Reaco em Cadeia do Polimerase - PCR

Salvado, Alexandra (40267); Lamy, Ana (40279); Sousa, Andreia (40261); Paiva, Telmo (40243) Licenciatura em Bioqumica Bioqumica Experimental II, Turma n 2, Grupo n 1, DQB/FCUL

Objectivos
Teve-se como objectivo extrair o DNA total (genmico e mitocondrial) a partir de carne de vaca. Pretendeu-se tambm amplificar e analisar fragmentos de DNA a partir de duas amostras desconhecidas (A e B) de DNA genmico ou mitocondrial, usando como tcnica experimental a reaco em cadeia do polimerase (PCR) e procedeu-se identificao da composio das duas amostras.

Resumo
Extraiu-se e purificou-se o DNA total (genmico e mitocondrial) de uma amostra de carne de vaca atravs de centrifugaes sucessivas e precipitaes diferenciais. O DNA extrado foi, posteriormente, analisado espectrofotometricamente, de modo a quantific-lo e determinar o seu grau de pureza. Atravs da tcnica de PCR, amplificaram-se as amostras de DNA extrado da carne de vaca e uma outra amostra de DNA extrado de batata, recorrendo ao Taq DNA polimerase, aos primers especficos (de vaca e de batata) desoxirribonucletidos trifosfatos (dNTPs). Para anlise dos resultados experimentais procedeu-se a uma electroforese em gel de agarose, na qual se analisaram, com os diferentes primers, as amostras desconhecidas (A e B), com o marcador de massa molecular e respectivos controlos positivo e negativo. Concluiu-se que a amostra A correspondia ao DNA extrado de batata e a amostra B ao DNA extrado da carne de vaca. Os resultados experimentais relativos ao tamanho dos fragmentos e distncia de migrao corresponderam aos resultados esperados. e aos

1. Apresentao e Discusso de Resultados

1.1. Determinao in silico o tamanhos dos fragmentos esperados aps amplificao com os primers fornecidos

De forma a identificar qual das amostras pertencia ao DNA extrado de batata e qual pertencia ao DNA extrado de vaca, determinaram-se os tamanhos dos fragmentos esperados aps amplificao com os primers especficos de carne de vaca e de batata. Deste modo, comparou-se a sequncia dos primers com a sequncia do gene que se pretendia hidrolisar. Recorrendo-se ferramenta Primer-Blast do NCBI, introduziu-se a sequncia do gene de batata (DQ185064) e a sequncia do gene de vaca (V00654), as respectivas espcies, Solanum tuberosum e Bos taurus, respectivamente e os respectivos primers. Obteve-se que o fragmento do gene de batata amplificado iniciava-se com o nucletido da posio 420 at ao nucletido da posio 785, tendo uma sequncia com 366 nucletidos. O fragmento do gene de vaca amplificado iniciava-se no nucletido da posio 14210 at ao nucletido da posio 15960, tendo uma sequncia com 1751 nucletidos Anexo A. Como os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao logaritmo de base 10 das suas massas moleculares, migra mais o fragmento com menor nmero de nucletidos. Assim, esperava-se que a amostra com DNA extrado de batata migrasse mais em relao amostra com DNA extrado de vaca.

1.2.

Quantificao e determinao do grau de pureza do DNA extrado

Aps a extraco do DNA realizaram-se medies espectrofotomtricas, de modo a determinar a concentrao de cidos nucleicos em soluo, quadro 1.2.1.
Quadro 1.2.1. Resultados da extraco de DNA

Grupos 1 2 3 4

Abs260 nm 0,070 0,117 0,420 0,082

Abs280 nm 0,042 0,074 0,447 0,054

Abs325 nm 0,000 0,000 0,000 0,000

Grau de pureza 1,69 1,58 0,94 1,53

[DNA]extrado/ ng L-1 3,50 5,80 21,00 4,10

mDNA extrado/ ng 1750 2900 10500 2050

Sabendo que 1 OD corresponde a, aproximadamente, 50 g/mL de DNA de cadeia dupla, utilizou-se a concentrao de DNA extrado, indicada directamente pelo espectrofotmetro, para calcular a massa de DNA extrado. Considerou-se o volume de soluo 500 L, dado que no final do processo de extraco se dissolveu o DNA neste volume de tampo TE. Exemplifica-se para o grupo 1, tendo-se procedido de modo semelhante para os restantes:

Relativamente determinao do grau de pureza das amostras de DNA extrado, este calculado atravs da razo pura apresenta um grau de pureza entre 1,8 e 2,0. Como o DNA extrado pelos grupos apresentava um grau de pureza inferior a 1,8, pode considerar-se que as amostras se encontravam contaminadas com protenas e fenol. Os valores de absorvncia a 325 nm foram, aproximadamente, zero, podendose concluir que no existiam partculas em suspenso na cuvette e que esta no apresentava sujidade. . Considera-se que uma amostra

1.3.

Clculo do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente (in vitro) por PCR para cada reaco com diferentes pares de primers, usando o marcador de massa molecular

Grupo 1

Grupo 2

Legenda: VA primers de vaca; amostra A VB primers de vaca; amostra B VC primers de vaca (controlo negativo) BA primers de batata; amostra A BB primers de batata; amostra B BC primers de batata (controlo negativo) CV controlo positivo (DNA da vaca) CB controlo positivo (DNA da batata) M marcador de massa molecular

VA

VB VC BA BB BC
VB VB VB VB

M
VB

VA

VB VC BA BB BC CV CB
VB VB VB VB

Grupo 3

Grupo 4

VA

VB VC BA BB BC
VB VB
VB VB

M
VB

VA

VB VA BA BB BC CV CB
VB VB

VB

~
Figura 1.3.1. Electroforama obtido

Pela figura 1.3.1, na qual se observa apenas as bandas correspondentes aos fragmentos de DNA extrado de carne de vaca e de batata amplificados pela tcnica de PCR, verifica-se que no se formaram produtos inespecficos. As bandas que migraram mais correspondem aos fragmentos que surgiram da dimerizao dos primers. Esperava-se que no controlo negativo no fosse visvel qualquer banda, pois estes tubos continham os mesmos componentes que os restantes, excepto as amostras A e B de DNA, que foram substitudas por gua. Desta forma, como no continham as cadeias molde de DNA, no se esperava que ocorresse amplificao atravs de PCR. As bandas que se observam nos poos em que ambos os controlos negativos foram colocados (VC e BC) correspondem dimerizao dos primers, com excepo do grupo 1. Para este grupo, no poo correspondente ao controlo negativo contendo os primers de batata (BC) observa-se uma banda mais intensa do que para os restantes grupos e com menor massa. Se este resultado correspondesse ao controlo negativo, deveria verificar-se a presena desta banda em todos os poos. Por outro lado, no se esperava o aparecimento de alguma banda neste poo. Desta forma, pode-se inferir que poder ter ocorrido uma troca de tubos e o contudo do tubo contendo os primers de batata e a amostra B foram colocados neste poo. Aps a revelao do electroforama verificou-se que o marcador no formou bandas caractersticas, no podendo ser utilizado para calcular o comprimento dos fragmentos amplificados figura 1.3.2.

Figura 1.3.2. A figura da esquerda corresponde ao poo do marcador (poo 6) na parte superior do gel de electroforese. A figura do meio corresponde ao poo do marcador (poo 6) na parte inferior do gel de electroforese. Marcador NZY DNA Ladder IV, com as respectivas bandas de referncia (lado direito, no est escala das figuras experimentais).

Deste modo, os docentes forneceram um marcador e um controlo positivo com produto especfico de vaca e de batata, figura 1.3.3.

Figura 1.3.3. A figura da esquerda corresponde ao gel fornecido pelos docentes. Legenda: M marcador [1] de DNA Generuler 1 kb . 1. Produto especfico de vaca. 2. Produto especfico de batata. A figura da direita corresponde ao marcador com as respectivas bandas de referncias.

Para se poder fazer comparaes, sobreps-se no electroforama o marcador e os controlos positivos, figura 1.3.4.

Figura 1.3.4. Electroforama com o marcador e controlos positivos (CV 1 e CB 2) fornecido pelos docentes.

Para o clculo do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente (in vitro) por PCR, procedeu-se inicialmente medio da distncia, em mm, desde o bordo frontal do poo a cada uma das bandas constituintes do marcador, Anexo B. Registaram-se esses valores no quadro 1.3.2.

Quadro 1.3.2. Distncias de migrao das bandas do marcador

SM/ bp 10000(1) 8000(1) 6000(1) 5000(1) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250

log10 SM/ bp 4,0000(1) 3,9031(1) 3,7782(1) 3,6990(1) 3,6021 3,5441 3,4771 3,3979 3,3010 3,1761 3,0000 2,8751 2,6990 2,3979

G1 7(1) 8(1) 9(1) 10(1) 11 12 14 15 17 20 25 28 31 36

dmigrao/ mm G2 G3 (1) 7 7(1) (1) 8 8(1) 9(1) 9(1) (1) 10 10(1) 11 11 12 12 14 14 15 15 17 17 20 20 25 25 28 28 31 31 36 36

G4 8(1) 9(1) 10(1) 11(1) 12 13 15 16 19 22 27 31 35 40

Observao: SM - tamanho das bandas do marcador. (1) Valores desprezados para a construo das curvas de calibrao.

Com os valores do logaritmo de base 10 do tamanho das bandas do marcador e com as distncias de migrao, em mm, para cada ensaio, um por cada grupo, construram-se duas curvas de calibrao, figura 1.3.5, pois os valores das distncias dos grupos 1, 2 e 3 foram iguais. Desprezaram-se alguns dos valores na construo das curvas de calibrao para se obterem rectas de calibrao melhor ajustadas.

Figura 1.3.5. 1 - Curva de calibrao para os ensaios dos grupos 1, 2 e 3 ( esquerda). 2 Curva de calibrao para o ensaio do grupo 4 ( direita).

As curvas de calibrao so do tipo

, onde

, corresponde ao , ao declive,

logaritmo decimal do tamanho das bandas do marcador (bp), distncia de migrao (mm) e corresponde ordenada na origem.

Para a medio das distncias de migrao utilizou-se o electroforama fornecido pelos docentes para medir as distncias do marcador e dos controlos positivos de vaca e de batata, quadro 1.3.3. Experimentalmente, o controlo positivo de vaca migrou como esperado. No entanto, optou-se por medir pelo electroforama fornecido para se diminuir os erros associados sobreposio dos electroforamas diferentes.
Quadro 1.3.3. Distncia de migrao dos fragmentos amplificados em cada poo

dmigrao/ mm Poos VA VB VC BA BB BC CV CB
Observao:

G1 19 (3) 34 19 34
(2)

G2 34 18 34

G3 36 19 36

G4 23 (2) 22 38

Neste grupo corresponde a VA.

Com estes resultados, pode-se concluir que a amostra B corresponde ao DNA extrado da carne de vaca. Pelo quadro 1.3.3, verifica-se que as distncias de migrao da banda dos poos VB, que continham primers de vaca e a amostra B, para os grupos 1 e 4, foram, aproximadamente, iguais s distncias de migrao das bandas dos controlos positivos CV, que continham DNA extrado da carne de vaca. Este resultado permite afirmar que nos tubos correspondentes a estes poos, o Taq polimerase amplificou os fragmentos de DNA extrado de carne de vaca utilizando os primers de vaca. A amostra A corresponde ao DNA extrado de batata. Pelo quadro 3, verifica-se que as distncias de migrao da banda dos poos VA, que continham primers de batata e a amostra A, para os grupos 1, 2 e 3, foram, aproximadamente, iguais s distncias de migrao das bandas dos controlos positivos CB, que continham DNA extrado de batata. Por este resultado pode-se concluir que os tubos que continham o contedo dos poos BC e BA foram trocados, como sugerido. Neste caso, o Taq polimerase amplificou os fragmentos de DNA extrado de batata utilizando os primers especficos. A partir destes valores e das curvas de calibrao respectivas, calcularam-se os tamanhos dos fragmentos amplificados (SF). Exemplificam-se os clculos para o

ensaio do grupo 1. A equao da recta de calibrao 1.3.1), onde e .

(Eq.

(Eq. 1.3.2)

Exemplifica-se para o poo 2 do ensaio do grupo 1, dmigrao = 19 mm

Para os restantes ensaios procedeu-se de forma semelhante obtendo-se os resultados do quadro 1.4.1.

1.4.

Verificao se os tamanhos dos fragmentos obtidos esto de acordo com o esperado pela anlise in silico realizada anteriormente

Quadro 1.4.1. Tamanho dos fragmentos amplificados das amostras por PCR

Grupos 1 2 3 4

Poos VB BC BA BB VB

dmigrao/ mm 19 34 34 36 23

SF/ bp 1711 352 352 285 1402

Comparando-se os resultados do quadro 1.4.1 e com a anlise in silico realizada anteriormente, aos pode-se concluir esperados. que os resultados que experimentais os fragmentos

corresponderam

resultados

Verifica-se

amplificados das amostras de DNA extrado da carne de vaca migraram menos que os de batata. Verificou-se que os fragmentos do poo BB (grupo 3) migraram mais, em relao aos fragmentos dos poos BC e BA (grupos 1 e 2, respectivamente). Os fragmentos dos poos BC e BA tiveram a mesma distncia de migrao, obtendo-se o mesmo valor de tamanho dos fragmentos. Podem ter ocorrido erros associados medio e por se ter sobreposto a imagem do electroforama com o marcador e com a dos marcadores positivos do gel fornecido pelos docentes no electroforama experimental.

2. Concluso
Pelos resultados experimentais, pode-se concluir que a amostra B continha a sequncia amplificada do gene da vaca e a amostra A continha a sequncia amplificada do gene da batata. Verificou-se que a distncia de migrao das amostras era inversamente proporcional ao tamanho dos fragmentos, como esperado. Apesar dos erros experimentais, estes resultados esto em concordncia com os resultados esperados. Para se diminurem os erros associados a este trabalho, poderia ter-se realizado outra electroforese com as mesmas amostras e outro marcador.

3. Referncias
[1] www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis/generuler-dnaladders/sm0313-generuler-1kb, consultado a 15 de Maio de 2012; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and StruhlK. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.,Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore, pp 2.5.1-2.5.9; Nelson, D., Cox, M. (2008), Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition, W. H. Freeman and Company, New York; Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, pp 6.3-6.20; Protocolo fornecido pelos docentes 2011/2012.