UNIVERSIDADE POSITIVO

Curso: Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Disciplina: Cultivo Celular Animal

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA EM LABORATÓRIO

Alunas: Danielle Schulhan, Nathany Rabelo e Victória Caroline

Curitiba
2022
 RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA EM LABORATÓRIO

OBJETIVOS

Aplicar conhecimentos obtidos durantes as aulas teóricas desse semestre, como preparo
de meio de cultivo, soluções para dissociação celular, descongelamento da célula,
manutenção, congelamento, repique e plaqueamento.

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Preparo de Soluções;
• Realizar o descongelamento rápido das células;
• Realizar manutenção celular;
• Realizar contagem das células.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 MATERIAIS UTILIZADOS

Foram usados os seguintes materiais para as práticas realizadas:

Balança Analítica

Agitador Magnético

pHmetro

Filtro

Fluxo Laminar

Pipeta de Pasteur

Pipeta volumétrica

Garrafa para cultivo celular

Becker

Proveta
Pipetador Pêra

Microscópio

Câmara de Neubauer

2.2 PRODUTOS UTILIZADOS

Foram usados os seguintes produtos nas práticas realizadas:

EDTA

PBS

Tripsina

Soro Fetal Bovino

Álcool

Detergente

2.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Para o início do experimento foi realizado cálculos, como mostrado abaixo, para se saber
a quantidade de EDTA, PBS e Tripsina que deveria ser pesado para a preparação das
soluções para o cultivo.

Para solução de tripsina 0,05%

Temos que para 1L de solução: 0,05g ------ 100ml
X ------------ 1000ml
X=0,5g
Para preparar em 10X concentrado (usa um Vfinal de 100ml)
0,05% X10 = 0,05% -------- 0,5g em 100 ml

Para solução de PBS/EDTA 10 mM

1M-------- 192,2g ------------- 1L
x------------------- 0,5L
x= 146,1g
1M ---- 146,1g --------- 0,5L
10.10^-3 M ------y
Y= 1,461 g de EDTA em o,5L de PBS

Etapa 1 – Preparo de Solução para Cultivo

Introdução: A preparação das soluções visa ser muito importante para você dosar
e começar a realizar o experimento. Na prática foi utilizado o:
• PBS que possui muitas aplicações, pois é isotônico (tem a mesma pressão
osmótica) e não é tóxico em relação às células. Ele também pode ser
utilizado para diluir diferentes substâncias, como uma solução para
limpeza celular e além disso também serve como tampão no cultivo
animal.
• A tripsina que é utilizada para hidrolisar as ligações peptídicas, essa reação
desestabiliza a matriz, impossibilitando a ligação dos receptores da
superfície celular a matriz.
• E por fim o EDTA, que quela os íons de cálcio presentes no meio
intracelular, quebrando as interações célula-recipiente de cultivo.

Para a agilizar o processo, a turma foi dividida em três grupos e cada um ficou
responsável por preparar um dos componentes.

Preparo da solução de PBS: Foi adicionado um frasco de PBS em pó em 1L de

água destilada, a solução foi homogeneizada, e então foi medido e ajustado o pH.
Por fim, foi feita uma filtração a vácuo com membrana de 0,2 um em fluxo laminar
para esterilização da solução.

Preparo do PBS/EDTA: Foi pesado a quantidade de 1,461 kg de EDTA em uma

balança analítica. Depois de pesado, o composto foi reservado em um Becker.
Com o auxílio de uma proveta, foi medido 0,500 mL de PBS que também foi
colocado no Becker.
Usando um agitador magnético a solução foi homogeneizada até não ser mais
visível partículas sólidas. Em seguida foi medido e ajustado o pH.
Então foi feita uma filtração a vácuo em membrana de 0,2um em fluxo laminar
para esterilização da solução.

Preparo da solução de Tripsina: Foi pesado 0,5g de tripsina, na sequência a

tripsina pesada foi adicionada em um recipiente contendo 100ml de PBS. A
solução foi homogeneizada e então foi realizada a medição e ajuste do pH. Por
fim, realizou-se uma filtração a vácuo com membrana de 0,2 um em fluxo laminar
para esterilização da solução.

Etapa 2 – Descongelamento rápido

Introdução: durante o processo de congelamento são usadas substancias
crioprotetoras como o DMSO e o glicerol que podem ser tóxicos a célula
dependendo da temperatura, assim o processo pelo qual é realizado o
descongelamento é de vital importância para a manutenção de células viáveis.
O descongelamento rápido se dá quando após ser retirada do tanque de nitrogênio,
a célula é inserida em banho Maria a temperatura de 37 ºC e em seguida
adicionada em um meio que será substituído após 24 horas, mantendo assim
apenas células viáveis em cultivo.
As células usadas na prática são de linhagem HFF- Fibroblasto Humano e estavam
congeladas em nitrogênio líquido afim de serem preservadas. Para serem usadas
foi feito um descongelamento, os passos realizados estão a seguir:
1- Foi retirado o criotubo do tanque de nitrogênio;
2- O mesmo foi levado em banho Maria a 37 ºC;
3- Retirou-se o criotubo do banho Maria e deixou que seu conteúdo chegasse a
fase líquida em temperatura ambiente;
4- Manter todos os passos seguintes de forma assépticas;
5-Foi adicionado em um tubo de 15ml o conteúdo do criotubo e 5ml de meio de
cultivo;
6- O criotubo foi lavado com 1ml de meio e esse conteúdo foi adicionado no tubo;
7-Foi completado para dar o volume de 10 m;
8- O tubo foi homogeneizado e levado para centrifuga por 5 minutos;
9- O sobrenadante foi descartado e se adicionou 10 ml de meio ao tubo para
ressuspender as células;
10- Foi realizado o plaqueamento e a incubação das células a 37 ºC em estufa de
CO2 5%.

Depois de lavar as mãos e antebraços com detergente, seca-las e passar álcool para
esterilizar e assim não contaminar as células foi seguido para o próximo passo.

Em um fluxo laminar vertical, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur foi

adicionado 3mL de meio suplementado a uma garrafa Falcon pequena. Enquanto
isso uma pessoa ficou encarregada de pegar o criotubo na geladeira, esteriliza-lo
com álcool e leva-lo para o fluxo laminar. Então, se adicionou o conteúdo de
células do criotubo na garrafa. Com muito cuidado, foi feito um movimento e vai-
e-vem empurrando a garrafa afim de se formar um filme com o meio e as células
no fundo. Feito isso, a garrafa foi tampada, deixando a tampa levemente folgada
para a entrada de CO2, e levada a estufa de CO2.

Etapa 3- Manutenção Celular

Introdução: a manutenção das células por meio da troca de garrafas e
redistribuição se faz necessária em razão da inibição por contato, que ocorre
quando a quantidade de células na garrafa excede o ideal próximo aos 70%, assim
o contato célula-célula inibe o crescimento e pode levar a morte celular. A retirada
do excedente mantém o número de células próximo ao ideal, isso se da por um
processo intitulado passagem que consiste na renovação de células de uma garrafa
para outra.
Células aderentes e não aderentes possuem passagens diferentes, no caso da não
aderente o processo é similar a uma diluição em que se adiciona novo meio,
enquanto as aderentes necessitam de métodos específicos pois interagem com o
fundo da garrafa
Para proceder-se o experimento, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur foi
removido o meio de cultivo da placa de Petri e descartado; a célula fica aderida
na parede da placa. Foi adicionado então 3mL da solução Tripsina-EDTA com a
ajuda da pipeta de Pasteur de forma que se formasse um filme no fundo da placa.
Logo após, a placa foi incubada por 5 minutos no ambiente. Decorrido esse tempo
o fundo da placa foi novamente lavado com a solução de tripsina EDTA, e a
solução foi adicionada a um tubo contendo 5mL de meio suplementado com Soro
Fetal Bovino. O tubo foi levado então a uma centrifugação por 5 minutos para a
precipitação das células. Ao fim da centrifugação, o sobrenadante foi retirado com
o auxílio de uma pipeta de Pasteur, deixando apenas o precipitado de células.
Usando uma nova pipeta de Pasteur foi adicionado 3mL de PBS ao precipitado de
células que ficou no tubo, para homogeneizar a solução com a pipeta foi feito
bolhas de ar. No passo seguinte, a solução foi levada novamente a uma
centrifugação a 1000g por 5 minutos, logo após foi retirado o sobrenadante e
adicionado 1mL de meio suplementado.

Etapa 4 – Contagem

Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur foi adicionado uma quantidade da solução
preparada na etapa anterior na câmara superior e inferior da câmara de Neubauer
para a realização da contagem das células.
Em seguida, a câmara foi levada a um microscópio onde foi possível realizar a
contagem das células nos 4 quadrantes dos cantos (Tabela 1).

Tabela1 – Quantidade de células contadas em cada quadrante da câmara de

Neubauer.
Q1 8
Q2 12
Q3 2
Q4 2

Realizada a contagem, foi feito o cálculo usando a equação abaixo para descobrir
a quantidade de células por mL.

𝑵ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 (𝐐𝟏 + 𝐐𝟐 + 𝐐𝟑 + 𝐐𝟒) × 𝐅𝐚𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐝𝐢𝐥𝐮𝐢çã𝐨 × 𝟏𝟎𝟒

=
𝐦𝐋 𝐍

= NA SOLUÇÃO ESTUDADA, HAVIAM 60.000 CÉLULAS/ML

Onde:

• Q1, Q2, Q3 e Q4 são as quantidades de células em cada quadrante;

• N é o número de quadrantes;
• O fator de diluição é 1;
• E 104 é o fator de conversão da câmara.

CONCLUSÃO
Durante nossas aulas práticas cumprimos todos os requisitos e deu para fazer todos os
passos e avaliar seus respectivos resultados.

3. REFERÊNCIAS
https://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capitulo_5_vol2.pdf