PROTOCOLO de FUSÃO e REGENERAÇÃO de PROTOPLASTOS

- Enzimas usadas na obtenção protoplastos

0,03g de macerosina

0,2g de celulase

10 µl pectinase

- Solucões usadas na fusão

CaCl2•2H2O 73 mg ……… para 10 mL de H2O, pH 12

Polyethyleneglycol (PEG) (MW 6000) 5 g ……. para 10 mL de H2O

50% p/v

Protocolo sobre protoplastos

Obtenção de protoplastos
1. Preparar as soluções de TEX, W5 e manitol/W5 armazenando-as a 4ºC.
2. Preparar as enzimáticas em TEX (0,03g de macerosina, 0,2g de celulase e 10µl de
pectinase) – 2h antes de usar
3. Cortar as folhas transversalmente as nervuras, com diferenças de 2mm no
máximo entre cada corte, pondo-as em seguida numa placa de petri.
4. Adiciona-se a mistura do ponto 2 à placa de petri até o volume da mistura
recobrir completamente os cortes nas folhas
5. Incubar o resultado do ponto 4 durante 12 a 15h na ausência de luz.
6. E após esta incubação colocar as caixas de petri em agitação orbital a
velocidades de 60 a 75rpm entre uma a duas horas
7. Após o ponto 6 filtrar a mistura líquida em malha de nylon 100µm para novas
caixas de petri esterilizadas e devidamente identificadas
8. Seguidamente adicionar 3ml de TEX nas placas com os restos das folhas e agitar
lentamente de modo a tentar libertar mais protoplastos das folhas
9. Filtrar novamente em malha de nylon como no ponto 7
10. Das caixas de petri com a solução de protoplastos retira-se 8ml de cada uma
colocando-os em tubos falcon de 15ml devidamente identificados
11. A cada falcon com os 8ml de solução de protoplastos acrescenta-se 2ml da
solução de manitol/W5 feita no ponto 1 e centrifuga-se a 750 rpm durante
15min
12. Retirar os protoplastos (linha verde abaixo dos 2ml de manitol/W5) e coloca-los
em novos tubos falcon devidamente identificados com 8ml de TEX adicionando
2ml de manitol/W5. Centrifuga-se esta nova solução a 750 rpm durante 15min
13. Repete-se o passo 12 mas apenas em 8 ml de manitol/W5
14. Retira-se o sobrenadante quase completamente, deixa-se 1 ml. Este volume
residual é usado para ressuspender o pellet de protoplastos. Após a
ressuspenção dos protoplastos retira-se 10 µl para uma caixa de contagem para
contar os protoplastos.
15. Calcula-se o total de protoplasto no ml presente nos tubos falcon.
16. Centrifuga-se a 750 rpm 10min os tubos falcon e retira-se o
sobrenadanteficando o pellet de protoplastos

Fusão de protoplastos
1. Ressuspende-se o pellet obtido no passo 16 da “obtenção de
protoplastos” em 5ml de CaCl2.2H2O[1M] a pH 12.
2. Retira-se 2ml a cada tubo folcon (com os protoplastos que se pretende
fundir), para um novo tubo falcon (falcon com fusão)
3. Colocar os falcon com fusão em gelo durante 10 min.
4. Após os 10 min executa-se uma centrifugação a 750 rpm durante 10min
5. Retira-se o sobrenadante e ressuspende-se em 1ml de PEG.
6. Incuba-se 15 min à temperatura ambiente e em seguida 35min em gelo
7. Em seguida centrifuga-se a 750 rpm durante 15min
8. Procede-se a duas lavagens em água ultra pura (ressupende-se em 2 ml
de água e centrifuga-se a 750 rpm G 5min) ficando o pellet de
protoplastos

Regeneração de Protoplastos
1. Ressuspende-se o pellet de protoplastos em meio MS ( enriquecido com
auxinas (se o objetivo for obter calli), a 37 ºC, com manitol (109,3 g/L ),
sacarose (25 g/L) e MÊS [2,5 mM])+ agarose 6g/L
2. Depois de homogeneizar a solução do ponto 1 dispô-la numa caixa de
petri ((ou tubo de falcon), pode-se, como opção, adicionar um volume de
meio MS do ponto 1( mas sem agarose) suficiente para recobrir o meio
solido do ponto 1.
3. Dispõe-se as placas de petri na ausência de luz à temperatura de 25 ºC.

Notas:
- A “Regeneração de protoplastos” pode aplicar-se após o ponto 16 da
“Obtenção de protoplastos” ou a partir do ponto 8 da “Fusão de protoplastos”
- É necessário um elevado cuidado com a assepsia pois existem vários passos que
ocorrem fora da câmara de fluxo laminar. Assim é necessário o
acondicionamento asséptico para evitar infeções que possam comprometer a
regeneração dos protoplastos.