Protocolos de Laboratrio

Extrao de DNA plasmidial MINIPREP Mtodo de lise alcalina - Transferir 1,5 mL da cultura bacteriana para um tubo de micro-centrfuga de 1,5 mL; (por inverso, no necessrio pipetar o volume) - Centrifugar por 3 minutos a 12.000 g (= r.c.f.) - Descartar o sobrenadante em um frasco contendo gua sanitria (frasco de descarte!);

Obs.: para um maior rendimento, caso o precipitado bacteriano tenha sido pequeno, podem ser adicionados mais 1.5 mL de cultura ao mesmo tubo e realizar-se uma nova centrifugao!

- Suspender o precipitado bacteriano em 100 L de tampo TE ou gua (agitar no vrtex at completa suspenso das bactrias) - Adicionar 100 L do Tampo de lise - Fechar o tubo e agitar 4 a 5 vezes por suaves inverses, at a soluo ficar homognea (a agitao suave visa minimizar a quebra do DNA genmico!); - Aguardar at 5 minutos ou at a soluo bacteriana ficar transparente e viscosa; - Adicionar 300 L da Soluo de Neutralizao - Agitar 4 a 5 vezes por suaves inverses (a soluo dever ficar homognea e ocorrer formao de um floculado branco); - Centrifugar 5 minutos a 12.000 g; - Transferir, por inverso, a totalidade do sobrenadante para outro tubo de microcentrfuga, (no use pipeta e tome o cuidado para tambm no transferir o material precipitado); - Adicionar 2 volumes (~ 1,0 mL) de EtOH 95% (gelado ou temperatura ambiente); - Centrifugar 15 minutos a 12.000 g - Descartar o sobrenadante no frasco de descarte; - Adicionar 1.0 mL de EtOH 70% e agitar 4 a 5 vezes por suaves inverses (etapa de lavagem do precipitado de DNA para retirada de sais); - Centrifugar por 5 minutos a 12.000 g; - Descartar o sobrenadante e procurar retirar todo o resduo lquido (pode-se bater a boca do tubo invertido sobre papel-higinico) - Deixar secando a temperatura ambiente em sistema a vcuo; - Solubilizar o precipitado de DNA+RNA em 50 ou100 L de Tampo TE
Obs. Na anlise do DNA plasmidial haver a presena de RNA, que pode ser eliminado por incubao com RNAse-A 0,1 a1 mg/mL por 15 a 30 minutos a 37 C

Solues necessrias para a realizao da tcnica: Tampo de Lise: NaOH 0,2 N :: SDS 1% Preparar uma soluo nova para cada novo procedimento!Aps o uso descartar. Para preparar 10 mL de tampo de lise adicione em 9,3 mL de H2O 200 L de NaOH 10N, homogeneizar a soluo e ento adicionar 500 L de SDS 20% Soluo de Neutralizao: Acetato de potssio 3 M pH 4,8-5,3 Tampo TE (Tris-EDTA): Tris-HCl pH 8,0 10 mM, EDTA 1 mM
Verso 02_2007