Extração de RNA

OBS1: Por meio deste protocolo obtém-se amostras de RNA passíveis de uso
específico pro Kit ZDC RT-qPCR (BioRad)
OBS2: É bom extrair semanalmente amostras de RNA suficientes para
preencher uma placa de RT-qPCR
OBS3: Cautela para evitar contaminação cruzada entre as amostras
OBS4: Esse protocolo está adaptado para lidar com amostras de 140ul
OBS5: RNA viral é estável por até 1 ano quando armazenado à -15ºC ~ -90ºC
OBS6: Descongelamentos sucessivos comprometem a qualidade da amostra
OBS7: Descongelamentos sucessivos podem originar crioprecipitados
OBS8: Buffer AVL nada mais é do que RNase free-water + azido de sódio 0.04%
OBS9: O azido de sódio afeta a espectrometria, interferindo nas absorbâncias
entre 220nm ~ 280nm
OBS10: O QIAmp consegue lidar com RNAs de tamanho >200nt
OBS11: O rendimento de RNA viral obtido pela extração dependerá de:
obs11.1: Tamanho da amostra
obs11.2: Condições de armazenamento da amostra
obs11.3: Titulação viral da amostra
OBS12: O buffer AVL provê condições altamente desnaturantes
OBS13: Add o RNA Carrier ao Buffer AVL melhora a ligação do RNA viral à
membrana e também limita uma possível degradação de RNA por atividade de
RNases residuais
OBS14: O material eluído contém o ácido nucleico (caso presente) + RNAcarrier
OBS15: O tubo onde cairá a eluição deve ser totalmente livre de RNases
OBS16: Todas as centrifugações devem ser feitas sob condições de
resfriamento
OBS17:

ADEMAIS:
Nomear 90 tubos conforme a ordem das amostras
Agora as etiquetas vao ter na vdd a data das extrações, as amostras não terão
mais data
*Preparo de reagentes
1. Preparo do Buffer AW1
2. Preparo do Buffer AW2
3. Preparo do Buffer AVL com RNA Carrier
4. Preparo dos Controles Negativos (ZDC Kit)

5. Preparo dos Controles Positivos (C+) (ZDC Kit)

5.1 Ressuspenda o C+ em 200μl de Buffer T
5.2 Aliquote o C+. Não descongele mais de 1x

6. Preparo dos Controles Internos (IC e IC:100) (ZDC Kit)

6.1 Ressuspender o IC liofilizado em 1ml de Buffer T
6.2 Pipetar 1ul dessa mistura de IC liofilizado + 1ml Buffer T
6.3 Add 99ul de Buffer T ao 1ul pipetado
6.4 Esses 100μl de solução possuem um IC:100
6.5 Aliquote o IC:100 e não o descongele mais de 3x
6.6 OBS: É melhor pipetar 2μl de IC em 198μl de Buffer T
6.7 OBS: Pipetar 1ul de IC:100μl para cada 60μl eluição

Materiais utilizados durante a extração

Pipetas:
1000ul
1~10ul
20~200ul
2~20ul
Ponteiras com filtro:
1000ul
200ul
10ul
20ul
E.P.I
Luvas sem pó
OBS:

Retirada das amostras:

1. Retirá-las do -80ºC com a caixa de transporte de amostras de soro
2. Por essa caixa com as 28 amostras escolhidas no isopor com gelo
3. Transportar pro -20ºC
4. Deixar overnight
5. No outro dia deixar descongelando a 4ºC (faltando 30 minutos pra começar o
experimento)

3. Procedimento:
3.1
4. Pós-procedimento:
Devolva as amostras, transportando-as com a devida cautela, pro freezer
de forma inequívoca, seguindo o mapa do freezer que foi feito.
Marque os tubos que foram descongelados
Secar a centrífuga
Por o plástico nos equipamentos