Purificao do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca inica

Bioqumica Experimental I
Departamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Carla Real Afonso Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, n 40267 Andreia Sousa, n 40261 Telmo Paiva, n 40243 PL 3

26 e 27 de Setembro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

ndice
Resumo ... 3 Material Mtodos. 4 Material . 4 Mtodos .. 5 Resultados e Discusso .. 12 Concluso ... 33 Bibliografia . 35 Anexos I

Pgina | 2

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Resumo
Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um processo de purificao enzimtica atravs da realizao da purificao parcial do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catinica. Posteriormente purificao realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinao do grau de purificao do enzima (atravs de uma electroforese SDS-PAGE), a determinao da actividade enzimtica de algumas fraces recolhidas durante a cromatografia e, por ltimo, o clculo do rendimento deste processo. Na cromatografia de troca inica efectuada foi utilizada uma resina de troca catinica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os caties do meio. Nesta cromatografia usou-se como fase estacionria um permutador catinico fraco, o CMSephadex G-25 e como fase mvel utilizaram-se dois tipos de tampo com diferentes valores de pH. O primeiro tampo utilizado, o tampo Tris (pH 8,2) foi usado para a lavagem da coluna e para as protenas de pI inferior a 10 serem eludas. O segundo tampo, o tampo Carbonatos de Sdio (pH 10,5), foi usado para a eluio das protenas com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluda com o segundo tampo, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10. Como tambm j foi referido, neste trabalho realizou-se tambm uma electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propsito de determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparao com um padro do enzima puro. Como ser possvel ver mais frente, nota-se umas marcas de arrastamento no poo do lisozima recolhido, pelo que sinal da existncia de impurezas (nomeadamente outras protenas). Por fim, de notar que nas fraces onde as actividades enzimticas foram superiores de suspeitar a existncia do enzima. O rendimento associado cromatografia de troca inica foi de 112,2% e o grau de purificao obtido foi de 2002,7 vezes, os quais so incomportveis com o esperado, pois foi usada uma absorvncia de PCO de outro grupo, visto terem sido os nicos a medi-la.

Pgina | 3

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Material e Mtodos
Material
Cromatografia de troca inica Coluna Cromatogrfica 40 x 2,6 cm Bomba peristltica Cronmetro Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de quartzo Aparelho medidor de pH Gaze Material corrente de laboratrio

Doseamento da actividade enzimtica Homogeneizador de Potter-Elvejam Cuvettes de plstico Pipeta automtica Pipeta graduada de 5mL

SDS-PAGE Sistema de polimerizao de gis Placas de vidro para electroforese (mini) Tina de electroforese vertical (mini) Espaadores (0,75mm) e pentes (0,75mm) Fonte de alimentao (500V/150mA) Pipetas automticas

Pgina | 4

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Mtodos
Cromatografia de troca inica Montagem da Coluna Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna Decantar a maior parte do tampo (75% gel sedimentado e 25% tampo sobrenadante) Guardar num recipiente com rolha a 4oC Montar a coluna na vertical e ver se est bem fechada Encher a coluna com Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M Abrir a vlvula para a entrada do tampo e introduzir cerca de 5-10 mL do tampo anterior. Manter a sua sada fechada Verter a mistura do gel em tampo na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, at encher completamente Abrir a vlvula de sada da coluna, mantendo um caudal de tampo Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min Medir o fluxo de tampo atravs da coluna, medindo o volume eludo em 2 min. ATENO: Nunca deixar secar o topo da coluna Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura Equilibrar a coluna atravs da passagem de um volume de tampo inicial de eluio aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel, assim como o dimetro da mesma

Pgina | 5

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Preparao da Amostra Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL

Comprimir a gaze suavemente e o material que passar o filtrado

Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL

Diluir com 35 mL de Tampo Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluio 1/8)
Passar a mistura atravs de uma camada de l de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL. O nome do filtrado ser Preparado da Claro do Ovo (PCO) Manter o PCO a 4C, bem identificado at ao final do trabalho

Aplicao da Amostra

Calibrar um aparelho medidor de pH

Ligar a bomba peristltica e controlar o fluxo de entrada do tampo para 1,6 - 1,8 mL/min

Parar a eluio da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua sada

Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a sada da coluna e iniciar a sua eluio. Cuidado para no secar o gel! Pgina | 6

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Recolher fraces de 15 mL em diferentes provetas at passar na coluna um volume total de tampo aproximadamente igual ao volume da coluna preparada. Controlar o fluxo! Medir o volume de pH de cada fraco recolhida. Coloc-las, s depois, em gelo! Proceder eluio da coluna com tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5) 0,2 M Recolher fraces de 10 mL at registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5 Reduzir, depois, o volume de cada fraco para 5 mL Parar a eluio da coluna quando o valor de pH das fraces estabilizar perto de 10,5 Realizar as leituras de absorvncias das fraces a 280 nm (acertar o zero com gua destilada). Ler tambm as absorvncias do tampo Tris e de carbonatos de sdio Conservar as fraces bem identificadas Lavar a coluna com um volume de tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna Regenerar as condies iniciais passando 2 volumes de soluo tampo de eluio Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) atravs da coluna Indicar na coluna qual o ltimo tampo utilizado

Pgina | 7

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Doseamento da actividade enzimtica

Ajustar o zero do espectrofotmetro a 450 nm com tampio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M

Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma clula de absoro

Adicionar 0,1 mL da fraco em estudo e misturar rapidamente por inverso, tapando o topo da clula com parafilm

Medir o decrscimo da absorvncia a 450 nm da amostra durante um minuto

SDS-PAGE Lavar muito bem as placas de vidro, os espaadores e os pentes com etanol e secar Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaadores colocar a placa de vidro mais pequena

Introduzir a "sandwich" na pea de suporte para a mesma

Apertar os parafusos e confirmar se no h fugas

Introduzir um pente na "sandwich" at ficarem totalmente inseridos entre as duas placas Marcar com uma cante um trao 1,0 cm abaixo do nvel inferior dos dentes do pente. Este ser o nvel at ao qual se introduzir a soluo de gel resolvente ou de separao

Pgina | 8

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Preparao dos gis Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) soluo de gel resolvente Adicionar a soluo do gel resolvente "sandwich" com o auxlio de uma pipeta de Pasteur Introduzir um pouco de gua destilada Evita a formao de uma superfcie de polimerizao irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar Deixar a caixa de polimerizao em repouso at que o gel polimerize Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerizao de modo a escorrer toda a gua da superfcie do gel Introduzir o pente na "sandwich" de modo a no criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar a posio dos poos do pente no gel Quando o gel de concentrao polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poos do gel com gua destilada

Pgina | 9

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Montagem da cmara electrofortica

Retirar a pea auxiliar de montagem da caixa de polimerizao

Deitar na bancada a pea central da cmara de electroforese Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na pea central da cmara de electroforese Introduzir a pea central no reservatrio de tampo inferior da cmara de electroforese

Electroforese Colocar a tampa da cmara electrofortica

Ligar os elctrodos fonte de tenso (ateno polaridade!)

Colocar a voltagem nos 100 V

Registar a intensidade de corrente no incio e no fim da electroforese

Deixar correr a electroforese at o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)

Pgina | 10

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Remoo do gel Desligar a fonte de alimentao e despejar a soluo de electroforese Deitar a pea central da cmara de electroforese na bancada e remover a pea auxiliar de montagem Remover a "sandwich" Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente Levantar o espaador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel Remover a placa O gel ficar agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos do gel Medir o comprimento do gel e a distncia migrada pelo azul de bromofenol

Pgina | 11

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Resultados e Discusso
Grfico de eluio da cromatografia realizada apresentando a absorvncia a 280 nm e valor de pH de cada fraco em funo do volume eludo. Discusso do grfico obtido face s propriedades da tcnica cromatogrfica

Na cromatografia de troca inica efectuada foi utilizada uma resina de troca catinica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os caties do meio. Como a composio em resduos de aminocidos varia de protena para protena, a carga global destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim: as protenas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH inferior ao pI (ponto isoelctrico), ligam-se a uma resina catinica. as protenas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH superior ao pI (ponto isoelctrico), ligam-se a uma resina aninica. Como a resina de troca catinica, ligou as protenas que apresentavam carga global positiva. As outras protenas, como no se ligam coluna foram eludas com o tampo. A protena que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina de troca catinica, para que esta adira coluna, necessrio que tenha carga global positiva, logo, o pH da soluo utilizada na preparao da PCO teve de ser inferior ao valor de pI da protena, bem como o pH da soluo com que se fez a lavagem da coluna. Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se coluna enquanto as restantes protenas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual da coluna e como tal no se ligam, sendo eludas com a soluo inicial. Ao aumentar o pH do tampo de eluio protenas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como tal so tambm eludas com o tampo. Desta forma, obtm-se as diferentes protenas contidas na PCO variando o pH das solues. Se a variao do pH no for suficiente para eluir as protenas da coluna, pode-se aumentar a fora inica do tampo, adicionando cloreto de sdio (NaCl) ou cloreto de potssio (KCl). Assim, a competio entre as partculas do sal e a protena aumenta e o sal comea a ligar-se coluna obrigando as protenas a ser eludas com o tampo.

Pgina | 12

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Quadro 1. Valores das absorvncias (a 280 nm) e de pH das fraces recolhidas na eluio da coluna.

Volume de cada fraco 15 mL 20 mL

10 mL

5 mL

Volume de eluio total 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185

Fraces 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Absorvncia a 280 nm 0,080 0,872 0,936 0,098 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,291 0,270 0,275 0,108 0,078 0,056

pH 8,21 8,21 8,23 8,18 8,16 8,14 8,15 8,17 8,36 8,58 8,63 8,65 8,67 8,69 8,69 8,89 9,52 9,95 10,16 10,35 10,45 10,5

Diluio 1:2 1:3 -

Pgina | 13

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Absorvncia e valor de pH VS volume de eluio

1,2 1,1 1 0,9 Absorvncia a 280 nm 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 Volume eludo /mL 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

pH

Absorvncia pH

Figura 1. Grfico de eluio da cromatografia realizada, sendo a absorvncia (a 280 nm) e o valor de pH de cada fraco em funo do volume de eluio.

Como visvel no grfico anterior (Figura 1), da fraco 1 4, ou seja, dos 15 aos 65 mL eludos, quando se observa maior absorvncia; havendo um pico de absorvncia quando o volume eludo 45 mL, ou seja, na fraco 3. Como o pH do tampo inicial de 8,2, todas as protenas, excepo da Lisozima e da Avidina, so eludas juntamente com o tampo, pois no se ligam coluna por terem carga negativa (como visvel no quadro abaixo quadro 2). Ao alterar a soluo tampo de eluio para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das protenas e como tal a sua ligao com a coluna. As fraces recolhidas comearam a ter valores de pH mais altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluda com o tampo de eluio, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga nula.

Pgina | 14

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Quadro 2. Ponto isoelctrico (pI) das principais protenas presentes na clara do ovo.

Protenas pI 4,5 Ovalbumina 6,05 Ovotransferrina 4,1 Ovomucoide 10,7 Lisozima 5,1 Ovoinibidor Ovomacroglobulina 4,5 3,9 Ovoglicoprotena 10 Avidina

Explicao da variao descontnua do valor de pH das diferentes fraces colectadas na cromatografia de troca inica e a compactao reversvel sofrida pelo gel na coluna durante este processo cromatogrfico. Clculo da fora inica das solues tampo utilizadas. A variao descontnua do valor de pH das diferentes fraces colectadas na cromatografia de troca inica deve-se a terem sido utilizados dois tampes diferentes: Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4 fraces volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos I) Tampo Carbonatos de Sdio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fraces) Se o tampo de eluio utilizado no tivesse sido trocado, aumentando-se o seu pH gradualmente, a variao que se veria nas fraces seria contnua, e no descontnua como foi o caso. A utilizao de dois tampes de eluio diferentes influenciou a altura da coluna inicial (11 cm) devido s diferentes foras inicas dos dois tampes. A fora inica (I) a medida do campo elctrico devido aos ies presentes em soluo. Assim, est relacionada com a concentrao de electrlitos, caties e anies. A foro inica das solues tampo utilizadas podem ser calculadas atravs da seguinte expresso:

Onde espcie.

a concentrao da espcie com carga e

a carga da respectiva

Pgina | 15

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Fora Inica do Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M As equaes que representam o equilbrio do tampo so:

1.

Clculo das concentraes de todas as espcies e respectiva carga

Atravs da equao de Henderson-Hasselbalch, obtm-se:

2.

Clculo da fora inica

Pgina | 16

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Fora Inica do Tampo Carbonatos de Sdio (pH 10,5) 0,2 M As equaes que representam o equilbrio do tampo so:

1.

Clculo das concentraes de todas as espcies e respectiva carga

Atravs da equao de Henderson-Hasselbalch, obtm-se:

2.

Clculo da fora inica

Visto que a fora inica do segundo tampo maior que a do primeiro, o segundo tampo causa o compactamento da coluna. As partculas de gel carregadas negativamente, unem-se mais aos ies Na+ do tampo de carbonatos de sdio por a concentrao destes caties ser superior neste tampo, o que em conjunto com outros ies presentes em soluo aumenta a fora inica causando a compactao da coluna. Este processo de compactao reversvel basta adicionar um tampo com menor fora inica para que a coluna descompacte. Pgina | 17

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Clculo da concentrao proteica de cada fraco e do PCO usando as leituras de Absorvncia a 280 nm

Para o clculo da concentrao das fraces foram utilizados dois valores de coeficiente de absoro molar. (mistura de protenas) (lisozima) Nas fraces em que se suspeita que exista lisozima (fraces 17 19) utilizouse o segundo valor apresentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura de protenas (fraces 1 16 e 20 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:

Fraco 1 (mistura de protenas)

(mistura de protenas)

Fraco 17 (lisozima)

(lisozima)

No caso em que existiu diluio das solues para a obteno de uma absorvncia mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentrao obtida pelo factor da diluio. Por exemplo, a fraco 2:

(mistura de protenas) Pgina | 18

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Como a soluo foi diluda com factor 2, a concentrao real da fraco :

Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.

Doseamento Proteico Volume da Amostra Fraco (mL) PCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 15 15 15 20 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Volume de eluio Total (mL) 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185

pH

Abs280nm

Diluio do ensaio 1:12 1:2 1:3 -

[Prot] (mg/mL)

8,3 8,21 8,21 8,23 8,18 8,16 8,14 8,15 8,17 8,36 8,58 8,63 8,65 8,67 8,69 8,69 8,89 9,52 9,95 10,16 10,35 10,45 10,5

1,487 0,080 0,872 0,936 0,093 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,291 0,270 0,275 0,108 0,078 0,056

17,844 0,080 1,744 2,808 0,093 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,012 0,017 0,014 0,108 0,078 0,056

Pgina | 19

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Discusso das aproximaes realizadas nos clculos anteriores. Sugesto de um mtodo mais rigoroso para a determinao proteica de cada amostra.

Para a determinao da concentrao proteica de cada fraco obtida na cromatografia de troca inica, foi medida a absorvncia de cada uma delas e seguidamente calculou-se a concentrao utilizando a lei de Lambert-Beer ( ).

O mtodo utilizado pode induzir em erro, visto que a concentrao medida no foi apenas das protenas mas sim de todo o contedo existente nas fraces. Assim, para a determinao mais correcta da concentrao proteica deveria ter sido utilizado um mtodo especfico de doseamento de protenas, por exemplo o mtodo de Lowry. O princpio do mtodo de Lowry baseia-se numa mistura contendo o reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma reduo quando reage com protenas, na presena do catalisador cobre (II). A sua principal vantagem a de apresentar uma alta sensibilidade na determinao das concentraes das mesmas. No entanto, apesar do mtodo de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as protenas, o mesmo possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvncia do branco, diminuio da absortividade especfica ou formao de precipitados. Outro mtodo que poderia ser utilizado na determinao proteica o mtodo do Biureto (ver anexos II). No entanto, para alm deste mtodo ser muito menos sensvel que o mtodo apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampo Tris-HCl, j que este um dos poucos interferentes para este mtodo (porque reage com o Cu 2+ presente na mistura).

Representao da actividade enzimtica em funo da concentrao de protena para as diferentes diluies da PCO e ainda para a fraco que apresentava maior actividade enzimtica. Resumir os clculos num quadro.

Em condies adequadas, a velocidade da reaco medida proporcional quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas enzimas no so encontradas puras, no possvel quantific-las, pelo que os resultados so expressos em termos de unidades de actividade (UA), que so definidas Pgina | 20

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0,001 unidades de absorvncia por minuto. Relativamente lisozima, a unidade enzimtica dada pela quantidade de centros catalticos que conduz a uma variao de absorvncia a 450nm de 0,001 unidades por minuto. Para se fazer o clculo das unidades enzimticas utilizada uma frmula que relaciona a variao de absorvncia (Abs) e a variao do tempo (t). Para calcular , fez-se uma regresso linear das rectas obtidas na realizao dos ensaios enzimticos, onde representa o declive dessas rectas. Nesta frmula o tempo vem

em minutos, mas como o espectrofotmetro apresentou o tempo medido em segundos (60 segundos), foi necessrio converter-se esse valor para variao de absorvncia por minuto. Estes valores foram tambm divididos por 0,001, de modo a obter-se o nmero de unidades enzimticas. Assim, a frmula para calcular o nmero de unidades enzimticas : , em que a unidade U, sendo este U = mol.min-1

Nos ensaios enzimticos realizados, s a PCO e a fraco 17 foram diludas, pois so as que se espera registar maior actividade enzimtica. Ainda assim mediu-se a actividade enzimtica para outros picos de absorvncia (Figura 1) para concluir se tinham a lisozima ou no. Para exemplificar os clculos efectuados tome-se como modelo os seguintes clculos:

PCO diluio 1:5

O valor de |Abs450nm/t| obtido atravs do mdulo do declive (m) do grfico (ver Anexos III, Figura III). Neste caso, .

Pgina | 21

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica O nmero de unidades enzimticas :

Como o volume da fraco colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade dada por:

Fraco 17 diluio 3:5

O valor de |Abs450nm/t| obtido atravs do mdulo do declive (m) do grfico (ver Anexos III, Figura IX). Neste caso, O nmero de unidades enzimticas : .

Como o volume da fraco colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade dada por:

Fraco 2

O valor de |Abs450nm/t| obtido atravs do mdulo do declive (m) do grfico (ver Anexos III, Figura XII). Neste caso, O nmero de unidades enzimticas : .

Como o volume da fraco colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade dada por:

Pgina | 22

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fraces correspondes aos picos do grfico 1.

Amostra

Diluio realizada 1:1 1:2

[Prot] (mg/mL) 17,844 8,922 3,5688 1,7844 0,8922 0,4461 0,012 0,0096 0,0072 0,0048 0,0024 1,744 2,808 0,044 0,017 0,014

|Abs450nm/t| (UA/min) 0,0007 0,0006 0,0004 0,0002 0,0002 0,0002 0,0008 0,0008 0,0007 0,0006 0,0004

Actividade (U/mL) 420 360 240 120 120 120 480 480 420 360 240 1,8 0,36 48

PCO

1:5 1:10 1:20 1:40 1:1 4:5

Fraco 17

3:5 2:5 1:5

Fraco 2 Fraco 3 Fraco 8 Fraco 18 Fraco 19

1:1 1:1 1:1 1:1 1:1

0,0002 0,0001

120 60

Pgina | 23

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Actividade Enzimtica em funo da concentrao de protena para as diferentes diluies de PCO

450 400 Actividade Enzimtica (U/mL) 350 300 250 200 150 100 50 0 0,4461 0,8922 1,7844 3,5688 8,922 17,844 Concentrao de Protena (mg/mL) Actividade Enzimtica

Figura 2. Grfico da funo enzimtica em funo da concentrao de protena para as diferentes diluies de PCO.

Actividade Enzimtica em funo da concentrao de protena para as diferentes diluies da fraco 17

600 Actividade Enzimtica (U/mL) 500 400 300 Actividade Enzimtica 200 100 0 0,0024 0,0048 0,0072 0,0096 0,012 Concentrao de Protena (mg/mL)

Figura 3. Grfico da funo enzimtica em funo da concentrao de protena para as diferentes diluies da fraco 17.

Pgina | 24

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Determinao da actividade especfica (SA) da PCO e de cada fraco eluda da coluna A actividade especfica de um enzima (SA) corresponde ao n de moles de substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de enzima. Por outras palavras podemos dizer que igual actividade enzimtica por unidade de massa de enzima usada no ensaio. Assim, para a actividade especfica da PCO e de cada fraco eluda, tem-se que: , onde as unidades enzimticas so dadas por U.mg-1.

Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvncia a 450 manmetros durante 1 minuto para as fraces que apresentavam maior concentrao proteica. Desta forma, apenas foi possvel calcular a actividade enzimtica e a actividade especfica para estas fraces. Em seguida demonstra-se um exemplo do clculo da actividade especfica para uma das fraces:

Fraco 8

Pgina | 25

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Quadro 5. Resumo da purificao do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca inica

Doseamento Proteico Diluio do ensaio Volume da Fraco (mL) Volume de eluio Total (mL) [Prot] (mg/mL) Amostra Abs280nm

Doseamento da actividade enzimtica Actividade (UA/min) (U/mL)

1,8 0,36

PCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

15 15 15 20 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185

8,30 8,21 8,21 8,23 8,18 8,16 8,14 8,15 8,17 8,36 8,58 8,63 8,65 8,67 8,69 8,69 8,89 9,52 9,95

1,487 0,080 0,872 0,936 0,093 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,291 0,270

1:12 1:2 1:3 -

17,844 0,080 1,744 2,808 0,093 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,012 0,017 0,014 0,108 0,078 0,056

0,0007

420

23,54

12

272,73

0,0008 0,0002 0,0001

480 120 60

40000 7058,82 4285,71

10,16 0,275 10,35 0,108 10,45 0,078 10,50 0,056

Pgina | 26

SA (U/mg)
1,03 0,13

pH

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Grfico de eluio da cromatografia realizada representando a concentrao de protena e SA de cada fraco em funo do volume de eluio. Discusso dos resultados obtidos.

Concentrao de Protena e SA em funo do volume de eluio

4,5 Concentrao da Protena (mg/mL) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 30 45 105 160 165 Volume de Eluio (mL) 170 45000 Actividade Especfica (SA) (U/mg) 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

[Prot] (mg/mL) SA (U/mg)

Figura 4. Grfico representativo da concentrao de protena e SA em funo do volume de eluio.

Como visvel no grfico anterior (Figura 4), a actividade especfica maior onde a concentrao proteica menor. Apesar de haver uma maior concentrao proteica na primeira parte do grfico (volume de eluio de 20 a 105), a enzima no est presente, ou est presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras fraces a serem recolhidas e s as protenas com carga negativa foram eludas, ou seja, todas as que tem pI inferior a 8,2, que no o caso do lisozima, enzima do qual se est a calcular a actividade especfica. Este grfico mostra ento que a separao da lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca inica foi eficiente, j que nas fraces em que se esperava obter o enzima, existe actividade enzimtica.

Pgina | 27

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Estudo do electroforama obtido e identificao das principais protenas em cada pista. Relao do electroforama com os cromatogramas anteriores.

A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE). Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resoluo originando, portanto, uma boa separao dos diferentes componentes de uma mistura. Estes gis tambm tm a vantagem de serem fceis de preparar e corar, permitindo revelar e identificar facilmente os compostos separados. Esta electroforese foi realizada sob condies desnaturantes (devido ao SDS, que um detergente), que dissocia as cadeias e as ligaes persulfureto, permitindo a identificao aproximada, por comparao, do tamanho da protena

Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.

Na realizao do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem poros mais pequenos. Desta forma, as protenas maiores, com maior massa molecular

Pgina | 28

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica ficam retidas na camada superior, enquanto as protenas de menores dimenses passam para a camada inferior. Em cada poo seria suposto colocar de protena, podendo ter no mximo

da soluo proteica. Como algumas fraces possuem concentraes muito baixas, o volume a colocar nos poos era muito maior que 10 impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se logo, na .

No electroforama obtido, a ordem de colocao das amostras nos poos a seguinte: 1- Amostra de PCO; tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 2- Amostra do pico 1 (Fraco 3); tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 3- Amostra do pico 2 (Fraco 8); tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 4- Amostra do pico 3 (Fraco 17); tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 5- Amostra do lisozima; tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 6- Marcador; tampo e -mercaptoetanol; 7- Amostra de -globulina; tampo e -mercaptoetanol; 8- Amostra de -globulina; tampo e -mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos: 9- Amostra de -globulina; tampo de aplicao; aquecidos durante 5 minutos. Atravs da comparao das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro 6), cujas massas moleculares so conhecidas, possvel verificar se a fraco que se suspeita ter lisozima est pura.
Quadro 6. Protenas que constituem o marcador.

Protena Fosforilase b BSA Ovalbumina Anidrase carbonica Inibidor de tripsina -lactalbumina

Mr (KDa) 94 67 43 30 20 14,4

Rf 0,36 0,44 0,52 0,65 0,75 0,84

Erro 0,32-0,40 0,39-0,47 0,46-0,56 0,58-0,70 0,66-0,80 0,75-0,91

Pgina | 29

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14,3 KDa, de esperar que as amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparao com o marcador, a massa molecular 14,4 KDa. Assim, possvel concluir que as amostras colocadas no poo 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notvel de lisozima. Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o efeito do -mercaptoetanol (7) e o efeito do -mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8) na -globulina. A -globulina construda por 2 subunidades, quando fica sujeita aco de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se, mostrando no electroforama trs bandas distintas. Uma banda para a protena no desnaturada, e duas para cada uma das subunidades. No caso em que foi estudado o efeito do -mercaptoetanol (7), possvel observar vrias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o mercaptoetanol desnaturou a protena de tal forma que para alm das subunidades se separarem uma da outra, ainda se dividiram em fraces com tamanhos variveis (desde 94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poo 8, a protena tambm desnaturou dando origem a 4 bandas distintas, ou seja, fraces com tamanhos variveis. No caso em que se estudou o efeito do -mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a protena no desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do electroforama).

Quadro de purificao final do lisozima da clara do ovo

Para determinar o rendimento e a purificao do enzima seleccionaram-se as fraces com maior actividade especfica, pois nestas fraces que se encontra a maior parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fraces seleccionadas foram a 17, 18 e 19, j que apresentam actividade especfica 40 000, 7058,82 e 4285,71, respectivamente.

Pgina | 30

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica Para exemplificar o clculo do rendimento e da purificao do enzima, procedeu-se a este clculo para a fraco 17, sendo o clculo para as outras fraces e para a PCO semelhante.

Fraco 17

Sendo a actividade total o somatrio de todas as actividades totais de todas as fraces.

Sendo a actividade especfica total o quociente entre a actividade total e a soma das massas totais de enzima purificado.

Pgina | 31

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Quadro 7. Resumo da purificao do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catinica.

Volume Total (mL)

Massa Proteica total (mg)

Rendimento (%) 112,2

Passo de Purificao

PCO 17 Fraces 18 19 Total

7*1 5 5 5 15

17,844 0,012 0,017 0,014 0,014*

2

124,91 0,06 0,085 0,07 0,215

420 480 120 60 660

2 940 2 400 600 300 3 300

23,54 40 000 7 058,8 4 285,7 47 142,86*3 2002,7

*1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL. *2 O valor de concentrao total a mdia dos valores de concentrao obtidos em cada fraco. *3

Como visvel no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a purificao do valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realizao deste trabalho experimental no se mediu a absorvncia da soluo da PCO utilizada e como tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o valor de absorvncia registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentrao e consequente absorvncia da PCO para a soluo utilizada durante o trabalho, deveria ser maior que aquele que obtemos do outro grupo.

Pgina | 32

Purificao (x)

Actividade (U/mL)

Actividade Total (U)

SA (U/mg)

[Prot] (mg/mL)

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Concluso
Globalmente, este trabalho laboratorial foi constitudo por quatro etapas principais: Cromatografia de troca inica; Doseamento da concentrao de protena; Doseamento da actividade enzimtica; Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A cromatografia de troca inica permitiu-nos separar diferentes fraces da amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes solues constitudas por diferentes conjuntos de protenas. Aps a sua anlise, ao serem medidas as absorvncias das fraces, foi possvel identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima) na sua constituio. A partir da foi possvel analis-las mais detalhadamente e avaliar diversos parmetros que nos permitiram estimar a presena e o comportamento do lisozima. Atravs da determinao da actividade enzimtica de cada fraco, s quais se adicionou substrato de parede celular de clulas de M. luteus, foi possvel medir o decrscimo da absorvncia a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactria em questo. Calculou-se tambm a actividade enzimtica e actividade especfica das diferentes diluies da amostra da PCO e das fraces correspondentes a picos de absorvncia. Por fim, pela realizao da electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais protenas presentes em cada poo, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos trs picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir que, de facto, o pico 3 (fraco 17) continha lisozima na sua constituio, enquanto que os restantes (eludos inicialmente) continham outras protenas que fazem parte da constituio da clara de ovo. Este mtodo permitiu, assim, concluir que foi possvel purificar o lisozima, tal como se esperava. Atravs das fraces com maior actividade especfica determinou-se o grau de purificao do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores Pgina | 33

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

obtidos para estes parmetros no podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos, uma vez que para efectuar os clculos foi necessrio recorrer ao valor de absorvncia da PCO de outro grupo, no correspondendo realidade daquilo que foi observado. Em suma, apesar de no ter sido possvel quantificar o rendimento nem o grau de pureza do lisozima obtido, foi possvel verificar qualitativamente a sua presena e observar a sua actividade cataltica. Desta forma, pode fazer-se um balano positivo relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificao do lisozima da clara do ovo.

Pgina | 34

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Bibliografia
Boyer, RF (1993) Modern Experimental Biochemistry, 2 ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City. Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison Wesley Longman: New York. Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp. 199-206. Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental Methods, 3rd. ed., W.H. Freeman: New York, pp. 95-104. Wilson, K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (Wilson, K e Walker, J, eds.) 4 ed., Cambridge University Press, Cambridge.

Pgina | 35