Extração de DNA de amostras histológicas e citológicas

Ultraprep Tissue DNA Kit (ABH Biotechnologie)

O Ultraprep Tissue DNA Kit baseia-se na lise celular e na ligação, reversível, do DNA a uma matriz
de minerais de argila na presença de multicatiões a baixas concentrações. Os constituintes
celulares de baixo e alto peso molecular, assim como os sais, são removidos da matriz por
lavagem com tampões específicos e com etanol a 70%. Finalmente, o DNA é eluído num tampão
e pode ser utilizado em variadas aplicações (PCR, hibridização, análise de restrição, clonagem,
sequenciação, transfeção, entre outros).

Figura 1- Princípio do kit “Ultraprep Tissue DNA Kit”

Amostras Biológicas
O kit pode ser utlizado para extração de DNA de diferentes tipos de amostras:
- tecidos a fresco ou congelado
- tecidos preservados em etanol
- tecidos fixados em formol e embebidos em parafina
- amostras citológicas
- lâminas (incluindo coradas) com amostras citológicas ou cortes de parafina
Protocolo para cortes em parafina

Material necessário

• Lâminas com cortes

• Bisturi (cabo e lâmina).
• Tubos de 1,5 mL
• Xilol
• Etanol absoluto
• Etanol a 70%

Procedimento

1. Colocar as lâminas com os cortes do tecido a 10µm na estufa durante 30 minutos a 60ºC.
2. Desparafinar os cortes.
3. Iniciar o processo de macrodisseção, se aplicável, com o bisturi. Transferir o conteúdo da amostra
para um tubo de 1,5mL
4. Seguir o procedimento do kit ou guardar a amostra a -20ºC até futura utilização.

Protocolo para cortes em parafina

Material necessário

• Tubos de falcon
• Centrífuga
• Pipetas de Pasteur
• Tubos de 1,5 mL

Procedimento para amostras citológicas

1. Homogeneizar a amostra.
2. Transferir a amostra para um tubo de falcon.
3. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos.
4. Rejeitar o sobrenadante e transferir 1 a 2 gotas do precipitado para um tubo de 1,5mL.
5. Seguir o procedimento do kit ou guardar a amostra a -20ºC até futura utilização.
Protocolo de extração (adaptado de Ultraprep Tissue DNA Kit)

Material necessário

• Micropipetas de 200 µL e 1000 µL

• Pontas de 200 µL e 1000 µL
• Tubos de 1,5 mL
• Centrífuga
• Vortex
• Estufa
• Colunas e tubos coletores do kit
• Etanol a 70%
• Reagentes do Kit (Tampões PB, AB, WB e EB e Proteinase K)

Procedimento

1. Pré-aquecer o tampão PB a 52ºC e homogeneizar antes de usar.

2. Adicionar aos tubos com a amostra 250µl de tampão PB pré-aquecido e 20 µl de proteinase K.
3. Vortexar a velocidade máxima durante 15 segundos.
4. Incubar os tubos a 52ºC até digestão completa (de 60 minutos a overnight) e vortexar
ocasionalmente.
5. Adicionar 250 µl de tampão AB e vortexar durante 5 segundos.
6. Transferir cada amostra para uma coluna com tubo coletor (fornecido pelo kit).
7. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 minuto e rejeitar o conteúdo filtrado.
8. Secar o tubo coletor através do impacto numa superfície dura com papel absorvente.
9. Adicionar 400 µl de tampão WB à coluna.
10. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 minuto e rejeitar o conteúdo filtrado.
11. Secar o tubo coletor através do impacto numa superfície dura com papel absorvente.
12. Adicionar 400 µl de etanol a 70% à coluna.
13. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 minuto e rejeitar o conteúdo filtrado.
14. Repetir os passos 12 e 13 duas vezes (total de 3 lavagens).
15. Transferir a coluna para um novo tubo de 1,5 ml (previamente identificado).
16. Pré-aquecer o tampão EB a 70ºC.
17. Adicionar 100 µl de tampão EB pré-aquecido no centro da coluna (podem ser utilizados volumes
diferentes de tampão de eluição, entre 75 a 150 µl.
18. Fechar o tubo e incubar durante 1 minuto.
19. Centrifugar os tubos a 13000 rpm durante 1 minuto para eluir o DNA.