Protocolo Trizol

Fazer na capela.
1. Misturar a amostra com o trizol: 100 ul sangue + 900ul Trizol.
Misturar com uma pipeta de 1000ul (capacidade 700ul). Homogeneizar 5x não
muito forte para evitar que forme espuma.
Obs: O sangue ficará opaco. É normal.

2. Descansar: Deixar descansar por 5 minutos

3. Acrescentar 200ul de clorofórmio e levar ao vortex por 30 segundos. Ocorrerá a

separação em 2 fases. O clorofórmio é mais pesado. Trizol é rosa (anilina).
OBS: no máximo 2 amostras por vez

4. Centrifugar a 12.000G, por 15 minutos a 4°C

OBS: Após a centrifugação formará 3 fases:
RNA – fase líquida.
DNA
Fenol + trizol e fase proteica.

OBS: Para retirar o DNA: Primeiro tira o RNA e guarda o tubo na geladeira até o dia
seguinte e, então, extrai o DNA.

5. Retirar o RNA: Retirar de 150 a 250ul. Máx: 200ul. Não retirar tudo
Pipeta em pé

Tubo a 45°

6. Misturar o RNA extraído com etanol puro: Acrescentar a quantidade de RNA

extraído em outro eppendorf com 1000ul de etanol puro.
OBs: quanto mais gelado o etanol, mais rápido será precipitação.

7. Centrifugar a 12.000G, por 10 minutos a 4°C

8. Verter todo o líquido do eppendorf. O material ficará aderido na parede do
eppendorf
9. Lavagem: acrescentar 1000ul de etanol a 75% e levar ao vortex (30segundos).
10. Centrifugar a 12.000G, por 10 minutos a 4°C
11. Jogar fora todo o etanol.
12. Dissolver o RNA: acrescentar 50ul de free water

Observações
 Pode comprar 1 Litro de free water e fracionar e guardar congelada. Isto evita
que mofe.
 Pipeta de repetição – evita perda de material, pois o RNA é muito líquido.

Amostras de Fezes
1. Até 10% de amostra para 90% de trizol.
2. Pode acrescentar o trizol em amostras já congelada.
Importante: Acrescentar o trizol na amostra ainda congelada. O descongelamento
acarreta perda (morte celular).
3. Misturar a mostra e o trizol com auxílio do Pistilo