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Papel chave para Scavenger Receptor BI na Fisiologia Integrativa de

Defesa do hospedeiro durante a pneumonia bacteriana

Kymberly M. Gowdy, Jennifer H. Madenspacher, Kathleen M. Azzam, Kristin A.

Gabor, Kyathanahalli S. Janardhan, Jim J. Aloor, Michael B. Fessler

Materiais Suplementares
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Métodos Suplementares

Análise de citocinas

TNFÿ ELISA foi da Ebioscience (San Diego, CA). O CXCL5 ELISA era da R&D Systems

(Mineápolis, MN). Os ensaios Bioplex para CXCL1, CXCL2, MCP-1, IL-17, TNFÿ e IL-6 foram

da Bio-Rad (Hercules, CA).

Isolamento de RNA e qPCR

O RNA foi isolado pelo kit RNEasy (Qiagen). DNAs complementares (cDNA) foram gerados

de 1,0 µg de RNA purificado usando reagentes de transcrição reversa TaqMan da Applied

Biossistemas (Foster City, CA). A PCR em tempo real foi realizada em triplicata com Taqman PCR

Mix (Applied Biosystems) no Sistema de Detecção de Sequência ABI HT7900 (Applied

Biossistemas). Os primers pré-desenhados foram adquiridos da Applied Biosystems. Expressão genetica

foi normalizado para GAPDH e os níveis de expressão em amostras de controle não tratadas foram definidos como um

valor de 1,0.

Análise por citometria de fluxo de células BAL, peritoneais e sanguíneas

Células de LBA, peritônio e sangue foram processadas para citometria de fluxo. Anti-Ly6G (APC,

clone #1A8), -CD11c (PerCP-Cy5.5, clone#N418), -CD11b (Pacific Blue, clone#M1/70), -

CD62L(PE, clone#MEL-14), -TLR4 (PE, clone #UT41)- e anticorpos de controle de isotipo foram

da eBiosciences (San Diego, CA). Espécies reativas intracelulares de oxigênio foram quantificadas por

Fluorescência CM-H2DCFDA (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Fluxo

a citometria foi realizada usando um LSR II (BD Biosciences) e analisada usando FlowJo

software (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

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Ensaio de fagocitose

Os neutrófilos peritoneais foram coletados por lavagem peritoneal após a injeção de tioglicolato como

descrito acima. A fagocitose de partículas de E. coli marcadas com PE foi medida usando o pHrhodo

kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. PE positivo

os neutrófilos foram quantificados por citometria de fluxo, primeiro gating em células Gr1+ (APC) e depois

partículas rhodo (PE)-positivas.

Ligação e captação de LPS

Macrófagos peritoneais foram coletados por lavagem peritoneal após injeção de tioglicolato como

descrito acima. A captação de LPS foi medida pela incubação de macrófagos peritoneais (1x106 ) com

5ÿg/ml de LPS marcado com biotina (Invivogen, San Diego, CA) a 37°C por 15 min. Encadernação de superfície

foi avaliado com anticorpo secundário marcado com APC (BD Biosciences) e captação total

(absorção intracelular mais ligação de superfície) foi determinada pela fixação e permeabilização de células

com um kit fix/perm (BD biosciences) antes do secundário marcado com APC. O sinal LPS foi quantificado

por citometria de fluxo usando um LSR II (BD Biosciences) e analisados usando o software FlowJo (Tree

Star, Inc., Ashland, OR).

Análise de soro e plasma

O sangue foi coletado do ventrículo direito e o plasma utilizado para quantificação do colesterol total

e LDH (ambos Beckman Coulter Inc., Irving TX), e a análise foi feita usando o Olympus

Analisador clínico AU400e (Beckman Coulter Inc.). Soro foi usado para corticosterona

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medição por radioimunoensaio (MP Biomedicals, LLC, Orangeburg, NJ) em um APEX

Contador gama automático (ICN Systems Inc., Huntsville, AL).

Geração de quimeras de medula óssea

Para transplante de medula óssea, camundongos SR-BI+/+ congênicos CD45.1 (Estoque #002014, Jackson

Laboratory, Bar Harbor, ME). Os receptores foram irradiados letalmente (900 rad) por um JL

Radiador Shepherd & Associates Modelo 431 usando uma fonte de 137Cs . Dentro de 24h pós-irradiação,

medula óssea derivada de doadores de fêmures e tíbias (1x107 células) foi injetada iv em receptores.

A eficiência do enxerto de células-tronco doadoras foi determinada por citometria de fluxo para CD45.1

expressão 10 semanas após a transferência em PMNs circulantes (Gr-1+ ), células T (CD3+ ), monócitos

(CD11b+ ) e linfócitos B (CD19+ ), e em 12 semanas (sacrifício) em macrófagos alveolares

(CD11c+ , autofluorescente+ ) e células dendríticas (CD11c+ , autofluorescente- ). enxerto

a eficiência em todos os animais experimentais foi >94%.

Pontuação histopatológica do pulmão

Os pulmões foram fixados (formalina tamponada a 10% x 24h) 24h após a infecção. Os tecidos foram

depois processadas, embebidas em parafina, seccionadas (5 ÿm) e coradas com hematoxilina e eosina.

A inflamação foi pontuada semiquantitativamente em uma escala de 0-3 (mostrada abaixo) por um patologista

cego para o genótipo.

Critérios de Pontuação

0 Sem inflamação

1 Nenhuma área focalmente extensa de inflamação; ÿ8 focos de inflamação

2 1 áreas focalmente extensas de inflamação + ÿ8 focos de inflamação OU

Nenhuma área focalmente extensa de inflamação + >8 a ÿ15 focos de inflamação 2
3 áreas focalmente extensas de inflamação + ÿ8 focos de inflamação OU 1 área
focalmente extensa de inflamação + >8 a ÿ15 focos de inflamação OU

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Nenhuma área focalmente extensa de inflamação + >15 focos de inflamação

Após a classificação, as lâminas foram digitalizadas usando um scanner de slides Aperio (Leica Biosystems, IL) e

as imagens foram capturadas usando o ImageScope da Aperio. Imagens representativas da histologia pulmonar 24h

pós K. pneumoniae (2.000 CFUs) são mostrados na Figura 1 complementar.

Figura complementar 1. Histopatologia pulmonar após infecção intratraqueal. SR-BI+/+ e

Camundongos SR-BI-/- receberam 2.000 UFCs de K. pneumoniae e foram sacrificados 24h depois. o

os pulmões foram fixados, seccionados, corados com hematoxilina e eosina e fotografados usando um

Scanner de slides Aperio e ImageScope. O painel a é uma visualização representativa de baixa potência (8X),

mostrando mais focos de inflamação nos pulmões de camundongos SR-BI-/- (setas) do que o tipo selvagem

homólogos. O painel b (objetiva de 400X) mostra um dos focos de inflamação de ambos

genótipos, que contém neutrófilos infiltrados nos espaços alveolares.

Figura complementar 2. A resposta pulmonar ao LPS inalado é aumentada em SR-BI-/-

camundongos em comparação com irmãos de ninhada WT e camundongos C57Bl/6J. Camundongos C57Bl/6J foram expostos a

LPS em aerossol junto com camundongos SR-BI-/- e seus irmãos de ninhada SR-BI+/+ (WT). BAL total

leucócitos (WBCs) foram contados 24h após a exposição. Os dados mostrados são representativos de um

experimento envolvendo N=5-8/grupo **, p<0,01.

Figura suplementar 3. Camundongos quiméricos SR-BI+/+, reconstituídos com SR-BI+/+ ou

Medula óssea SR-BI-/- , exibe colesterol sérico e função adrenal equivalentes. SR-BI

camundongos quiméricos de medula óssea foram gerados pela reconstituição da medula óssea de

Camundongos receptores SR-BI+/+ (WT) com medula óssea SR-BI+/+ ou SR-BI-/- (mostrado como Doador ÿ

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Destinatário). a) O colesterol total plasmático foi medido na linha de base em SR-BI+/+, SR-BI-/- e osso

camundongos quiméricos de medula, conforme indicado (N=5-8/grupo). b) A corticosterona sérica foi medida em

Camundongos quiméricos de medula óssea SR-BI após desafio de estresse com tioglicolato ip (4h) seguido de

ip K. pneumoniae (1x108 CFUs, 30 min). Os dados mostrados são representativos de um experimento

envolvendo N=7/grupo. *, p<0,05.

Figura suplementar 4. Infecção pulmonar por K. pneumoniae em deficientes de HDL

Camundongos ApoA-I-/- . a) Camundongos ApoA-I+/+ e ApoA-I-/- (N=10/genótipo) foram inoculados com K.

pneumoniae (600 CFUs), e a sobrevida foi monitorada. b) Camundongos ApoA-I+/+ e ApoA-I-/- foram

inoculou-o com K. pneumoniae (2.000 UFCs) e contou os neutrófilos BALF (PMNs) 24h

pós-inoculação. c) UFC bacterianas em homogenatos esplênicos foram quantificadas 24h após o K.

pneumoniae em camundongos SR-BI+/+ e SR-BI-/- . Os dados mostrados são representativos de um experimento

envolvendo N=5-8/grupo. *, p<0,05.