Biologia Molecular – Ciências Biológicas

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – campus de

Jaboticabal- 2º Semestre de 2018

Projeto: Subclonagem do gene da helicase mitocondrial de drosófila no vetor pUAST

Protocolo 2 – Eletroforese em gel de agarose

Na aula prática anterior, foi feita a digestão dos nossos plasmídeos utilizando
enzimas de restrição específicas, conforme ilustrado na tabela abaixo:

Plasmídeos Endonucleases Tamanho esperado dos fragmentos

I) pMT/ Hel WT/Hy XhoI e SpeI ~2Kb e ~9Kb
II) pMT/ Hel mut/Hy XhoI e SpeI ~2Kb e ~9Kb
III) pUAST XhoI e XbaI ~9Kb

Como resultado da ação das endonucleases XhoI e SpeI, geramos nos tubos de
digestão dos vetores I e II um fragmento de ~2 Kb, contendo o gene codificador da
helicase WT ou mutante, e outro fragmento de ~9Kb, contendo o restante do vetor
pMT/Hy, que não será mais alvo de nossa atenção. Além disso, após a ação de XhoI e
XbaI, geramos também o vetor de expressão pUAST linearizado, ~9Kb.
Portanto, nosso objetivo agora será realizar a separação dos fragmentos de interesse
(gene codificador da helicase WT e helicase mutante, e pUAST linearizado) por meio
da eletroforese em gel de agarose.

1) Com o gel de agarose 0,8% previamente feito, preparar a cuba de eletroforese,

inserir a solução eletrolítica (tampão TBE 0,5X) e retirar o pente
cuidadosamente;

2) Nos tubos de digestão, inserir 4µl de azul de bromofenol (tampão de amostra) e

homogeneizar utilizando a pipeta, evitando a formação de bolhas. Manter tubos
no gelo;
Obs.: A proporção de azul de bromofenol geralmente é 1:5 para a quantidade de
amostra.

3) Aplique as amostras no gel na seguinte ordem, pulando uma canaleta entre elas:
Canaleta 1  Marcador de peso molecular de 1Kb (Vol: 5µl)
Canaleta 3  Amostra pMT/ Hel WT/Hy (Vol: 24µl)
Canaleta 5  pMT/ Hel mut/Hy (Vol: 24µl)
Canelata 7  pUAST (Vol: 24µl)

4) Deixar as amostras correrem overnight a 10V.

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Jaboticabal- 2º Semestre de 2018

Projeto: Subclonagem do gene da helicase mitocondrial de drosófila no vetor pUAST

Protocolo 3 – Purificação dos fragmentos de interesse

(Kit Wizard® SV Gel and PCR clean-up System, Promega)

1) Retirar o gel da cuba cuidadosamente, inseri-lo em um recipiente contendo

solução de brometo de etídeo (10 μg/mL) e deixá-lo corando por 5 minutos sob
leve agitação;
2) Cuidadamente, transferir a solução de brometo para a garrafa de estoque e lavar o
gel rapidamente duas vezes com água. Adicionar água até cobrir o gel e deixá-lo
descorando por 10 minutos sob leve agitação;
3) Nomear 3 microtubos de 1,5ml (Hel WT, Hel mut e pUAST);
4) Pegar o primeiro microtubo (Hel WT), pesá-lo e tarar a balança;
5) Com cuidado para não quebrar o gel, colocá-lo sobre o transiluminador; com
auxílio do bisturi, cortar a banda “mais leve” referente ao gene da helicase WT
(~2Kb). Inserir o fragmento de gel recortado dentro do microtubo;
6) Pesar o microtubo e anotar o valor;
7) Realizar o mesmo procedimento para as outras amostras, exceto pelo tamanho da
banda cortada do vetor pUAST, que terá ~9Kb;
8) Dissolvendo o gel: Em cada um dos microtubos, adicionar 10µl de membrane
binding solution para cada 10mg de gel recortado;
9) Vortexar os microtubos por 5 segundos (2x);
10) Incubar os microtubos a 65ºC no banho maria até que o gel esteja totalmente
dissolvido;
11) Ligação do DNA à coluna: Transferir o gel dissolvido de cada microtubo para 3
colunas previamente montadas e nomeadas;
12) Incubar à temperatura ambiente por 1 minuto;
13) Centrifugar a 16 000 x g por 1 minuto. (Não esquecer de balancear a centrífuga);
14) Descartar o flowthrough (líquido que passou pela coluna) e reinserir a coluna no
tubo;
15) Lavagem: Adicionar 700µl de membrane wash solution (solução de lavagem)
sobre cada coluna;
16) Centrifugar a 16 000 x g por 1 minuto;
17) Descartar o flowthrough e reinserir a coluna no tubo;
18) Repita o passo 15, mas, com a adição de 500µl de membrane wash solution.
Centrifugar por 5 minutos;
19) Insira as colunas em microtubos novos previamente nomeados. Deixe os tubos
abertos sobre a bancada por 5 minutos, para que se evapore qualquer vestígio de
álcool proveniente da solução de lavagem.
20) Eluição: Adicionar 30µl de água livre de nuclease sobre a membrana da coluna;
incubar à temperatura ambiente por 3 minutos;
21) Centrifugar a 16 000 x g por 1 minuto;
22) Descartar as colunas e congelar os microtubos contendo o DNA purificado do gel
para uso nas próximas aulas práticas.