Você está na página 1de 35
Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica Bioquímica Experimental I

Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

Bioquímica Experimental I

Departamento de Química e Bioquímica Licenciatura em Bioquímica

Docente: Carla Real Afonso

Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, nº 40267 Andreia Sousa, nº 40261 Telmo Paiva, nº 40243 PL 3

26 e 27 de Setembro de 2011

Índice Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Resumo

Índice

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Resumo …………………………………………………………………………

3

Material é Métodos………………………………………………………………. 4

Material …………………………………………………………………. 4

Métodos …………………………………………………………………

5

Resultados e Discussão …………………………………………………………

12

Conclusão ………………………………………………………………………

33

Bibliografia ………………………………………………………………………. 35

Anexos …………………………………………………………………………… I

Resumo Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Resumo

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um

processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do

lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à

purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de

purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da

actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por

último, o cálculo do rendimento deste processo.

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca

catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta

cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CM-

Sephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes

valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a

lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo

tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas

com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o

segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10.

Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma

electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de

determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima

puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no

poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente

outras proteínas).

Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram

superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à

cromatografia de troca iónica foi de 112,2% e o grau de purificação obtido foi de 2002,7

vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de

PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Material e Métodos

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Material e Métodos

Material

Cromatografia de troca iónica

Coluna Cromatográfica 40 x 2,6 cm

Bomba peristáltica

Cronómetro

Espectrofotómetro UV-Vis

Cuvettes de quartzo

Aparelho medidor de pH

Gaze

Material corrente de laboratório

Doseamento da actividade enzimática

Homogeneizador de Potter-Elvejam

Cuvettes de plástico

Pipeta automática

Pipeta graduada de 5mL

SDS-PAGE

Sistema de polimerização de géis

Placas de vidro para electroforese (mini)

Tina de electroforese vertical (mini)

Espaçadores (0,75mm) e pentes (0,75mm)

Fonte de alimentação (500V/150mA)

Pipetas automáticas

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Métodos Cromatografia de

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Métodos

Cromatografia de troca iónica

Montagem da Coluna

Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na
Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir
o gel na coluna
o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna Decantar a maior parte
Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25%
Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25%

tampão sobrenadante)

Guardar num recipiente com rolha a 4 o C

Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada
Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada
C Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada Encher a coluna com
Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M
Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl
0,05 M
coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M Abrir a válvula para
Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10
Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10

mL do tampão anterior.

Manter a sua saída fechada

Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um funil
Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um
funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente
funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente Abrir a válvula de saída da
Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão Tris constante (1,6
Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão
Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min
um caudal de tampão Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min Medir o fluxo de tampão através
Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume
Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume

eluído em 2 min.

ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna

Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura
Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura
coluna Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura Equilibrar a coluna através da

Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total

da coluna preparada

igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel, assim
Medir a altura do gel, assim como o diâmetro da mesma
Medir a altura do gel, assim como o diâmetro da mesma
igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel, assim
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Preparação da

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Preparação da Amostra

Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL
Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL
da Amostra Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL Comprimir a gaze
Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado
Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado
a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado Transferir 5 mL de filtrado
Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL
Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL
filtrado Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL Diluir com 35 mL
Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M
Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05
M (diluição 1/8)
Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluição 1/8) Passar a mistura através de
Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no
Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no

interior duma seringa de 10 mL.

O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO)

Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho
Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho
o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho  Aplicação da Amostra Calibrar

Aplicação da Amostra

Calibrar um aparelho medidor de pH
Calibrar um aparelho medidor de pH
Aplicação da Amostra Calibrar um aparelho medidor de pH Ligar a bomba peristáltica e controlar o
Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1,6 -
Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão
para 1,6 - 1,8 mL/min
o fluxo de entrada do tampão para 1,6 - 1,8 mL/min Parar a eluição da coluna
Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída
Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída
da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída Aplicar um volume de PCO
Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume
Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu
volume total
de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total Depois da amostra
Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e iniciar a
Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e
iniciar a sua eluição.

Cuidado para não secar o gel!

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Recolher fracções de

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao

volume da coluna preparada.

Controlar o fluxo!

Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo!
Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só
depois, em gelo!
cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo! Proceder à eluição da coluna com tampão de
Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M
Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio
(pH 10,5) 0,2 M
coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M Recolher fracções de 10 mL
Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH
Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu
valor de pH para 8,5
até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5 Reduzir, depois, o volume
Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL
Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL
8,5 Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL Parar a eluição da coluna
Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de
Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções
estabilizar perto de 10,5
o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10,5 Realizar as leituras de absorvências das
Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o
Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o

zero com água destilada).

Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio

Conservar as fracções bem identificadas
Conservar as fracções bem identificadas
de sódio Conservar as fracções bem identificadas Lavar a coluna com um volume de tampão de
Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2
Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio
(pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna
10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna Regenerar as
Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2)
Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução
tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e
NaN 3 0,02 % (m/v) através da coluna
M com NaCl 0,05 M e NaN 3 0,02 % (m/v) através da coluna Indicar na
Indicar na coluna qual o último tampão utilizado
Indicar na coluna qual o último tampão utilizado
M com NaCl 0,05 M e NaN 3 0,02 % (m/v) através da coluna Indicar na
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Doseamento da actividade

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Doseamento da actividade enzimática

Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1
Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos
(pH 7,0) 0,1 M
a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M Adicionar 2,9 mL de substrato
Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção
Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de
absorção
de substrato de parede celular a uma célula de absorção Adicionar 0,1 mL da fracção em
Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão, tapando o topo
Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por
inversão, tapando o topo da célula com parafilm
por inversão, tapando o topo da célula com parafilm Medir o decréscimo da absorvância a 450
Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um
Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um

minuto

SDS-PAGE

Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e
Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com
etanol e secar
de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e secar Colocar as placas de vidro
Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com
Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de
vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais
pequena
com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena Introduzir a "sandwich" na peça de
Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma
Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma
a "sandwich" na peça de suporte para a mesma Apertar os parafusos e confirmar se não
Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas
Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas
a mesma Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas Introduzir um pente na "sandwich"
Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas
Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos
entre as duas placas
até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas Marcar com uma cante um traço 1,0 cm
Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do
Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos
dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução
de gel resolvente ou de separação
do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Preparação dos

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Preparação dos géis

Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente
Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de
gel resolvente
polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente Adicionar a solução do gel resolvente à
Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de
Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio
de uma pipeta de Pasteur
"sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur Introduzir um pouco de água destilada •
Introduzir um pouco de água destilada • Evita a formação de uma superfície de polimerização
Introduzir um pouco de água destilada
• Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular, que
ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar
Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize
Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel
polimerize
de polimerização em repouso até que o gel polimerize Depois de polimerizado, inverter a caixa de
Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água
Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo
a escorrer toda a água da superfície do gel
de modo a escorrer toda a água da superfície do gel Introduzir o pente na "sandwich"
Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar
Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar
na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar
Deixar a repousar para polimerizar
Deixar a repousar para polimerizar
a não criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar a posição dos poços
Marcar a posição dos poços do pente no gel
Marcar a posição dos poços do pente no gel
polimerizar Marcar a posição dos poços do pente no gel Quando o gel de concentração polimerizar,
Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado
Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente
e com cuidado
concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poços do gel com água
Lavar os poços do gel com água destilada
Lavar os poços do gel com água destilada
concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poços do gel com água
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Montagem da

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Montagem da câmara electroforética

Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização
Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização
a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização Deitar na bancada a peça central da
Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese
Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese
na bancada a peça central da câmara de electroforese Encaixar a montagem com o gel pronto
Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara
Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da
câmara de electroforese
a ser usado na peça central da câmara de electroforese Introduzir a peça central no reservatório
Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara
Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara

de electroforese

Electroforese

Colocar a tampa da câmara electroforética
Colocar a tampa da câmara electroforética
Electroforese Colocar a tampa da câmara electroforética Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à
Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)
Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)
eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!) Colocar a voltagem nos 100 V Registar a
Colocar a voltagem nos 100 V
Colocar a voltagem nos 100 V
(atenção à polaridade!) Colocar a voltagem nos 100 V Registar a intensidade de corrente no início
Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese
Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese
intensidade de corrente no início e no fim da electroforese Deixar correr a electroforese até o
Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente
Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final
do gel resolvente (1h - 1h30)
Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Remoção do

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Remoção do gel

Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese Deitar a peça central
Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese
Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e
a peça central da câmara de electroforese na bancada e remover a peça auxiliar de montagem

remover a peça auxiliar de montagem

Remover a "sandwich"
Remover a "sandwich"
a peça auxiliar de montagem Remover a "sandwich" Puxar um dos separadores para fora, sem o
Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente
Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente
Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente Levantar o espaçador de modo a
Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se
Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se

separe do gel

Remover a placa
Remover a placa
a placa de vidro superior se separe do gel Remover a placa O gel ficará agarrado
O gel ficará agarrado a uma das placas
O gel ficará agarrado a uma das placas
gel Remover a placa O gel ficará agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos
Cortar um dos cantos do gel
Cortar um dos cantos do gel
agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos do gel Medir o comprimento do gel
Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol
Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de
bromofenol
placas Cortar um dos cantos do gel Medir o comprimento do gel e a distância migrada
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Resultados e Discussão

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Resultados e Discussão

Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280

nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. Discussão do

gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca

catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a

composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína, a carga global

destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim:

as proteínas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH é inferior

ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina catiónica.

as proteínas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH é superior

ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina aniónica.

Como a resina é de troca catiónica, ligou as proteínas que apresentavam carga

global positiva. As outras proteínas, como não se ligam à coluna foram eluídas com o

tampão.

A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina é de

troca catiónica, para que esta adira à coluna, é necessário que tenha carga global

positiva, logo, o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao

valor de pI da proteína, bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna.

Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes

proteínas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual à da coluna e

como tal não se ligam, sendo eluídas com a solução inicial. Ao aumentar o pH do

tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como

tal são também eluídas com o tampão. Desta forma, obtêm-se as diferentes proteínas

contidas na PCO variando o pH das soluções.

Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna, pode-se

aumentar a força iónica do tampão, adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de

potássio (KCl). Assim, a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o

sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 1. Valores

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Quadro 1. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.

 

Volume

       

Volume

de cada

fracção

de

eluição

total

Fracções

Absorvância a 280 nm

pH

Diluição

 

15

 

1 0,080

8,21

-

15

mL

30

 

2 0,872

8,21

1:2

 

45

 

3 0,936

8,23

1:3

20

mL

65

 

4 0,098

8,18

-

 

75

 

5 0,049

8,16

-

85

 

6 0,033

8,14

-

10

mL

95

 

7 0,032

8,15

-

105

 

8 0,044

8,17

-

 

115

 

9 0,037

8,36

-

125

 

10 0,032

8,58

-

 

130

 

11 0,031

8,63

-

135

 

12 0,040

8,65

-

140

 

13 0,032

8,67

-

145

 

14 0,042

8,69

-

150

 

15 0,041

8,69

-

5 mL

155

 

16 0,189

8,89

-

160

 

17 0,291

9,52

-

 

165

 

18 0,270

9,95

-

170

 

19 0,275

10,16

-

175

 

20 0,108

10,35

-

180

 

21 0,078

10,45

-

185

 

22 0,056

10,5

-

pH

pH Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Absorvância e valor

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Absorvância e valor de pH VS volume de eluição

1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Absorvância a
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Absorvância a 280 nm
15
30
45
65
75
85
95
105
115
125
130
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
185

Volume eluído /mL

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Absorvância180 185 Volume eluído /mL 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2

pHVolume eluído /mL 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada, sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada fracção em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 1), da fracção 1 à 4, ou seja, dos 15

aos 65 mL eluídos, é quando se observa maior absorvância; havendo um pico de

absorvância quando o volume eluído é 45 mL, ou seja, na fracção 3. Como o pH do

tampão inicial é de 8,2, todas as proteínas, à excepção da Lisozima e da Avidina, são

eluídas juntamente com o tampão, pois não se ligam à coluna por terem carga negativa

(como é visível no quadro abaixo quadro 2). Ao alterar a solução tampão de eluição

para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das proteínas e como tal

a sua ligação com a coluna. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais

altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluída com o tampão de

eluição, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga

nula.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 2. Ponto

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Quadro 2. Ponto isoeléctrico (pI) das principais proteínas presentes na clara do ovo.

Proteínas

pI

Ovalbumina

4,5

Ovotransferrina

6,05

Ovomucoide

4,1

Lisozima

10,7

Ovoinibidor

5,1

Ovomacroglobulina

4,5

Ovoglicoproteína

3,9

Avidina

10

Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções

colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida

pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Cálculo da força iónica

das soluções tampão utilizadas.

A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na

cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes:

Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4

fracções volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos I)

Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fracções)

Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado, aumentando-se o seu

pH gradualmente, a variação que se veria nas fracções seria contínua, e não descontínua

como foi o caso.

A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna

inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões.

A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em

solução. Assim, está relacionada com a concentração de electrólitos, catiões e aniões. A

forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte

expressão:

Onde

espécie.

é a concentração da espécie com carga e

é a carga da respectiva

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Força Iónica

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M

As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica  Força Iónica

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Força Iónica do Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M

As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica

Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro, o

segundo tampão causa o compactamento da coluna. As partículas de gel carregadas

negativamente, unem-se mais aos iões Na + do tampão de carbonatos de sódio por a

concentração destes catiões ser superior neste tampão, o que em conjunto com outros

iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna.

Este processo de compactação é reversível basta adicionar um tampão com menor

força iónica para que a coluna descompacte.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Cálculo da concentração

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de

Absorvância a 280 nm

Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de

coeficiente de absorção molar.

(mistura de proteínas)

(lisozima)

Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 19) utilizou-

se o segundo valor apresentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura

de proteínas (fracções 1 16 e 20 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:

Fracção 1 (mistura de proteínas)

(mistura de proteínas)

Fracção 17 (lisozima)

(lisozima)

No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma absorvância mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da diluição. Por exemplo, a fracção 2:

(mistura de proteínas)

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Como a solução

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Como a solução foi diluída com factor 2, a concentração real da fracção é:

Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.

   

Doseamento Proteico

   

Volume

       

Amostra

Volume

da

Fracção

(mL)

de

eluição

Total

(mL)

pH

Abs 280nm

Diluição

do

ensaio

[Prot] (mg/mL)

PCO

-

-

8,3

1,487

1:12

17,844

 

1 15

15

8,21

0,080

-

0,080

 

2 15

30

8,21

0,872

1:2

1,744

 

3 15

45

8,23

0,936

1:3

2,808

 

4 20

65

8,18

0,093

-

0,093

 

5 10

75

8,16

0,049

-

0,049

 

6 10

85

8,14

0,033

-

0,033

 

7 10

95

8,15

0,032

-

0,032

 

8 10

105

8,17

0,044

-

0,044

 

9 10

115

8,36

0,037

-

0,037

10 10

 

125

8,58

0,032

-

0,032

11 5

 

130

8,63

0,031

-

0,031

12 5

 

135

8,65

0,040

-

0,040

13 5

 

140

8,67

0,032

-

0,032

14 5

 

145

8,69

0,042

-

0,042

15 5

 

150

8,69

0,041

-

0,041

16 5

 

155

8,89

0,189

-

0,189

17 5

 

160

9,52

0,291

-

0,012

18 5

 

165

9,95

0,270

-

0,017

19 5

 

170

10,16

0,275

-

0,014

20 5

 

175

10,35

0,108

-

0,108

21 5

 

180

10,45

0,078

-

0,078

22 5

 

185

10,5

0,056

-

0,056

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Discussão das aproximações

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Sugestão de um

método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra.

Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na

cromatografia de troca iónica, foi medida a absorvância de cada uma delas e

seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer ( ).

O método utilizado pode induzir em erro, visto que a concentração medida não foi

apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções.

Assim, para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter

sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas, por exemplo o método

de Lowry. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o

reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas, na

presença do catalisador cobre (II). A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta

sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. No entanto, apesar do

método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas, o mesmo

possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de

interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvância do

branco, diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados.

Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do

Biureto (ver anexos II). No entanto, para além deste método ser muito menos sensível

que o método apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampão Tris-HCl, já que

este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu 2+ presente

na mistura).

Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína

para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior

actividade enzimática. Resumir os cálculos num quadro.

Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à

quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas

enzimas não são encontradas puras, não é possível quantificá-las, pelo que os resultados

são expressos em termos de unidades de actividade (UA), que são definidas

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica arbitrariamente como a

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0,001 unidades de

absorvância por minuto.

Relativamente à lisozima, a unidade enzimática é dada pela quantidade de

centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0,001

unidades por minuto.

Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que

relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). Para calcular

,

fez-se

uma

regressão

linear

das

rectas

obtidas

na

realização

dos

ensaios

enzimáticos, onde

representa o declive dessas rectas. Nesta fórmula o tempo vem

em minutos, mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos

(60 segundos), foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por

minuto. Estes valores foram também divididos por 0,001, de modo a obter-se o número

de unidades enzimáticas.

Assim, a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é:

, em que a unidade é U, sendo este U = µmol.min -1

Nos ensaios enzimáticos realizados, só a PCO e a fracção 17 foram diluídas, pois

são as que se espera registar maior actividade enzimática. Ainda assim mediu-se a

actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se

tinham a lisozima ou não. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como

modelo os seguintes cálculos:

PCO diluição 1:5

O valor de |∆Abs 450nm /∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos III, Figura III). Neste caso,

.

O número de unidades enzimáticas é: Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia

O número de unidades enzimáticas é:

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Fracção 17 diluição 3:5

O valor de |∆Abs 450nm /∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos III, Figura IX). Neste caso,

O número de unidades enzimáticas é:

.

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Fracção 2

O valor de |∆Abs 450nm /∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos III, Figura XII). Neste caso,

O número de unidades enzimáticas é:

.

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 4. Resumo

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos picos do gráfico 1.

Amostra

Diluição

[Prot]

|∆Abs 450nm /∆t|

Actividade

realizada

(mg/mL)

(UA/min)

(U/mL)

 

1:1

17,844

0,0007

420

1:2

8,922

0,0006

360

PCO

1:5

3,5688

0,0004

240

1:10

1,7844

0,0002

120

1:20

0,8922

0,0002

120

1:40

0,4461

0,0002

120

 

1:1

0,012

0,0008

480

4:5

0,0096

0,0008

480

Fracção 17

3:5

0,0072

0,0007

420

2:5

0,0048

0,0006

360

1:5

0,0024

0,0004

240

Fracção 2

1:1

1,744

 

1,8

Fracção 3

1:1

2,808

 

0,36

Fracção 8

1:1

0,044

 

48

Fracção 18

1:1

0,017

0,0002

120

Fracção 19

1:1

0,014

0,0001

60

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Actividade Enzimática em

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,4461 0,8922 1,7844 3,5688 8,922
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0,4461
0,8922
1,7844
3,5688
8,922
17,844
Actividade Enzimática (U/mL)

Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade EnzimáticaEnzimática (U/mL) Concentração de Proteína (mg/mL) Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da

Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.

Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17

600 500 400 300 200 100 0 0,0024 0,0048 0,0072 0,0096 0,012 Actividade Enzimática (U/mL)
600
500
400
300
200
100
0
0,0024
0,0048
0,0072
0,0096
0,012
Actividade Enzimática (U/mL)

Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade EnzimáticaEnzimática (U/mL) Concentração de Proteína (mg/mL) Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da

Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Determinação da actividade

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da

coluna

A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de

substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de

enzima. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por

unidade de massa de enzima usada no ensaio.

Assim, para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída, tem-se que:

, onde as unidades enzimáticas são dadas por U.mg -1 .

Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450

manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração

proteica. Desta forma, apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a

actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do

cálculo da actividade específica para uma das fracções:

Fracção 8

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 5. Resumo

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Quadro 5. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

 

Doseamento

   

Doseamento da actividade enzimática

 

Proteico

Amostra

Volume da

Fracção

(mL)

Volume de

eluição

Total

(mL)

pH

Abs 280nm

Diluição do

ensaio

[Prot]

(mg/mL)

(UA/min)

Actividade

(U/mL)

SA

(U/mg)

PCO

 

-

 

-

8,30

1,487

1:12

17,844

0,0007

420

23,54

 

1 15

   

15

 

8,21

0,080

-

0,080

     
 

2 15

   

30

 

8,21

0,872

1:2

1,744

 

1,8

1,03

 

3 15

   

45

 

8,23

0,936

1:3

2,808

 

0,36

0,13

 

4 20

   

65

 

8,18

0,093

-

0,093

     
 

5 10

   

75

 

8,16

0,049

-

0,049

     
 

6 10

   

85

 

8,14

0,033

-

0,033

     
 

7 10

   

95

 

8,15

0,032

-

0,032

     
 

8 10

   

105

 

8,17

0,044

-

0,044

 

12

272,73

 

9 10

   

115

 

8,36

0,037

-

0,037

     
 

10 10

   

125

 

8,58

0,032

-

0,032

     
 

11 5

   

130

 

8,63

0,031

-

0,031

     
 

12 5

   

135

 

8,65

0,040

-

0,040

     
 

13 5

   

140

 

8,67

0,032

-

0,032

     
 

14 5

   

145

 

8,69

0,042

-

0,042

     
 

15 5

   

150

 

8,69

0,041

-

0,041

     
 

16 5

   

155

 

8,89

0,189

-

0,189

     
 

17 5

   

160

 

9,52

0,291

-

0,012

0,0008

480

40000

 

18 5

   

165

 

9,95

0,270

-

0,017

0,0002

120

7058,82

 

19 5

   

170

 

10,16

0,275

-

0,014

0,0001

60

4285,71

 

20 5

   

175

 

10,35

0,108

-

0,108

     
 

21 5

   

180

 

10,45

0,078

-

0,078

     
 

22 5

   

185

 

10,50

0,056

-

0,056

     
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Gráfico de eluição

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Gráfico de eluição da cromatografia realizada representando a concentração de

proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. Discussão dos

resultados obtidos.

Concentração de Proteína e SA em função do volume de eluição

4,5 45000 4 40000 3,5 35000 3 30000 2,5 25000 2 20000 1,5 15000 1
4,5
45000
4
40000
3,5
35000
3
30000
2,5
25000
2
20000
1,5
15000
1
10000
0,5
5000
0
0
30
45
105
160
165
170
Concentração da Proteína (mg/mL)
Actividade Específica (SA) (U/mg)

Volume de Eluição (mL)

[Prot] (mg/mL)Actividade Específica (SA) (U/mg) Volume de Eluição (mL) SA (U/mg) Figura 4. Gráfico representativo da

SA (U/mg)(SA) (U/mg) Volume de Eluição (mL) [Prot] (mg/mL) Figura 4. Gráfico representativo da concentração de

Figura 4. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 4), a actividade específica é maior

onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração

proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105), a enzima não está

presente, ou está presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras

fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas, ou seja,

todas as que tem pI inferior a 8,2, que não é o caso do lisozima, enzima do qual se está a

calcular a actividade específica.

Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por

cromatografia de troca iónica foi eficiente, já que nas fracções em que se esperava obter

o enzima, existe actividade enzimática.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Estudo do electroforama

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Estudo do electroforama obtido e identificação das principais proteínas em cada

pista. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores.

A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese

unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE).

Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resolução

originando, portanto, uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura.

Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar, permitindo

revelar e identificar facilmente os compostos separados.

Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS, que

é um detergente), que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto, permitindo a

identificação aproximada, por comparação, do tamanho da proteína

aproximada, por comparação, do tamanho da proteína Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE. Na realização

Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.

Na realização do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O

gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel

concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem

poros mais pequenos. Desta forma, as proteínas maiores, com maior massa molecular

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica ficam retidas na

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

ficam retidas na camada superior, enquanto as proteínas de menores dimensões passam

para a camada inferior.

Em cada poço seria suposto colocar de proteína, podendo ter no máximo

da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito

baixas, o volume a colocar nos poços era muito maior que 10 logo, na

impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se .

No electroforama obtido, a ordem de colocação das amostras nos poços é a

seguinte:

1- Amostra de PCO; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

2- Amostra do pico 1 (Fracção 3); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5

minutos;

3- Amostra do pico 2 (Fracção 8); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5

minutos;

4- Amostra do pico 3 (Fracção 17); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5

minutos;

5- Amostra do lisozima; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

6- Marcador; tampão e β-mercaptoetanol;

7- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol;

8- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos:

9- Amostra de β-globulina; tampão de aplicação; aquecidos durante 5 minutos.

Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro

6), cujas massas moleculares são conhecidas, é possível verificar se a fracção que se

suspeita ter lisozima está pura.

Quadro 6. Proteínas que constituem o marcador.

Proteína

M r (KDa)

Rf

Erro

Fosforilase b

94

0,36

0,32-0,40

BSA

67

0,44

0,39-0,47

Ovalbumina

43

0,52

0,46-0,56

Anidrase carbonica

30

0,65

0,58-0,70

Inibidor de tripsina

20

0,75

0,66-0,80

α-lactalbumina

14,4

0,84

0,75-0,91

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Sabendo que a

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14,3 KDa, é de esperar que as

amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparação

com o marcador, a massa molecular é 14,4 KDa. Assim, é possível concluir que as

amostras colocadas no poço 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima.

Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o

efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura

conjugados (8) na β-globulina. A β-globulina é construída por 2 subunidades, quando

fica sujeita à acção de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se,

mostrando no electroforama três bandas distintas. Uma banda para a proteína não

desnaturada, e duas para cada uma das subunidades.

No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7), é possível

observar várias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o β-

mercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se

separarem uma da outra, ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde

94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poço 8, a proteína também desnaturou dando

origem a 4 bandas distintas, ou seja, fracções com tamanhos variáveis. No caso em que

se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se

aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos

bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o

descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a proteína

não desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a

subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do

electroforama).

Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo

Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as

fracções com maior actividade específica, pois é nestas fracções que se encontra a maior

parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fracções seleccionadas foram

a 17, 18 e 19, já que apresentam actividade específica 40 000, 7058,82 e 4285,71,

respectivamente.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Para exemplificar o

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Para exemplificar o cálculo do rendimento e da purificação do enzima,

procedeu-se a este cálculo para a fracção 17, sendo o cálculo para as outras fracções e

para a PCO semelhante.

Fracção 17

Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as

fracções.

Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma

das massas totais de enzima purificado.

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 7. Resumo

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Quadro 7. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica.

Passo de

Purificação

Volume Total

(mL)

[Prot]

(mg/mL)

Massa

Proteica total

(mg)

Actividade

(U/mL)

Actividade

Total (U)

 

SA (U/mg)

Rendimento

(%)

Purificação

(x)

PCO

7* 1

17,844

124,91

420

2

940

23,54

   
   

5

17 0,012

 

0,06

 

480

2

400

40 000

Fracções

 

5

18 0,017

 

0,085

120

 

600

7

058,8

112,2

2002,7

 

5

19 0,014

 

0,07

 

60

 

300

4

285,7

 

Total

15

0,014* 2

0,215

660

3

300

47 142,86* 3

* 1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL. * 2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção.

* 3

Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a

purificação dão valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realização deste

trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como

tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o

valor de absorvância registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentração e

consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho, deveria ser

maior que aquele que obtemos do outro grupo.

Conclusão Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Conclusão

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Globalmente, este

principais:

trabalho

laboratorial

foi

constituído

por quatro etapas

Cromatografia de troca iónica;

Doseamento da concentração de proteína;

Doseamento da actividade enzimática;

Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da

amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes soluções constituídas por

diferentes conjuntos de proteínas. Após a sua análise, ao serem medidas as absorvâncias

das fracções, foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima)

na sua constituição. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar

diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do

lisozima.

Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção, às quais se

adicionou substrato de parede celular de células de M. luteus, foi possível medir o

decréscimo da absorvência a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a

actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Calculou-se

também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da

amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância.

Por fim, pela realização da electroforese unidimensional em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes

em cada poço, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos

três picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir

que, de facto, o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição, enquanto que

os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da

constituição da clara de ovo. Este método permitiu, assim, concluir que foi possível

purificar o lisozima, tal como se esperava.

Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de

purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica obtidos para estes

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos,

uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da

PCO de outro grupo, não correspondendo à realidade daquilo que foi observado.

Em suma, apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau

de pureza do lisozima obtido, foi possível verificar qualitativamente a sua presença e

observar a sua actividade catalítica. Desta forma, pode fazer-se um balanço positivo

relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do

lisozima da clara do ovo.

Bibliografia Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Bibliografia

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica

Boyer, RF (1993) Modern Experimental Biochemistry, 2ª ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City.

Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison Wesley Longman: New York.

Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp. 199-206.

Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental Methods, 3rd. ed., W.H. Freeman: New York, pp. 95-104.

Wilson, K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (Wilson, K e Walker, J, eds.) 4ª ed., Cambridge University Press, Cambridge.