar então um novo eluente ou uma nova mistura eluente.

C. PROCEDIMENTO:
1. Ativar as cromatoplacas em estufa (105°C por 1 hora) antes de utilizá-la.
2. Com o auxílio de um capilar de vidro aplicar o padrão e as substâncias problemas na parte
inferior da placa, a aproximadamente 1 cm da base da placa de sílica-gel, fazendo 3 (três)
spots para cada substância.
3. Prepare o eluente clorofórmio/acetona/ de hidróxido de amônio (75 ml/ 25 mL/0,4 ml) e
coloque dentro de uma cuba cromatográfica.
4. Coloque a placa dentro da cuba cromatográfica e feche a tampa. O nível de eluente deve estar
abaixo do nível das manchas na placa.
5. Após a eluição, retire a placa da cuba e deixe-a secar na capela.
6. Borrifar na placa, ainda na capela, a solução de Dragendorff (solução de iodeto de bismuto de
potássio), permitindo a visualização da cocaína na primeira coluna, lidocaína na segunda
coluna com fator de retenção (Rf) maior que a cocaína (a lidocaína é o adulterante mais
difícil de identificar).

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7. Calcule os Rf obtidos em cada experimento, utilizando uma régua para medir as distâncias
percorridas pelo solvente e pelas manchas e confronte os resultados com os padrões de
referência de cada substância.

D. INTERPRETAÇÃO
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica classificada de categoria B, nos
testes definitivos para identificação de substâncias ilícitas, dando uma maior confiabilidade no
resultado.

1. Considerando o uso da placa de cromatografia em camada fina (CCF) ascendente de

Gel de Sílica 60 F254 como fase estacionária e, os dados apresentados, marque a
alternativa correta quanto aos valores de fator de retenção (R1 ) das substâncias 1 e 3.
Sistema de solvente adotado: diclorometano/acetato de etila (4:2). Dados: ds = distância
percorrida pela substância; dfm = distância percorrida pela fase móvel.
a) 0,75 / 0,50
b) 2,0 / 1,3 / 1,5.
c) 0,6 / 1,5 / 2,5.
d) 0,75 / 1,5 / 2,5.
e) 2,0 / 0,5 / 4,0.

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PRÁTICA 5: MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA DE ACETOMINOFENO EM PLASMA

POR ESPECTROFOTOMETRIA

A. MATERIAL E REAGENTES
• Soro
• Nitrito de sódio 0,07M,
• Ácido tricloroacético TCA 3%.
• NaOH 8M
• Solução Estoque de acetominofeno (1mg/ml): pesar 50 mg de acetaminofeno, e
transferir para um balão volumétrico de 50 ml e solubilizados com água purificada,
obtendo-se uma SP de 1 mg/ml.

B. FUNDAMENTO DO MÉTODO

O soro ou plasma é desproteinizado com ácido tricloroacético e o sobrenadante é

tratado com nitrito de sódio para formar 2-nitro-4-acetaminofenol. Este, em meio alcalino,
forma um produto de cor amarela, cuja intensidade de coloração é proporcional à
concentração de paracetamol na amostra.

C. PROCEDIMENTO

1. Preparar a Curva de Calibração utilizando o padrão de acetominifeno 1mg/ml: Diluições

apropriadas da SP foram efetuadas com plasma isento de acetaminofeno para execução do
gráfico de calibração nas concentrações de 20, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg/l (Tabela 1).

Tabela1: Curva de calibração obtida a partir da solução estoque

[mg/l] PADRÃO (µL) SORO (µl) Volume final (500 µL)
20 10 490
50 25 475
100 50 450
150 75 425
200 100 400
250 125 375
300 150 350

2. Desproteinização da amostra: Em tubos de ensaio cônicos (tipo Falcon) adicionar 500 μl de

amostra em 5 ml de TCA 3% em seguida centrifugar por 10 minutos a 5.000 g.
3. Pipetar 2 ml do sobrenadante em outro tubo de ensaio e adicionar 0,5 ml de nitrito de sódio
0,07M, recém-preparados e agitados em mixer por 5 segundos.
4. Levar ao banho-maria por 10 minutos a 37 ± 1oC.
5. Após o banho maria adicionar 100 μl de NaOH 8M (aparecimento da coloração amarela).
6. Realizar as leituras no espectrofotômetro (430nm) após agitação em mixer por 30 segundos.

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7. Calcular a equação da reta usando os pontos da Curva de Calibração para a seguir obter o
valor da amostra problema (1 Micrograma por mililitro [µg/ml] = 1 Miligrama por litro
[mg/l]).

D. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

O resultado da dosagem de acetaminofeno (mg/l) deve ser analisado frente ao nomograma
de Rumack-Matthew, considerando a correlação entre concentração de acetaminofeno e tempo
decorrido entre a ingesta e a coleta do sangue (Figura A). O nomograma de Rummack-Matthew
(1975) é útil para determinar a probabilidade de dano hepático, em função da concentração de
paracetamol e tempo pós-ingestão e a necessidade da administração do antídoto. Portanto, a
dosagem sérica ou plasmática de paracetamol no estágio inicial da intoxicação pode definir se o
tratamento com antídoto N-acetilcisteína é indicado. A N-acetilcisteína deve ser iniciado o mais
rápido possível para minimizar ou evitar o dano hepatocelular. A eficácia do NAC diminui
rapidamente 12 a 24 h após a ingestão do paracetamol.

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PRÁTICA 6: MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA DE SALICILATO EM PLASMA POR

ESPECTROFOTOMETRIA

A. MATERIAL E REAGENTES
• Soro
• Ácido Clorídrico 3M
• Reagente de Trinder Modificado (estoque): Dissolver 4,0 g de sal férrico.9H2O em
500 mL de água destilada. Adicionar 3,0 mL de ácido nítrico concentrado e completar
o volume para 1L. Estável indefinidamente.
• Reagente de Trinder Modificado (uso): Diluir o reagente de Trinder modificado
(estoque) 1:10 com água destilada. Estável por 48h.
• Solução Estoque (1mg/mL): 0,1 g de ácido salicílico sódio e completar com água
destilada para 100mL ou usar salicilato de sódio (0,1165g ) e completar com água
destilada para 100ml.

B. FUNDAMENTO DO MÉTODO
Baseia-se no método de Trinder (1954),13 um método colorimétrico no qual a concentração
de AS é diretamente proporcional à intensidade de coloração violeta do complexo formado entre o
salicilato e os íons férricos, em meio ácido, que é quantificado pela medida da absorbância da luz em
540 nm. Assim, emprega-se um único reagente, o reagente de Trinder, constituído de nitrato férrico,
que fornece os íons férricos, ácido clorídrico e cloreto mercúrico, que precipitam as proteínas séricas
e proporcionam o meio ácido.

C. PROCEDIMENTO
1. Preparar a Curva de Calibração utilizando o padrão de salicilato 1mg/ml: diluições
apropriadas da SP serão efetuadas com plasma ou água isento de ácido salicílico para
execução do gráfico de calibração nas concentrações de 5, 10. 20 e 40 mg/ 100 ml (Tabela 1).

Tabela 1: Curva de calibração do ácido salicílico

CONCENTRAÇÃO PADRÃO (µL) Volume final (1000 µL)
(mg/100ml)
5 50 950
10 100 900
20 200 800
30 300 700
40 400 600
BRANCO: REAGENTE DE TRINDER

2. Transferir para três tubos de centrífuga, respectivamente, 1 mℓ de soro ou plasma (amostra),

1 mℓ da solução padrão adicionada ao branco de soro ou plasma (voluntários não expostos a
salicilatos) em concentração correspondente a 20 mg% (controle) e 1 mℓ de branco de soro
ou plasma (branco).
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3. Adicionar 5 mℓ do reativo de Trinder sob agitação (vórtex), agitar por mais alguns segundos
e centrifugar (2.000 rpm/5 min).
4. Transferir o líquido sobrenadante (que deverá estar límpido) para outros três tubos.
5. Ler a absorvância (540 nm) do produto colorido formado na amostra e no controle, contra o
branco de soro ou plasma
6. Determinar a concentração de salicilato por meio de uma curva de calibração construída
previamente, a partir de alíquotas da solução padrão adicionadas ao branco de soro ou plasma
em concentrações correspondentes a 5, 10, 20, 30 e 40 mg de ácido salicílico/100 mℓ. As
leituras espectrofotométricas são feitas contra o branco de soro ou plasma.
7. As absorbâncias são projetadas em ordenadas e a concentração (mg%) em abscissas.

D. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Como não há antídoto para a intoxicação salicílica, o tratamento é direcionado no sentido de
prevenir uma posterior absorção e aumentar a eliminação. Nesse sentido, apesar de a concentração
sérica de salicilato geralmente não se correlacionar com a gravidade da intoxicação:
✓ Quadros graves ↑35 mg% : o tratamento costuma incluir a alcalinização da urina.
✓ Quadros de maior gravidade ↑100 mg% (algumas vezes até menos com paciente e
com uma acidose acentuada, estado mental alterado, falha renal ou é idoso ou
debilitado: indicada a hemodiálise.
✓
De qualquer maneira, a avaliação da gravidade da intoxicação salicílica, bem como a conduta
terapêutica a ser adotada, não deve ter como base apenas os níveis séricos. É sempre importante
monitorar de maneira conjunta tanto os sintomas clínicos e exames bioquímicos do paciente quanto a
salicilemia, pois pode ocorrer uma rápida piora do quadro, evoluindo ao óbito

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PRÁTICA 7: TRIAGEM DE COCAÍNA EM MATERIAL APREENDIDO

A) REAGENTE CROMOGÊNICO: TIOCIANATO DE COBALTO

Nitrato de Cobalto--------------------------------------------------------6g
Tiocianato de Potássio---------------------------------------------------18g
Àgua q.s.p----------------------------------------------------------------- 100mL

B) TESTES RÁPIDOS:

➢ MÉTODO 1: PLACA ESCAVADA

Uma ponta de espátula da amostra + 50 µL da solução de Tiocianato de Cobalto e homogeneizar

com bastão de vidro e observar a cor resultante.

INTERPRETAÇÃO: Observar o aparecimento da cor AZUL para COCAÍNA

➢ MÉTODO 2: EM TUBO DE ENSAIO

Pesar 20 mg da amostra + 1 mL de água destilada. Homogeneizar e em seguida adicionar, NO

MESMO TUBO, a seguinte sequência de reagentes:

i. 50 µL da solução de Tiocianato de Cobalto: Observar a cor resultante ANTES de

homogeneizar o tubo

ii. 100 µL de HCl concentrado: Homogeneizar o tubo e observar a cor resultante

iii. 1 mL de Clorofórmio: Homogeneizar o tubo e observar a cor resultante

INTERPRETAÇÃO: Teste POSITIVO para COCAÍNA se:

1) Tiocianato de Cobalto : AZUL

2) Ácido Clorídrico (HCl): ROSA
3) Clorofórmio (inferior): AZU

Coloração azul Cloridrato de cocaína

Coloração rosa Cocaína base livre

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PRÁTICA 8: TRIAGEM DE Cannabis sativa L. EM MATERIAL APREENDIDO

1 – TESTE RÁPIDO EM PAPEL DE FILTRO PARA CANABINÓIDES:

Método:
a) Adicionar um pouco da amostra em papel de filtro;
b) Adicionar algumas gotas de Éter de Petróleo (o suficiente para entrar em contato com toda a amostra);
c) Pressionar levemente a amostra contra o papel de filtro;
d) Retirar os fragmentos da amostra do papel de filtro (desprezar);
e) Adicionar Azul de Sólido B + Na2SO4 (1:100);
f) Gotejar água destilada e verificar A COR RESULTANTE

Interpretação:

O desenvolvimento de cor que vai de róseo a vermelho sugere a presença de Cannabis sativa L

2 – TESTE IMEDIATO:

Reativo de Duquenois:

REATIVO DE DUQUENOIS
Vanilina------------------------------------------------------------------------------------- 2g
Acetaldeído------------------------------------------------------------------------------0,3 mL
Etanol q.s.p -----------------------------------------------------------------------------100 mL
OBS: preparar no momento do uso e proteger da luz.
Método:
a) Pesar 5 mg da amostra ;
b) Adicionar 0,5 mL de Éter de petróleo e macerar com bastão de vidro;
c) Levar ao Banho Maria 40ºC – 5 min;
d) Agitar manualmente ou em mixer (10 segundos);
e) Transferir a fase etérea para tubo de ensaio e evaporar à secura
f) Adicionar ao extrato seco:
10 gotas do reativo de Duquenois +0,5 mL de HCl concentrado+ 0,5 mL de Clorofórmio;
g) Agitar manualmente ou em mixer (1 min) e verificar a cor resultante.

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Interpretação:

O desenvolvimento de cor azul violáceo sugere a presença de Cannabis sativa L

Diferenciação da Cannabis sativa L. de outros produtos naturais:

COR EXTRAÍDA PELO

MATERIAL COR INICIAL
CLOROFÓRMIO
Cannabis sativa L. Azul violáceo Violeta
Café (torrado) Castanho violáceo Nenhuma
Óleo patchouli Violeta Nenhuma
Chá (folhas) Azul esverdeado Nenhuma

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

A) MATERIAL
• Placas: Sílica gel GF 254
• Fase Móvel: Hexano : Éter Etílico (80 mL : 20 mL) ou ( 8:2)
• REVELADORES: REATIVO “FAST BLUE B” (Diazotado de orto-dianizidina 0,1% em
metanol) e Hidróxido de sódio 1 M
B) PROCEDIMENTO
1. Macerar ± 0,5 g da amostra em 5 mL de éter de petróleo.
2. Centrifugar e separar a fase orgânica. Levar em banho-maria e reduzir o volume a 100 L.
3. Transferir para uma cromatoplaca aproximadamente 100 µL da fase éter petróleo.
Desenvolver 10 cm na fase móvel.
4. Nebulizar a cromatoplaca com solução "FAST BLUE B", e a seguir, nebulizar com
hidróxido de sódio 1 M.

C) INTERPRETAÇÃO: reação de acoplamento entre o sal e fenóis  rosa-violeta, medir o

RF.

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PRÁTICA 9: TESTE DE TRIAGEM PARA IDENTIFICAÇÃO DE

BENZODIAZEPÍNICOS

MATERIAL:
-Ácido sulfúrico -Formaldeido -Banho maria -Grau e pistilo -Espátula -Tubo de ensaio

PREPARO DO REAGENTE
1-Misture 4 ml de ácido sulfúrico com 6 ml de Formaldeido em agitação e banho de gelo.

TÉCNICA
1-Misture a amostra com o reagente e aqueça por 1 min em Banho Maria a 100º C

IDENTIFICAÇÃO
Formação de coloração alaranjada (Diazepan, Clonazepan, Flunitrazepan e Nitrazepan)

Formação de cor amarela (Bromazepan)

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PRÁTICA 10: TESTE DE TRIAGEM PARA IDENTIFICAÇÃO DE OPIOIDES

MATERIAL
• Ópio ou morfina ou codeína
• Placa escavada
• Água
• Reagente de marquis (10 gotas de formaldeído a 37% em solução de ácido acético glacial 10
ML)
• Ácido sulfúrico concentrado

METODOLOGIA
1. Depositar uma pequena quantidade da substância da morfina ou ópio em uma placa escavada;
2. Adicionar uma pequena quantidade de água, só o suficiente para solubilizar e triturar a
amostra;
3. Adicionar uma gota de reagente de Marquis e a seguir uma gota de ácido sulfúrico

RESULTADO

Formação de cor púrpura indica possível presença destas substâncias.

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PRÁTICA 11: TESTE DE TRIAGEM PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANFETAMINAS

MATERIAL:
• Anfetaminas
• Solução de Formaldeído
• Ácido sulfúrico
• Placa escavada
• Grau e pistilo

PROCEDIMENTO:

• Preparo do Reagente: Adicionar 3 gotas de solução de formaldeído em 3ml de ácido

sulfúrico e acondicionar em frasco conta gotas
• Colocar uma pequena quantidade da amostra em placa escavada e adicionar gota à gota do
reativo, não mais que três gotas

Observar a formação de coloração laranja amarronzada

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PRÁTICA 12: ENSAIO PRIMÁRIO COLORIMÉTRICO DE PESQUISA TOXICOLÓGICA

DE ETANOL (C2H5OH)

MATERIAL
• Tubos de ensaio
• Ácido sulfúrico
• Dicromato de Potássio a 2%
• Amostra a ser analisada (urina)

PROCEDIMENTO
1-Colocar em um tubo de ensaio 1 a 2 ml do líquido a ser examinado
2-Adicionar 1-2 ml de ácido sulfúrico concentrado
3-Adicionar de 1 a 2 gotas de Dicromato de Potássio a 2%

RESULTADO

Uma coloração esverdeada indica reação positiva, não específica.

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PRÁTICA 19: DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINEMIA

A. MATERIAL E REAGENTES
• Sangue (8 ml) coletados em tubo de EDTA;
• Solução de saponina 1%: 1g de saponina qsp 100 ml de água destilada;
• Solução estoque de tampão fosfato: 9 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4.12 H2O) + 5,7 g
de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) qsp 1000mL de água destilada (homogeneizar com
auxílio de agitador magnético até solubilização dos sais).

B. FUNDAMENTO DO MÉTODO

A técnica proposta para a dosagem da concentração da metemoglobina em valores

percentuais se fundamenta na avaliação da solução de hemoglobina, previamente estabilizada em
tampão fosfato 60 mol L-1, em dois comprimentos de onda específicos para metemoglobina (630
nm) e oxiemoglobina (540 nm).

C. PROCEDIMENTO
1. Preparar a solução de trabalho: medir 50 ml da solução estoque de tampão fosfato com auxílio
de uma proveta e, em seguida, transferir para um balão volumétrico de 200 ml e completar com
água destilada.
2. Identificar para cada amostra dois 2 tubos de ensaio (tubo A e tubo B) e seguir a sequência
abaixo:

Tubo A:
1. Colocar primeiramente 100 μl de sangue total coletado com anticoagulante;
2. Adicionar 100 μl de saponina;
3. Agitar a mistura para ocorrer a hemólise;
4. A seguir, adicionar 6 ml do tampão fosfato 60 mol L-1;
5. Homogeneizar a solução por inversão;
6. Transferir a mistura obtida no tubo A para a cubeta do espectrofotômetro;
7. Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 630nm, usando o tampão fosfato 60M
como branco e acerto do zero da absorbância, e fazer a leitura do tubo A, anotando o valor da
absorbância [A].

Tubo B:
8. Colocar 300 μl da solução do tubo A e, a seguir, adicionar 3 ml do tampão fosfato 60 M;
9. Homogeneizar por inversão.
10. Transferir a mistura obtida no tubo A para a cubeta do espectrofotômetro
11. Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 540nm, usando o tampão fosfato 60
mol L-1 como branco e acerto do zero da absorbância, e fazer a leitura do tubo B, anotando o
valor da absorbância [A].

D. CÁLCULO

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Obs.: O coeficiente 10 se deve à diluição realizada no tubo B (300 ml do tubo A: 3 ml do tampão fosfato),
para obter sensibilidade técnica na leitura espectrofotométrica da oxiemoglobina em 540 nm.
A leitura do tubo A em 630 nm avalia a absorbância da metemoglobina obtida da hemólise
dos eritrócitos e diluída em solução tamponada. Por outro lado, a leitura do tubo B, sob as mesmas
condições, avalia a absorbância da oxiemoglobina em 540 nm.

E. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

C) Toxicologia Ocupacional

Valores normais de metemoglobina variam de 1,9 a 3,8%, sendo que acima de 4% são
considerados elevados. OBS: a técnica original de Evelyn e Malloy determina que os valores
normais sejam variáveis entre 0% e 2%.

O Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) de metemoglobina para a exposição

ocupacional aos metemoglobinizantes no Brasil é de 5,0%.

D) Toxicologia Clínica

% metemoglobina na Quadro clínico

intoxicação aguda
< 15 Em geral, assintomático
15-20 Cianose leve, sintomas leves (fadiga, dor de cabeça)
20-30 Cianose evidente, sintomas moderados (fadiga, dor de cabeça, dispneia,
síncope, incapacidade de se exercitar, tontura, fraqueza)
45 -70 Cianose grave, sintomas graves (taquipneia, acidose metabólica, disritmia,
convulsão, depressão do SNC, coma)
> 70 Hipoxia grave, geralmente letal

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