Unidade curricular

Genética

Trabalho Prático I –Determinação da sensibilidade ao sabor amargo pela

deteção de polimorfismo Taster/Non Taster relativo ao gene TAS2R38

Extração de DNA genómico a partir do epitélio bocal

Para a extração de DNA da mucosa bucal irá utilizar-se o “NZY Tissue gDNA Isolation Kit” (ref.
MB13502, NZYTech).

Recolha da amostra
1. Esfregar várias vezes com firmeza a mucosa bucal, com a escova ou zaragatoa. Deixar secar
ao ar

Lise Celular
2. Colocar a escova ou zaragatoa num tubo de microcentrífuga de 2 mL, e adicionar 400 uL de PBS e
25 uL de Proteinase K (rodar a escova ou zaragatoa)
3. Misturar no vórtex 2x 10s e incubar 10min a 56oC
4. Transferir o máximo que conseguir da solução de lisado para um novo tubo de microcentrífuga de
2 mL

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Genética

5. Adicionar 400 uL de solução NL e agitar vigorosamente no vórtex

6. Incubar as amostras durante 10min a 70oC

Purificação do DNA
7. Adicionar 400 uL de etanol 96-100% a cada amostra e misturar no vórtex
8. Transferir 600 uL do lisado celular para uma coluna com base de sílica e centrifugar 1min a 11,000
xg (repetir este passo até passar toda a solução pela coluna); descartar o sobrenadante Fixar o DNA
à coluna)
9. Adicionar 500 uL de solução NW1 e centrifugar 1min a >11,000 xg; descartar o sobrenadante
10. Adicionar 600 uL de solução NW2 e centrifugar 1min a >11,000 xg; descartar o sobrenadante
11. Centrifugar a coluna vazia durante 2min a >11,000 xg

Eluição do DNA
12. Inserir a coluna num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, e adicionar 50-100 uL de solução NE
diretamente na membrana da coluna
13. Incubar 1min à TA e centrifugar durante 2min a >11,000 xg (repetir este passo)
14. Guardar o gDNA a 4oC. Para guardar durante longos períodos, guardar a -20oC ou a -80oC

Rendimento esperado
Até 35 ug de DNA a partir de 107 células