ROBUSTEZ DO MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE

COMPOSTOS FENÓLICOS EM MEL DE MELATO DE

BRACATINGA (Mimosa scabrella Bentham) POR HPLC/DAD
B. Silva1, L.V. Gonzaga1, R. Fett1, A.C.O. Costa1
1-Departamento de Ciências dos Alimentos – Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências
Agrárias – CEP: 88034-000 – Florianópolis – SC – Brasil, Telefone: (48) 99600-3580 – e-mail:
(bibianaengenheira@hotmail.com)

RESUMO – Neste trabalho, foi avaliada a robustez do método cromatográfico para determinar
compostos fenólicos em amostras de mel de melato de bracatinga (Mimosa scabrella Bentham),
usando o teste de Youden. O teste de Youden se mostrou um método eficiente para avaliar a robustez
de métodos cromatográficos, através de delineamento experimental envolvendo sete parâmetros
analíticos combinados em oito testes. Os parâmetros volume de injeção e concentração de ácido
fórmico na fase móvel apresentaram maior influência na análise. O método foi considerado robusto
podendo ser adotado para uso em outros laboratórios.

ABSTRACT – In this work the robustness of the chromatographic method to determine phenolic
compounds in honey samples of bracatinga honeydew honey was evaluated using the Youden’s test.
The Youden test proved to be an efficient method for evaluating the robustness of chromatographic
methods through experimental design involving seven analytical parameters combined in eight tests.
The parameters injection volume and concentration of formic acid in the mobile phase presented
greater influence in the analysis. The method was considered robust and could be adopted for use in
other laboratories.

PALAVRAS-CHAVE: teste de Youden; HPLC-DAD; flavonoides; ácidos fenólicos

KEYWORDS: Youden’s test; HPLC-DAD; flavonoids; phenolic acids

1. INTRODUÇÃO

Em análises químicas, é necessária a validação dos métodos, a fim de atender aos requisitos
estabelecidos pelos regulamentos elaborados por autoridades reguladoras. Dentro deste contexto,
atualmente o teste de robustez tem despertado interesse. A robustez de um método é avaliada através
da sua capacidade de manter o desempenho esperado quando pequenas alterações deliberadas são
introduzidas no método, que podem ou não ter influência significativa sobre seu desempenho. Para
correta avaliação da confiabilidade do método para uso de rotina em um ou mais laboratórios, é
necessário que um número considerável de variáveis seja considerado, mas devido ao fato de algumas
apresentarem efeito desprezível, é possível avaliar diversas variáveis simultaneamente (ANVISA,
2004).
A avaliação robustez de um método cromatográfico é geralmente laboriosa e complexa,
levando-se em consideração o número de variáveis que podem ser consideradas na execução do teste.
Parâmetros como composição e fluxo de fase móvel, pH, temperatura, entre muitos outros podem ser
considerados, o que justifica a importância da avaliação. O teste de Youden é recomendado
(EURACHEM, 2014; INMETRO, 2011), pois além de avaliar a robustez do método aponta a
influência de cada variável avaliada no resultado final (YOUDEN e STEINER, 1975).
O objetivo deste trabalho é avaliar a robustez do método cromatográfico para determinação de
18 compostos fenólicos em mel de melato de bracatinga. Este mel é produzido pelas abelhas a partir
das excreções de insetos sugadores no caule da bracatinga, e sua ocorrência se dá principalmente na
região do planalto serrano de Santa Catarina. Alguns estudos tem apontado que méis de melato
possuem maior teor de compostos fenólicos em comparação a méis florais (ESCRICHE et al., 2014;
HALOUZKA; TARKOWSKI; ZELJKOVIĆ, 2016), e a avaliação do perfil de compostos fenólicos
pode ser usada para ajudar a identificar marcadores de origem ou de autenticidade de méis (CAMPONE et
al., 2014). Contudo, a determinação destes compostos em méis de melato ainda é restrita,
principalmente em méis de melato de bracatinga (SERAGLIO et al., 2016). A robustez do método
cromatográfico foi avaliada através do teste de Youden.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Materiais e reagentes

Padrões de ácidos ferúlico, siríngico, clorogênico, p-cumárico e cafeico, além dos flavonoides
campferol, luteolina, hesperidina, naringenina, pinobanksina, rutina e isoramnetina e o aldeído
coniferaldeído foram obtidos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, EUA). Foram também
utilizados os padrões de ácido benzoico (Riedel-de Haën, Seelze, Alemanha), ácido 3,4
dihidroxibenzóico (Acros Organic, Geel, Bélgica), quercetina (Fluka, Saint Gallen, Suiça), ácido
gálico (Vetec, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil) e ácido salicílico (Nuclear, Diadema, São Paulo,
Brasil). Metanol (MeOH), acetonitrila (ACN), tetrahidrofurano (THF) dimetilsulfóxido (DMSO) e
ácido fórmico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, EUA). Os padrões sólidos
foram diluídos em metanol com exceção de isoramnetina e hesperidina, dissolvidos em DMSO.
Soluções estoque de aproximadamente 1000 µg mL-1, com exceção de pinobanksina
(aproximadamente 500 µg mL-1) foram armazenadas a -18 °C ± 2 até o momento das análises.

2.2 Condições cromatográficas

A separação e quantificação de compostos fenólicos foi realizada em cromatógrafo líquido de
alta eficiência 1260 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, E.U.A.), acoplado a detector de
arranjo de diodos (HPLC/DAD) utilizando coluna Zorbax Poroshell 120 C18 (50 mm x 4,6 mm d.i.,
tamanho da partícula de 2,7 µm). O volume de injeção foi de 3 µL. O gradiente de eluição foi
composto de ácido fórmico 0,1%, MeOH, ACN e THF em 25 min de corrida. Os compostos fenólicos
foram detectados em comprimentos de onda de 240, 260, 280, 300, 325 e 370 nm.

2.3 Avaliação da robustez

Para a determinação da robustez do método foi empregado o teste de Youden. Sete parâmetros
analíticos foram selecionados para avaliação e pequenas variações foram induzidas nos valores
nominais de cada um destes parâmetros, cuja combinação resultou em oito ensaios conforme
apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Parâmetros analíticos e suas variações aplicadas para avaliação da robustez pelo teste de
Youden.

Parâmetro analítico Valor nominal Valor alterado

Temperatura da coluna (°C) 33 32,5
-1
Vazão (mL min ) 0,73 0,75
Volume de injeção (μL) 3,0 3,5
Comprimento de onda (nm) -* + 2 nm**
Tempo de equilíbrio da coluna (min) 4,0 4,5
Concentração de ácido fórmico na fase móvel A (%) 0,10 0,08
Proporção de água na fase móvel de diluição (%) 94,0 91,0
*240, 260, 280, 300, 325 e 370 nm.
** adicionar 2 nm em cada um dos comprimentos de onda.

Amostra de mel de melato de bracatinga proveniente da cidade de Urupema, SC fortificada em

triplicata de preparo foi injetada em cada combinação dos parâmetros de robustez apresentados na
Tabela 2. Para cada combinação foram avaliados as áreas dos picos, a resolução dos picos e o fator de
retenção de cada composto.

Tabela 2. Delineamento experimental dos parâmetros analíticos para avaliação da robustez pelo teste
de Youden.

Combinação fatorial
Parâmetro analítico
1 2 3 4 5 6 7 8
Temperatura da coluna (°C) A A A A a a a a
Vazão (mL min-1) B B b b B B b b
Volume de injeção (μL) C c C c C c C c
Comprimento de onda (nm) D D d d d d D D
Tempo de equilíbrio da coluna (min) E e E e e E e E
Concentração de ácido fórmico na fase móvel A (%) F f f F F f f F
Proporção de água na fase móvel de diluição (%) G g g G g G G g
Condição resultante s t u v w x y z
Letras maiúsculas indicam condições nominais e letras minúsculas indicam condições alteradas.

A média dos valores nominais foi subtraída da média dos valores alterados, para cada um dos
sete parâmetros analíticos estudados, conforme a Equação 1. Para avaliar as diferenças nas respostas
após as alterações foi aplicado o teste t para todos os analitos e parâmetros estudados.

Eq. 1

em que P/p se referem ao efeito de cada um dos sete parâmetros.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 3 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos na resolução

entre os pares de picos de compostos fenólicos adjacentes. Pode ser observado que método é robusto
quanto a resolução entre os pares de picos adjacentes, com valores abaixo de ± 2,00 de variação entre
o valor nominal e o valor alterado, para todos os compostos. Os parâmetros volume de injeção e
porcentagem de água na fase móvel de diluição não influenciaram a resolução, uma vez que o teste t
não apresentou diferenças significativas entre a condição nominal e a alterada para estes parâmetros. O
parâmetro concentração de ácido fórmico na fase móvel foi o que mais influenciou na diferenciação
entre as médias de valores nominais e alterados através do teste t, sendo significativo para 4
compostos. Este parâmetro apresenta grande importância na ionização dos compostos em separações
cromatográficas. O aumento do pH da fase móvel pode alterar a ionização, de modo que o analito será
parcialmente não ionizado, podendo resultar em aumento da largura pico, um dos parâmetros de
cálculo da resolução entre os picos. Os demais parâmetros causaram diferenças significativas apenas
em um composto cada um.

Tabela 3. Efeitos dos parâmetros analíticos na resolução entre os pares de picos de compostos
fenólicos.

Efeitos
Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g
Ácido gálico -0,17 0,43 -0,17 -0,93* 0,37 0,39 0,05
Ácido 3,4 dhb -0,30 0,15 0,17 -0,19 -0,12 -0,17 0,19
Ácido clorogênico 0,03 0,07 0,00 -0,02 0,00 -0,10* 0,02
Ácido siríngico 0,11 0,07 0,02 -0,11 -0,12 0,03 -0,12
Ácido cafeico -0,37 -0,14 -0,43 -0,46 -0,52 0,72 -0,23
Ácido p-cumárico -0,10 -0,05 -0,16 -0,16 -0,08 0,34* -0,14
Ácido ferúlico 0,12 -0,01 0,05 0,09 -0,04 0,11 -0,09
Coniferaldeído 0,01 -0,18* 0,09 0,06 -0,09 0,12 -0,10
Ácido benzóico -0,04 -0,27 -0,06 -0,15 -0,11 0,36* -0,13
Rutina 0,10 0,87* -0,01 -0,02 0,05 -0,19 0,01
Ácido salicilico 0,16 -0,08 0,04 -0,04 -0,13 0,09 -0,13
Hesperidina 0,73 0,96 0,36 0,41 0,79 -2,23* 0,41
Luteolina -0,01 -0,10 -0,19 -0,13 -0,22* 0,07 0,09
Quercetina 0,36 -0,25 0,09 -0,27 -0,05 -0,24 0,08
Pinobanksina 0,04 -0,15 0,06 -0,13 0,11 -0,03 -0,08
Naringenina -0,36* -0,24 0,13 -0,02 -0,21 0,03 0,29
Campferol + isoramnetina - - - - - - -
*diferença significativa (p < 0,05) entre a condição nominal e a alterada, pelo teste t;

Na Tabela 4 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos na área dos picos
de compostos fenólicos. Os parâmetros temperatura da coluna, vazão e tempo de equilíbrio da coluna
se mostraram robustos, sem provocar diferenças significativas devido a alterações dos mesmos. A
alteração do parâmetro comprimento de onda não se mostrou robusta apenas para alterações de área do
ácido benzoico, a alteração do parâmetro porcentagem de água na fase móvel de diluição provocou
alterações de área dos compostos campferol + isoramnetina (quantificados juntos) e a alteração da
concentração de ácido fórmico na fase móvel causou alterações de área dos compostos ácido siríngico
e ácido p-cumárico.
O parâmetro menos robusto foi o volume de injeção, cuja alteração propiciou valores
significativamente diferentes para 13 compostos, sendo, portanto, o parâmetro mais susceptível a
provocar alterações de área dos compostos, visto que devido a sensibilidade do sistema de HPLC,
alterações de volume de injeção, ainda que pequenas, são detectadas pelo sistema e provocam aumento
do sinal analítico. Sistemas cromatográficos automáticos podem minimizar possíveis erros
relacionados ou volume de amostra injetado.
Tabela 4. Efeitos dos parâmetros analíticos na área dos picos de compostos fenólicos.

Efeitos
Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g
Ácido gálico 3,32 9,26 -27,01* 8,13 3,40 -5,26 -2,68
Ácido 3,4 dhb 3,92 9,21 -28,94* 8,62 -0,30 -11,95 -6,15
Ácido clorogênico -1,31 5,38 -11,66* 2,98 2,95 -5,64 -4,60
Ácido siríngico 13,56 14,30 -5,83 -5,32 -11,47 -28,41* 11,03
Ácido cafeico -4,08 2,61 -18,19* 0,01 7,86 -5,27 2,41
Ácido p-cumárico 22,23 34,33 -33,39 12,35 14,75 -63,63* -1,59
Ácido ferúlico 3,28 16,36 -24,74* 4,40 -0,54 -14,54 0,50
Coniferaldeído 3,89 13,88 -21,61* -15,46 -2,51 -11,92 2,97
Ácido benzóico 11,17 -2,69 -21,93 72,38* -7,99 -1,01 -9,51
Rutina 0,69 0,14 -5,92* 3,27 -0,46 -1,27 2,04
Ácido salicilico 4,51 -7,58 -22,19* 10,76 14,46 4,21 -0,80
Hesperidina -9,02 -0,44 -22,98* -7,22 -6,82 17,92 -3,31
Luteolina 0,24 2,83 -6,55* 3,13 1,10 -1,10 2,03
Quercetina 2,27 -0,30 -0,49 0,58 1,21 0,01 6,97
Pinobanksina -20,91 -0,50 -29,87* -17,68 6,91 2,37 8,41
Naringenina 0,96 2,64 -72,04* -35,94 -2,89 -6,05 16,39
Campferol + isoramnetina -1,29 2,72 -10,42* 2,14 0,93 -2,40 15,76*
*diferença significativa (p < 0,05) entre a condição nominal e a alterada, pelo teste t;

Na Tabela 5 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos no fator de

retenção dos compostos fenólicos. Nenhum parâmetro avaliado provocou diferenças significativas
entre as condições nominais e alteradas para todos os compostos.

Tabela 5. Efeitos dos parâmetros analíticos no fator de retenção dos picos do método para
quantificação de compostos fenólicos.

Efeitos
Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g
Ácido gálico -0,05 0,06 0,06 0,06 0,05 -0,08 -0,03
Ácido 3,4 dhb -0,10 0,11 0,10 0,10 0,09 -0,14 -0,05
Ácido clorogênico -0,16 0,21 0,15 0,12 0,09 -0,13 -0,09
Ácido siríngico -0,16 0,24 0,15 0,14 0,11 -0,16 -0,08
Ácido cafeico -0,19 0,16 0,17 0,19 0,13 -0,16 -0,14
Ácido p-cumárico -0,27 0,13 0,22 0,25 0,15 -0,13 -0,21
Ácido ferúlico -0,27 0,12 0,24 0,26 0,15 -0,09 -0,24
Coniferaldeído -0,26 0,15 0,26 0,27 0,15 -0,11 -0,24
Ácido benzóico -0,29 0,13 0,29 0,30 0,17 -0,13 -0,26
Rutina -0,33 -0,06 0,27 0,29 0,11 0,10 -0,35
Ácido salicilico -0,37 0,08 0,32 0,33 0,17 0,04 -0,33
Hesperidina -0,37 -0,13 0,30 0,30 0,11 0,16 -0,42
Luteolina -0,51 -0,16 0,37 0,42 0,19 0,20 -0,64
Quercetina -0,55 -0,18 0,39 0,43 0,18 0,21 -0,65
Pinobanksina -0,56 -0,15 0,41 0,45 0,19 0,20 -0,64
Naringenina -0,57 -0,19 0,41 0,45 0,20 0,23 -0,68
Campferol + isoramnetina -0,63 -0,25 0,44 0,48 0,20 0,34 -0,75
 O Inmetro (2011) recomenda que se não houver diferença significativa, deve-se calcular a
média e o desvio entre os 8 resultados, de s até z. O coeficiente de variação entre os 8 ensaios para o
fator de retenção dos compostos variou entre 2,69 e 7,11%, demonstrando a robustez do método para
avaliação do fator de retenção.
Pode ser observado que a aplicação do teste t é importante na avaliação da robustez de
métodos analíticos, pois a avaliação através apenas dos dados obtidos da equação recomendada pelo
teste de Youden pode gerar interpretações equivocadas referentes aos parâmetros analíticos testados
para alguns compostos.

4. CONCLUSÕES
Os resultados mostram que os parâmetros que exigem mais atenção são o volume de injeção e
a concentração de ácido fórmico na fase móvel, já que estes foram os responsáveis por propiciar
diferenças significativas em maior número de compostos. Entretanto, pode-se considerar que o método
é adequadamente robusto, uma vez que erros devido a volumes de injeção diferentes não são tão
comuns já que o sistema cromatográfico é completamente automatizado. O preparo correto de fase
móvel é uma etapa crítica, seja pela importância de manutenção do sistema em perfeitas condições de
uso, seja pela preocupação em não provocar alterações quando do preparo incorreto.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia para Qualidade em Química

Analítica: Uma Assistência a Acreditação. [s.l: s.n.]. v. 1
CAMPONE, L. et al. Determination of phenolic compounds in honey using dispersive liquid-liquid
microextraction. Journal of Chromatography A, v. 1334, p. 9–15, 2014.
ESCRICHE, I. et al. Suitability of antioxidant capacity, flavonoids and phenolic acids for floral
authentication of honey. Impact of industrial thermal treatment. Food Chemistry, v. 142, p. 135–143,
2014.
EURACHEM. The fitness for purpose of analytical nethods – a laboratory guide to method
validation and related topicsEurachem Guide, 2014. Disponível em:
<http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/valid.pdf>
HALOUZKA, R.; TARKOWSKI, P.; ZELJKOVIĆ, S. Ć. Characterisation of phenolics and other
quality parameters of different types of honey. Czech Journal of Food Sciences, v. 34, n. No. 3, p.
244–253, 2016.
INMETRO. (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial). DOQ-CGCRE-
008. Orientação sobre validação de métodos analíticos, p. 20, 2011.
SERAGLIO, S. K. T. et al. Development and validation of a LC-ESI-MS/MS method for the
determination of phenolic compounds in honeydew honeys with the diluted-and-shoot approach. Food
Research International, v. 87, p. 60–67, 2016.
YOUDEN, W. J.; STEINER, E. H. Statistical manual of AOAC – Association of Official Analytical
Chemistry. Washington: AOAC, 88 p., 1975.