Aula Prática 1:

Biotecnologia Humana CCNH/UFABC (2023)

Profa. Dra. Ana Claudia O. Carreira Nishiyama

PROTOCOLO DE ISOLAMENTO E CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUMAIS

(MSCs) PELAS TÉCNICAS DE DISSOCIAÇÃO TECIDUAL E EXPLANTE

Objetivos:

Isolar e cultivar células-tronco mesenquimais por protocolo de dissociação celular (demonstração

A, medula óssea –tíbia/fêmur; B, dente de leite; C, pele; D, gordura,); e visualizar células isoladas
de diferentes tecidos (células tumorais de mama e fibroblastos).

RELATÓRIO da Prática: Ao final da prática deve ser redigido um manuscrito/artigo (digitado)

conforme relatado na página 06 deste documento.

Obs: Materiais necessários para 05 grupos de alunos (até 5 alunos por grupo) por período
(matutino e noturno)

Equipamentos necessários:

- Incubadora de CO2 com atmosfera úmida;

- Centrífuga clínica com caçapas para tubos de 15mL;

- Microscópio;

- Lupa/Estereomicrscópio.

Materiais:

Bandeja com os materiais a seguir:

- 01 Becker (500mL) para Descarte de líquidos contendo 50mL de hipoclorito de sódio e 50mL
de água;

- 01 estante para tubos falcons de 50 e 15 mL;

- Álcool 70%.

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- Os tecidos serão entregues pela Profa.: devem ser adicionados nas placas de petri: gordura e
pele (previamente lavados em solução fosfato salina (PBS) + 5x antibióticos (ATB) 50.000UI
penicilina e 50mg estreptomicina e mantidos em meio de coleta (alfa MEM + 5x antibióticos/ATB
50.000UI penicilina e 50mg estreptomicina).

1) Observação do Processo de Isolamento de MSC de medula óssea (tíbia/fêmur) e

dente de leite

Para estes tecidos é necessário a abertura de cavidades nos ossos para acessar as
células.

Fotografar os passos da demonstração e da prática e anotar o necessário para preparo

do RELATÓRIO.

2) Isolamento de MSC de gordura e pele

Todos os materiais e soluções listados a seguir são fornecidos estéreis:

- 02 tubos falcons de 15 mL vazios: 1 tubo para medir o meio de cultivo e o 1 tubo para receber
o tecido fragmentado;

- 01 tubo falcon de 15 mL contendo o meio de cultivo alfa MEM + 15% Soro Fetal Bovino (SFB)
+ 1x ATB (10.000UI/mL penicilina e estreptomicina 10mg/mL);

- 01 tubos Falcon de 15 mL contendo solução fosfato salina (PBS) + 5x ATB;

- 02 tubos Falcon de 50 mL: para filtrar o homogenato tecidual (identificar o tubo para Pele e
outro para gordura);

- 03 pipetas Pasteur plásticas estéreis: 01 para retirar as soluções e 02 para colocar os meios
contendo os tecidos nos frascos de cultivo- ATENÇÃO: Não misturar;

- 02 bisturis descartáveis estéreis- 01 para fragmentar a pele e 01 para fragmentar a gordura;

- 01 pinça anatômica reta estéril (limpar com papel e álcool 70% entre os usos);

- 02 placas de Petri de cultivo celular 60 ou 100 mm estéril (verificar qual foi fornecida);

- 02 garrafas de cultivo celular/frasco-T de 25mm2- um para fragmentar pele e o outro para

gordura;

- 02 filtros tipo peneira/cell strainer de 70um;

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Reagentes:

- ATB: Solução de antibióticos (LGC): 10.000UI/mL penicilina e estreptomicina 10mg/mL

- PBS: Solução Fosfato Salina Tamponada (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ pH 7,2: 137mM NaCl; 2,7mM
KCl; 8,0mM Na2HPO4; 1,4mM KH2PO4

- Meio Alfa MEM: Meio Essencial Mínimo, modificação Alfa com Ribo e Desoxirribonucleosídeos
(LGC)

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Procedimentos:

1) Realizado previamente:
Coleta do tecido: para o isolamento das células do tecido selecionado, o tecido (200mg-1g)
foi lavado na hora da coleta com solução salina estéril 0,9% ou PBS ou meio de cultivo celular
com 5x antibióticos para descontaminação.
Pele: foi removido o excesso de pele com lâmina cortante/bisture.
Os tecidos foram mantidos em solução PBS de coleta contendo 5x antibióticos a 4 °C até o
momento de uso (uso imediato a 72 horas no máximo).

2) Com os tecidos entregues aos grupos:

Com o auxílio da pipeta Pasteur aspirar todo a solução (PBS) de coleta do tubo Falcon,
mantendo a amostra no mesmo. Descartar o líquido no Becker de descarte SEM encostar a
pipeta no conteúdo do Becker.

3) Usando um tubo falcon de 15mL medir cerca de 3mL de PBS + ATB e colocar no tubo com
a amostra. Fechar o tubo e lavar o tecido invertendo o tubo 5x cuidadosamente e sem agitar.
Descartar o líquido mantendo apenas o tecido.

4) Repetir o passo 3 por mais 1x. (Total de lavagens 2x). Retirar todo o líquido e adicionar 3mL
de PBS + ATB e transferir a gordura ou pele para a placa de 35 mm identificadas, com o
auxílio da pinça. Se necessário, retirar os vasos sanguineos e descartá-los.

5) Descartar o líquido da placa com o auxílio da pipeta de pasteur previamente utilizada.

6) Fragmentar o tecido com o auxílio de lâmina de bisturi na placa até virar um “papa”,
sem a presença de fragmentos.
7) Transferir a “papa” para um novo falcon de 15 mL com o auxilio do bisturi. Se necessário
adicione um pequeno volume de PBS + ATB (o suficiente para cobrir o tecido
fragmentado) para auxiliar na transferência.
8) Adicionar um total de 3mL de PBS + ATB ao tubo com a papa. Misturar levemente, por
inversão do tubo, sem agitar.
9) Centrifugar a 400-800rpm em centrífuga clínica. Descartar apenas o líquido com o
auxílio da pipeta Pasteur.

OPCIONAL: o tecido dissociado de forma mecânica pode ser submetido nesta etapa à
dissociação enzimática com a adição de enzimas como colagenases, tripsina etc. Depois dar
seguimento à sequência dos passos descritos abaixo.

10) Adicionar 5mL de meio de cultivo ao material decantado e misturar levemente.

11) Colocar a peneira/cell strainer no tubo Falcon de 50mL e com o auxílio da pipeta pasteur
transferir o conteúdo do tubo anterior para a peneira.

12) Aguarde filtrar. Se necessário usar a pipeta Pasteur para sugar o líquido cuidadosamente
sobre a malha da peneira, e, então, empurrar o volume contra a malha para auxiliar no
processo de filtração.

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13) Separar uma garrafa/frasco T para cada tecido e anotar o nome do grupo e adicionar o
período (manhã ou noite) e data do isolamento das células, e identificar como G (Gordura) e
P (Pele).

14) Adicionar a solução de meio+células que foi filtrada. Na garrafa “Pele” adicionar cerca de 05
pedaços/fragmentos do tecido que não foram filtrados (explantes) usando a pinça desinfetada
com etanol 70%. Este procedimento deverá permitir a observação de possíveis células
liberadas dos fragmentos ao longo dos dias de cultivo.

15) ATENÇÃO: Os monitores também recolherão fragmentos não filtrados de um dos grupos e
adicionarão os mesmos a uma garrafa contendo meio de cultivo para análise de liberação de
células dos fragmentos/explantes.

16) As garrafas serão mantidas em incubadora a 37 °C e 5% de CO2, atmosfera úmida.

17) As células serão fotografadas pelos monitores ao longo dos dias de cultivo.

Observação: após o crescimento das células as mesmas podem ser subcultivadas e congeladas
para os estoques celulares, e semeadas para ensaios de caracterização de marcadores de MSC
por imunofenotipagem (citometria de fluxo, imunofluorecência ou outro imunoensaio) e
submetidas a protocolos de diferenciação para osteo, adipo e condrogênese (por 7, 14 e 21 dias),
e na sequência a colorações de vermelho de alizarina, oil red ou azul de toluidina,
respectivamente a cada diferenciação, visando comprovar que as células isoladas foram MSCs
de acordo com preconizado pela ISSCR- International Society for Stem Cell Research
(https://www.isscr.org/guidelines) e DOMINICI et al., 2006:

“... First, MSC must be plastic-adherent when maintained in standard culture conditions.
Second, MSC must express CD105, CD73 and CD90, and lack expression of CD45,
CD34, CD14 or CD11b, CD79alpha or CD19 and HLA-DR surface molecules. Third,
MSC must differentiate to osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro...”

3) Visualização de células no microscópio:

- Células de Hs578T- células tumorais de mama (humana)
- Células fibroblasto murinos- 3T3

Referências Bibliográficas

- ISSCR- International Society for Stem Cell Research (https://www.isscr.org/guidelines). Acesso em

12/09/2022.

- DOMINICI, M., LE BLANC, K., MUELLER, I., SLAPER-CORTENBACH, I., MARINI, FC., KRAUSE,
DS., DEANS, RJ., KEATING, A., PROCKOP, DJ., HORWITZ, EM. (2006). Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy
position statement. Cytotherapy. 8(4):315-7. doi: 10.1080/14653240600855905.

- Sogayar, M.C., Carreira, A.C.O. 2020. Capítulo 31: Cultura Primária de Tecidos Normais ou
Tumorais. In: Manual do Workshop / Curso Prático 'Biologia molecular da transformação maligna. ISBN
978-65-00-11759-2 1 (13 edição), 270. Acesso em 12/09/2022.
https://drive.google.com/file/d/1IbqQOU9ZBUhgThg1vc2WPZgDBRwmZipa/view

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Relatório de Atividades – Prática 1 (Entrega 01/11/2023)

Mini manuscrito (5-10 páginas)

Capa com nome da disciplina, nome dos alunos, indicando Prática 1 e Título

Resumo: até 250 palavras

- Introdução e Breve revisão de Literatura sobre o assunto

- Material e Métodos

- Resultados (Gerar as figuras dos experimentos) e Discussão

- Conclusão

Referências Bibliográficas (Padrão ABNT)