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Jornal da Sociedade Americana de Químicos Cervejeiros

A Ciência da Cerveja

ISSN: (Imprimir) (Online) Página inicial da revista: https://www.tandfonline.com/loi/ujbc20

Impressão digital de cepas de Saccharomyces cerevisiae

Usando sequenciamento de próxima geração de PCR
Amplicons gerados a partir de elementos Delta

Matthew T. Cottrell

Para citar este artigo: Matthew T. Cottrell (2023) Fingerprinting Saccharomyces cerevisiae Strains Using
Next Generation Sequencing of PCR Amplicons Generated from Delta Elements, Journal of the American
Society of Brewing Chemists, 81:3, 374-382, DOI: 10.1080/03610470.2022 .2110645

Para vincular a este artigo: https://doi.org/10.1080/03610470.2022.2110645

© 2022 O(s) Autor(es). Publicado com licença

pela Taylor & Francis Group, LLC.

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Publicado on-line: 22 de agosto de 2022.

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eletroforese em gel de agarose.[15] Tristezza et al.[16] apresentaram um
método usando eletroforese capilar fluorescente para gerar a impressão
digital. Os amplicons produzidos utilizando um iniciador de PCR marcado
com fluorescência foram detectados e dimensionados utilizando a
automação do Analisador Genético ABI Prism 3130.
Da mesma forma, Franco-Duarte et al.[17] usaram eletroforese
microfluídica com um sistema de eletroforese Caliper LabChip 90
empregando detecção e dimensionamento automatizado de fragmentos
para gerar uma impressão digital a partir dos amplicons gerados com um
primer de PCR marcado com fluorescência. Os métodos que utilizam
eletroforese automatizada de amplicons de PCR interdelta para gerar
impressões digitais de levedura cervejeira ainda não foram amplamente
adotados pela indústria cervejeira.
Neste estudo, foi desenvolvido um método que gera uma impressão
digital baseada em sequência de DNA a partir de ícones de amplificação
de PCR interdelta. O método baseia-se nos Métodos de Análise de
Levedura-13 da ASBC “Diferenciação de Cepas de Levedura de Cerveja
por Impressão Digital de PCR”[15] incorporando uma etapa de
Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). A análise dos dados NGS
utilizou software de código aberto[18] e um script de coordenação
adaptando a análise para gerar impressões digitais de cepas de levedura
cervejeira. Critérios quantitativos foram aplicados para controle de
qualidade dos dados da sequência NGS para gerar impressões digitais
interdelta NGS com a precisão necessária para distinguir entre cepas de
levedura cervejeira e levedura selvagem.
Experimental
As cepas de levedura OYL-004, WY-1056, IY-A07, BRY-97 e US-05 foram
obtidas da Northern Brewer, LLC (www.
northbrewer. com). As cepas WLP001 e S288C foram obtidas da White
Labs (www.whitelabs.com) e a American Type Culture Collection
(www.atcc.org), respectivamente. A cepa LC1 foi isolada de uma pasta
de levedura lager usando uma placa contendo meio Fast Orange Wild
Yeast (FOWY) (PIKA Weihenstephan, Pfaffenhofen, Alemanha) como
parte deste estudo. As leveduras foram cultivadas durante a noite em
caldo YPD, Sigma-Aldrich (www.sigma-aldrich.com) a 30 °C. A biomassa
de levedura foi coletada de 100 µL de cultura por centrifugação a 10.000
g por 3 min. O meio foi removido e o pellet de levedura foi ressuspenso
em 200 µL de resina Chelex 100 a 5% p/p, Bio-Rad (biorad.com) em água
destilada. As células foram então lisadas incubando a mistura a 80 °C
durante 10 min. Os detritos celulares foram sedimentados a partir do
lisado por centrifugação a 10.000 g por 3 min.[19]
As reações de PCR continham 0,5 µM de cada primer de PCR, 2,5 µL
de PrimeTime qPCR Master Mix, Integrated DNA Technologies
(idtdna.com), 5 µL de lisado preparado com o tratamento Chelex e água
destilada até um volume final de 25 µL. Iniciadores de PCR delta12 (5ÿ-
TCAACAATGGAAT
CCCAAC-3 ÿ) e delta21 (5ÿ-CATTTAACACCGTATATGA- 3 ÿ) [12] foram
sintetizados pela GeneLink (www.genelink.com).
A ciclagem térmica foi realizada usando um instrumento qPCR Chai Open
(chaibio.com) seguindo um programa que incluía uma etapa inicial a 95°C
por 2 min., seguida por 35 ciclos de 95°C por 15 segundos, 46°C por 30
segundos. e 72°C por 1 min. O ciclo final foi seguido por uma etapa a
72°C por 10 min. Os amplicons de PCR foram submetidos a eletroforese
usando um sistema de eletroforese E1201-GT, Accuris Instruments
(accuris-usa.com)
Jornal da Sociedade Americana de Químicos Cervejeiros 375
em agarose a 1,5% em tampão TBE 1X. Os géis foram corados com
coloração 1X SYBR Green I, Sigma-Aldrich (sigma-aldrich.com) e
visualizados usando transiluminação de luz azul para documentação de
imagem digital.
Os produtos de PCR foram preparados para sequenciamento NGS
usando purificação baseada em esferas magnéticas e quantificação
fluorométrica de DNA. Quatro reações de PCR foram reunidas e
purificadas usando o reagente MagJET NGS Cleanup, Thermo Fisher
Scientific (www.thermofisher.com). Os produtos de PCR purificados
foram quantificados usando um fluorômetro Qubit 2.0 (www.
thermofisher.com) com coloração SYBR Green I. O sequenciamento NGS
foi realizado utilizando o Illumina NovaSeq 6000 (www.
illumina.com) com base no serviço Amplicon-EZ de 2 × 250 pb fornecido
pela Azenta Life Sciences (genewiz.com).
Os dados NGS no formato fastq do Read 1 foram usados para produzir
impressões digitais de tags de sequência. A análise das leituras foi
realizada utilizando o pacote VSEARCH de código aberto[18] com
diferentes etapas coordenadas por um script customizado (Supplementary
File 1). Antes de qualquer processamento ser realizado, estatísticas de
qualidade, incluindo o comprimento médio de leitura, foram extraídas. Em
seguida, as leituras foram filtradas usando um limite de comprimento de
200 pb e apenas aquelas com uma taxa de erro máxima esperada (E)
<0,5 foram retidas.[20] Leituras menores que 200 pb foram descartadas e
as leituras restantes foram truncadas para um comprimento de 200 pb.
As leituras únicas foram então contadas e aquelas que ocorreram menos
de 10 vezes foram descartadas. Em seguida, as leituras sem uma
sequência completa de iniciadores de PCR foram descartadas. Finalmente,
o número de ocorrências de cada leitura única foi determinado e as 15
leituras mais abundantes foram escolhidas como tags de sequência que
definem a impressão digital interdelta NGS.
As marcas de sequência que compõem a impressão digital interdelta
da cepa S228C foram combinadas com a sequência do genoma de
S228C usando BLASTN.[21] Parâmetros padrão foram usados para
consultar o conjunto RefSeq de S. cerevisiae R64 GCF_000146045.2
com cada uma das 15 tags de sequência. Da mesma forma, as tags de
sequência que compõem a impressão digital WLP001 foram combinadas
com o conjunto de dados WGS WLP001 usando Magic-BLAST [22] com
parâmetros padrão e software samtools V1.10 [ 23] . A sequência do
genoma WLP001 foi representada pela biblioteca Sequence Read Archive
SRX8613118 executada SRR12086827 DK01. A cobertura de sequência
em regiões do genoma WLP001 combinadas por tags de sequência foi
determinada usando o software samtools V1.10.
Duas amostras de levedura contaminadas experimentalmente foram
preparadas misturando a cepa de levedura de cerveja WLP001 com a
cepa de levedura selvagem LC1 e misturando WLP001 com a cepa Belle
Saison. As misturas continham 1x106 células WLP001/mL e 10 cfu/mL
da cepa LC1 ou Belle Saison. As misturas foram plaqueadas em meio
FOWY usando o método pour plate. Um mL de cada mistura de levedura
foi combinado com 5 mL de caldo FOWY e 5mL de ágar fundido a 2%
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em água deionizada a 50 ° C e vertido em
uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. O ágar foi deixado solidificar
e as culturas foram então incubadas durante uma semana a 30°C.
Resultados
A amplificação por PCR com primers delta12 e delta 21 foi bem-sucedida
com todas as cepas de levedura examinadas, incluindo seis leveduras
cervejeiras, uma levedura selvagem e uma levedura de laboratório. Agarose
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376 MT COTTRELL
Figura 1. Gel de agarose corado com SYBR Green I de amplicons produzidos com
os iniciadores de PCR delta12 e delta21 com várias cepas de levedura cervejeira. M1,
marcador Lambda DNA/EcoRI + HindIII (Thermo Fisher Scientific) M2, marcador de
peso molecular 100 pb (Carolina Biological Supply Co.). WLP001, OYL-004, WY-1056
e IY-A07 são cepas de levedura Chico. BRY-97 e US-05 são cepas de levedura do
tipo Chico.
LC1 é uma levedura selvagem contaminante identificada em uma levedura lager.
a eletroforese em gel revelou aproximadamente sete bandas proeminentes
variando em tamanho de ~ 200 pb a ~ 1.500 pb para cada cepa de levedura
(Figura 1). Os amplicons incluíam duas a seis bandas menores que eram
tipicamente >1.500 pb. Os padrões de amplicons separados por eletroforese em
gel foram amplamente consistentes com o agrupamento de cepas de levedura.
Conforme revelado pela inspeção visual qualitativa, as cepas de levedura Chico
(o nome Chico refere-se a uma cepa artesanal amplamente utilizada na Costa
Oeste e é vendida por vários vendedores de levedura sob diferentes nomes),
incluindo WLP001, OYL-004, WY-1056 e IY-A07 produziram amplicons com os
mesmos padrões de bandas em um gel de agarose. O padrão de bandas da
cepa tipo Chico, US-05, era diferente daquele das cepas Chico, enquanto o
padrão de bandas da cepa tipo Chico BRY-97 parecia corresponder ao das cepas
Chico. Os padrões de bandas produzidos com as cepas de levedura Belle
Saison e LC1 diferiram entre si e com as cepas de leveduras cervejeiras. A cepa
de laboratório S288C produziu um padrão de bandas que diferia das leveduras
cervejeiras e da levedura selvagem (dados não mostrados). A correspondência
in silico dos iniciadores delta12 e delta21 com o genoma de Brettanomyces
bruxellensis (GenBank Assembly GCF_011074885.1) usando BLASTN sugeriu
que os iniciadores do elemento delta gerariam um amplicon com esta levedura.
O sequenciamento de próxima geração de amplicons de PCR interdelta
produziu leituras que foram prontamente transformadas em uma impressão digital
baseada em sequência de DNA para cada cepa de levedura. A produção por
amostra teve uma média de 251.493 leituras, variando 1,5 vezes, de 122.270
leituras a 382.139 leituras para as 19 amostras. O comprimento médio de leitura
por amostra foi de 213 pb e variou de 202 pb a 232 pb. A filtragem de leituras
para comprimento > 200 pb e taxa de erro máxima esperada ÿ 0,5 reteve em
média 49% (intervalo = 30% a 65%) das leituras. Em média, esse conjunto incluiu
732 (variação = 358 a 1.161) leituras únicas vistas >10 vezes. O número de
leituras exclusivas por amostra foi em média 353 (variação = 125 a 620) após a
etapa final de filtragem que reteve apenas
Figura 2. Tags de sequência representando a impressão digital interdelta NGS da
cepa de levedura WLP001 obtida com os primers delta12 e delta21 mostrados em
azul e vermelho, respectivamente. As reticências representam os 150 nucleotídeos
entre as bases 27 e 177 da sequência de 200 pb. As descrições da sequência indicam
a abundância de classificação de cada tag de sequência como “Uniq” seguido por um
número correspondente à classificação e a abundância da tag na coleção de ícone
ampl como “size=” seguido por um número representando a abundância.
As sequências completas estão disponíveis no Arquivo Suplementar 2.
as leituras com uma sequência completa de primers. Em média, 48% (intervalo =
31% a 59%) das leituras passaram pelo processo de filtragem completo e 88%
(intervalo = 74% a 94%) das leituras filtradas foram utilizadas para produzir uma
impressão digital interdelta NGS composta por 15 tags de sequência. para uma
cepa de levedura. A impressão digital interdelta NGS WLP001 incluiu oito tags
de sequência incorporando o primer d12 e sete tags de sequência com o primer
d21 (Figura 2). As 15 tags de sequência representaram leituras que foram vistas
de 570 a 1.1065 vezes no conjunto de dados NGS para WLP001 Amostra 1. As
impressões digitais interdelta NGS para as 21 amostras analisadas neste estudo
estão disponíveis no Arquivo Suplementar 2.
Reprodutibilidade de impressões digitais de tags de sequência
As impressões digitais Interdelta NGS foram altamente reprodutíveis, conforme
determinado por PCR repetido e sequenciamento das cepas de levedura WLP001
e Belle Saison. As amostras 1, 2 e 3 do WLP001 compartilharam 15 tags de
sequência que compõem a impressão digital desta cepa (Tabela 1). A impressão
digital do WLP001 permaneceu inalterada após o re-lançamento em série. As 15
tags de sequência que compreendem a impressão digital da levedura WLP001
foram compartilhadas pelas Amostras 2, 3, 4 e 5 geradas por WLP001 que foram
re-lançadas por 1, 2, 17 e 18 gerações, respectivamente.
As impressões digitais da etiqueta de sequência foram reproduzíveis para o Belle
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Jornal da Sociedade Americana de Químicos Cervejeiros 377

Tabela 1. Número de marcadores de sequência interdelta compartilhados entre cepas de levedura. Um total de 15 marcadores de sequência foram atribuídos a cada cepa.
WLP001 Bela temporada OYL-004 WY-1056 IY-A07 BRY-97 US-05 LC1 S228C

G0a G0 G1 G2 G17 G18 G0 LQ G0 LQ G0 G0 G0 Chico Chico-like W LS

Amostra 2 3 4 5 6 7 8 9 9,1 10 10,1 11 12 13 14 15 16 17 18 19

WLP001b 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 1 11111111111111
1 1 1 1 1 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 1 15 15 15 15 15 15 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 14 91 14 14 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 2 1 14 10 14 10 10 10 10 15 114 15 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 3 1 10 10 10 14 15 14 1 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 4 1 1 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 5 1 1 1 15 15 15 15 2 2 1
WLP001 6 1 1 1 15 15 15 15 2 2 1
Bela temporada 7 2 3
Bela temporada 8 0 3
Bela temporada 9 2 3
Bela temporada 9,1 0 3
Bela temporada 10 2 3
Bela temporada 2 3
Bela temporada 1111111 2 3
OYL-004 1 1 1 1 1 1 1 15 11 11 1 2 1
WY-1056 1 1 1 1 1 15 15 1 1 1 2 1
IY-A07 1 1 1 15 15 15 1 2 1
BRY-97 11112222 2 1
EUA-05 0 2
LC1 10,1 11 12 13 14 15 16 17 18 0

a G, geração; QL, baixa qualidade; W, levedura selvagem; LS, cepa de laboratório. Chico.

Cepa de levedura Saison também. A impressão digital da marca de sequência variou de 31% a 65% (Figura 3). As estatísticas MaxEE para a Amostra 9 e
da Amostra 12 compartilhou 15 marcas com as Amostras 9.1 e 10.1 da
levedura Belle Saison. No entanto, a correspondência exata das impressões
digitais nem sempre foi alcançada para a levedura Belle Saison, embora a
correspondência ainda fosse alta. A impressão digital da Amostra 8 de Belle
Saison compartilhou 14 de 15 marcadores de sequência com as Amostras
9.1, 10.1, 11 e 12 desta cepa de levedura.
A impressão digital de tags de sequência distinguiu com sucesso entre
cepas de levedura Chico e Chico-like. As impressões digitais das cepas de
levedura Chico WLP001, OYL-004, WY-1056, IY-A07 compartilharam 15
marcadores de sequência idêntica (Tabela 1). Em contraste, a impressão
digital da estirpe de levedura tipo Chico US-05 partilhou apenas duas marcas
de sequência com a estirpe WLP001 e as outras estirpes de levedura Chico.
A cepa BRY-97 é descrita como uma levedura West Coast Ale. A impressão
digital da cepa BRY-97 Chico-like era distinta da cepa US-05 Chico-like, mas
correspondia à impressão digital das quatro cepas Chico.
Amostra 10 que produzem impressões digitais com baixa reprodutibilidade
foram de 37% e 45%, respectivamente, o que estava dentro da faixa
observada para toda a coleção de 19 amostras. Da mesma forma, as
estatísticas de qualidade de leitura, incluindo as distribuições de pontuações
Q e o número total de leituras geradas, não foram tão informativas quanto o
comprimento médio de leitura para identificar amostras que produziam
baixa reprodutibilidade de impressões digitais (Figura Suplementar S1).
A Amostra 8 e a Amostra 9 produziram impressões digitais diferentes
para a cepa Belle Saison. A diferença parecia ser o resultado da má
qualidade do resultado do sequenciamento e não da má qualidade do DNA
modelo usado para o sequenciamento.
O re-sequenciamento dos amplicons da Amostra 9 e da Amostra 10 gerou
resultados de sequenciamento identificados como Amostra 9.1 e Amostra
10.1 com comprimentos médios de leitura de 212 pb e 204 pb,
respectivamente (Figura 3). Impressões digitais geradas a partir da Amostra 9.1 e

Impacto da qualidade de saída NGS na reprodutibilidade

das impressões digitais

Os resultados do sequenciamento de duas amostras de levedura Belle

Saison revelaram uma ligação entre a qualidade da saída NGS e a
reprodutibilidade da impressão digital. As impressões digitais geradas a
partir da Amostra 8, Amostra 9 e Amostra 10 da Belle Saison mostraram
baixa reprodutibilidade, conforme refletido pela Amostra 8 e Amostra 9, e
Amostra 8 e Amostra 10 compartilhando apenas nove das 15 tags de
sequência (Tabela 1). O comprimento médio de leitura foi visivelmente
menor para os dados NGS gerados a partir da Amostra 8 e da Amostra 9 do
que o restante do conjunto de dados de sequência. A maioria das amostras
produziu saída NGS com comprimento médio de leitura> 200 pb, variando
Figura 3. Comprimentos médios de leitura e porcentagens de leituras com taxas
de 202 pb a 223 pb (Figura 3). Em contraste, os comprimentos médios de
de erro esperadas <0,5 para leituras NGS obtidas por sequenciamento final de
leitura da Amostra 9 e da Amostra 10 foram de apenas 181 pb e 167 pb, respectivamente.
produtos de PCR gerados com os primers delta12 e delta21. Amostra 9 e Amostra
O comprimento médio de leitura identificou amostras gerando impressões
10 plotadas em impressões digitais geradas em vermelho para a cepa Belle Saison
digitais com baixa reprodutibilidade de forma mais eficaz do que a estatística que não correspondiam. Amostra 9.1 e Amostra 10.1 em verde representam o re-
de taxa de erro esperada (MaxEE) relatada pelo VSEARCH. sequenciamento dos produtos de PCR que geraram a Amostra 9 e a Amostra 10.
A porcentagem de leituras em cada amostra com MaxEE ÿ 0,5
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378 MT COTTRELL
A Amostra 10.1 compartilhou 14 de 15 tags de sequência com a Amostra 8 da
Belle Saison (Tabela 1). Da mesma forma, as impressões digitais geradas a partir
da Amostra 11 e da Amostra 12 da Belle Saison compartilharam 14 marcadores
de sequência com a Amostra 8. Os comprimentos médios de leitura de sequência
da Amostra 11 e da Amostra 12 foram de 211 pb e 203 pb, respectivamente.
Tags de sequência identificadas em sequências do genoma
A impressão digital interdelta da cepa de levedura S288C foi combinada com
sucesso com a sequência do genoma anotada de S288C. Uma pesquisa BLASTN
combinou as 15 marcas de sequência que compõem a impressão digital S288C
com o genoma S288C com 100% de identidade de sequência ao longo do
comprimento de cada marca de sequência (Tabela 2). Os locais de marcação de
sequência foram identificados em cinco dos 16 cromossomos, incluindo os
cromossomos III, IV, VII, XII e XVI. Seis marcadores de sequência foram
identificados no cromossomo IV, enquanto três ocorreram no cromossomo XVI
e dois foram encontrados nos cromossomos III, VII e XII.
Os alinhamentos de 14 dos 15 marcadores de sequência com a sequência do
genoma não incluíram lacunas. O alinhamento da etiqueta de sequência 13
incluiu duas lacunas. Treze dos marcadores de sequência correspondiam aos
locais no genoma anotados como Ty1/Ty2 LTR. Tags de sequência 7 e 9 sites
correspondentes anotados como Ty1/Ty3 e Ty1, respectivamente. A etiqueta de
sequência número 14 correspondeu a uma região do genoma sem anotação.
As sequências de tags WLP001 foram combinadas com sucesso com a
sequência do genoma completo do WLP001 (WGS). A correspondência conduzida
usando Magic-BLAST identificou todas as 15 tags de sequência que compõem a
impressão digital interdelta da cepa WLP001 com 100% de identidade de
sequência e 100% de cobertura (Tabela 3).
Todas as 15 tags de sequência WLP001 foram identificadas com 100% de
cobertura no WGS WLP001. A profundidade de cobertura das tags de sequência
foi em média de 1.057 leituras (intervalo = 168 a 5.458). O WGS WLP001 não
inclui a anotação necessária para identificar domínios LTR.
Contaminação cruzada experimental e contaminação por leveduras
estranhas
A impressão digital Interdelta NGS distinguiu com sucesso entre contaminação
cruzada produzida experimentalmente e contaminação por leveduras estranhas.
A demonstração utilizou misturas da cepa cervejeira WLP001 com a cepa LC1
de levedura selvagem e levedura cervejeira Belle Saison (Figura 4). LC1 é uma
levedura selvagem resistente ao cobre e Belle Saison é um exemplo de levedura
cervejeira que é resistente ao cobre em concentrações que normalmente inibem
o crescimento da levedura cervejeira, como a WLP001. Misturas de levedura de
cerveja WLP001 com a cepa de levedura estrangeira LC1 e WLP001 com a cepa
Belle Saison em meio FOWY produziram 120 e 60 colônias, respectivamente
(dados não mostrados). Colônias de leveduras LC1 e Belle Saison resistentes ao
cobre eram morfologicamente indistinguíveis. As duas cepas produziram colônias
de cor creme com três a cinco milímetros de diâmetro, circulares e elevadas com
margens inteiras.
Colônias de leveduras contaminantes misturadas com a cepa WLP001 foram
identificadas com sucesso usando impressão digital inter-delta NGS. Amostras
1, 8, 13, 14, 15, 16,
e 19 serviram como impressões digitais de referência para as cepas de levedura
cervejeira utilizadas neste cenário experimental de cervejaria. A Amostra 12 e a
Amostra 19 foram tratadas como desconhecidas, tendo sido geradas a partir das
colônias observadas em ensaios de placa de vazamento da contaminação
experimental da cepa WLP001. A comparação das impressões digitais interdelta
NGS geradas a partir de colônias nas duas placas de ágar (Amostra 12 e
Amostra 19, respectivamente) com a impressão digital de referência Belle Saison
revelou que 14 das 15 tags de sequência correspondiam entre a Amostra 12 e a
Amostra 8. Em contraste, apenas três marcadores de sequência da impressão
digital da Amostra 19 corresponderam aos marcadores de sequência da
impressão digital da Amostra 8 da levedura Belle Saison. A correspondência
entre a impressão digital interdelta NGS da Amostra desconhecida 12 e a
impressão digital de referência da Amostra 8 apoiou a conclusão de que a
Amostra 12 representou uma contaminação cruzada por uma levedura interna, a
cepa Belle Saison. A falta de correspondência entre a impressão digital da
Amostra 19 e qualquer levedura cervejeira utilizada na cervejaria (ou seja,
Amostras 1, 8, 13, 14, 15, 16 e 17) apoiou a conclusão de que a Amostra 19
representava contaminação por um cepa de levedura selvagem estrangeira.
Disponibilidade de dados de sequência
Os dados de sequência utilizados neste estudo foram depositados sob o acesso
PRJNA862970 do BioProject.
Discussão
A análise da sequência de DNA é uma ferramenta poderosa para identificar
micróbios, incluindo fungos, mas estabelecer um locus genético adequado para
distinguir cepas de levedura cervejeira S. cerevisiae tem sido um desafio.[24] O
sequenciamento NGS de amplicons de PCR interdelta gerou impressões digitais
reprodutíveis e informativas, diferenciando cepas de levedura cervejeira com
uma abordagem que é facilmente acessível aos cervejeiros. Os laboratórios de
cervejarias são comumente equipados para identificar micróbios que deterioram
a cerveja usando PCR. A etapa NGS pode ser realizada sem treinamento
especializado, usando serviços de laboratório de sequenciamento comercial. Os
dados da sequência foram analisados utilizando um algoritmo fixo com pouca
variação entre as análises. Ao contrário da implementação atual da impressão
digital interdelta que se baseia em imagens de padrões de bandas vistos em géis
de agarose, a impressão digital interdelta NGS é composta por sequências de
DNA que podem ser registradas, comparadas e utilizadas como referência fixa.
As cervejarias devem gerar impressões digitais de suas próprias cepas de
levedura cervejeira se as designações dos fornecedores diferirem daquelas
usadas neste estudo. Em princípio, a impressão digital interdelta NGS poderia
ser usada para gerar uma biblioteca de referência de toda a coleção de leveduras
utilizadas em uma cervejaria, produzindo um recurso valioso para investigar
casos de contaminação por leveduras. Os produtores de leveduras que mantêm
e propagam diversos catálogos de leveduras também se beneficiariam com esta
abordagem.
A impressão digital Interdelta NGS é adequada para lidar com casos de
contaminação por leveduras, como demonstrado pela contaminação experimental
da levedura WLP001 com Belle
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Jornal da Sociedade Americana de Químicos Cervejeiros 379

Tabela 2. Características das tags de sequência que compõem a impressão digital interdelta da cepa de levedura S228C.
Os iniciadores de PCR foram removidos dos marcadores de sequência de 200 pb antes do alinhamento com a sequência do
genoma S228C usando BLASTN.

Etiqueta de sequência Cromossoma Intervalo de sequência Identidades Lacunas Anotação Primeiro

XVI 62553…62732 180 0 Ty1/Ty2 LTR delta21

1 4 513536…513716 181 0 Ty1/Ty2 LTR delta12
2 4 513533…513712 180 0 Ty1/Ty2 LTR delta21
3 XII 378565…378744 180 0 Ty1/Ty1 LTR delta21
4 XVI 62348…62528 181 0 Ty1/Ty1 LTR delta12
5 III 84599…84779 181 0 Ty1/Ty1 LTR delta12
6 4 651362…651541 180 0 TY1/TY3 TR delta21
7 VII 535638…535817 180 0 Ty1/Ty1 LTR delta21
8 4 651516…651696 846 181 0 TY1 LTR delta12
9 III 89…84868 180 0 Ty1/Ty2 LTR delta21
10 VII 535515…535695 181 0 Ty1/Ty1 LTR delta12
11 XII 378574…378754 181 0 Ty1/Ty1 LTR delta12
12 XVI 62348…62530 181 2 Ty1/Ty2 LTR delta12
13 4 877987…878166 180 0 nenhum delta21
14 15 4 878150…878330 181 0 Ty1/Ty2 LTR delta12

Tabela 3. Estatísticas de cobertura de sequência para as tags de sequência que quadros de funções desconhecidas ou regiões intergênicas. Apesar do
compõem a impressão digital interdelta da cepa de levedura WLP001 alinhada à poder potencial do MLST, foi demonstrado que a tipagem interdelta tem
sequência do genoma WLP001. maior poder discriminatório do que o MLST da levedura vinícola.[27] O
Etiqueta de sequência Lê Identidade (%) Cobertura (%) Profundidade média estudo examinou leveduras viníferas comerciais obtidas de vários
460 100 100 306 fornecedores europeus e norte-americanos, isolados de mostos de
1 590 100 100 383
2 785 100 100 551
fermentação natural amostrados no Líbano, leveduras recolhidas na
3 865 100 100 617 Ásia e estirpes de referência laboratoriais. O poder discriminatório da
4 764 100 100 540 tipagem interdelta foi >99% comparado a 92,27% para a abordagem
5 550 100 100 361
6 469 100 100 303
MLST que pesquisou 7 loci. O poder discriminatório é a probabilidade
7 8064 100 100 5180 de um teste distinguir com sucesso entre duas cepas amostradas
8 496 100 100 315 aleatoriamente em uma população.[28] O poder discriminatório de um
9 497 100 100 321
10 8628 100 100 5458
ensaio de microssatélites que também amostrou várias regiões do
11 240 100 100 168 genoma foi igual ao da tipagem interdelta.
12 661 100 100 462
13 453 100 100 295
14 15 838 100 100 601
Além de ser mais poderosa, a digitação interdelta também era mais
eficiente em termos de recursos do que a digitação MLST e de
microssatélites. A tipagem interdelta exigiu apenas uma única reação
de PCR [12] em comparação com sete reações de PCR para o MLST e
Levedura de cerveja Saison e levedura selvagem LC1. A detecção seis reações de PCR usadas para a tipagem de microssatélites.[29]
inicial de contaminação durante a produção de cerveja é frequentemente Várias propriedades dos elementos transposon LTR permitem a
realizada usando meio seletivo contendo cobre, projetado para detectar diferenciação de cepas de levedura por impressão digital interdelta
leveduras selvagens que são mais resistentes ao cobre do que leveduras NGS. Os transposons LTR são abundantes e diversos, constituindo
de cerveja. No entanto, a resistência ao cobre varia muito entre as 1,3% a 3,4% do genoma de S. cerevisiae[30,31] que inclui 483
cepas de S. cerevisiae, incluindo cepas de levedura cervejeira [25] e ocorrências de Ty1 a Ty5.[32] Ty1 é o mais abundante, ocorrendo 313
algumas cepas de levedura cervejeira comumente usadas crescerão na vezes no S288C S. cerevisiae
presença de cobre em concentrações que são inibitórias para a maioria genoma. Os elementos Ty1 completos ocorrem 32 vezes, enquanto os
das leveduras cervejeiras. ] O desenvolvimento de uma interpretação elementos solo são quase 10 vezes mais abundantes, ocorrendo 279
prática do crescimento de leveduras em meios contendo cobre requer vezes. Solo LTR são gerados através de recombinação intra-elemento
informações adicionais. As análises de PCR podem permitir a que excisa o DNA interno do trans-poson dos domínios LTR
identificação de tipos específicos de contaminação por leveduras, como flanqueadores, deixando para trás um único elemento LTR. [33,34] Os
o gene STA1 contendo S. cerevisiae var. diastático[11] elementos Solo LTR são a fonte provável de distinção da diversidade
ou levedura selvagem tal como Wickerhamomyces sp. identificável por de impressões digitais NGS interdelta. entre cepas de levedura
uma assinatura de espaçador transcrito interno de RNA ribossômico.[26] cervejeira. Os elementos Solo LTR são altamente abundantes e contêm
No entanto, a classificação geral da levedura selvagem Saccharomyces muita diversidade de sequências na forma de deleções de nucleotídeos.
versus levedura cervejeira permanece desafiadora. A variação de sequência entre LTRs solo é normalmente maior do que
Uma variedade de ferramentas genéticas têm sido aplicadas ao entre LTRs associados a elementos de transposon LTR completos.
desafio da identificação de leveduras cervejeiras. A tipagem interdelta e
a digitação de sequências multilocus (MLST) coletam informações de Os dados da sequência interdelta NGS usados para gerar impressões
identificação de vários locais espalhados pelo genoma da levedura. O digitais interdelta NGS refletiram fielmente as assinaturas genômicas de
MLST tem potencial para o mais alto nível de discriminação genética, leveduras S. cerevisiae. As tags de sequência foram combinadas com
dependendo de polimorfismos de nucleotídeo único que podem ocorrer sucesso com os genomas S288C e WLP001, demonstrando que os
em genes de manutenção, leitura aberta amplicons submetidos ao sequenciamento NGS não eram altamente
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380 MT COTTRELL
Figura 4. Diagrama esquemático de contaminação cruzada experimental
interna e contaminação por levedura selvagem estranha usando misturas
de levedura WLP001 com levedura de cerveja Belle Saison e levedura
selvagem estranha LC1, respectivamente. As cepas Belle Saison e LC1
produzem colônias em meios contendo cobre, enquanto o crescimento de
WLP001 é inibido pelo cobre. Cada tipo de contaminação experimental foi
identificada usando a correspondência de impressões digitais interdelta NGS.
impactado por artefatos de PCR. A similaridade de sequência e as repetições
de sequência de elementos delta têm o potencial de gerar artefatos de PCR,
como amplicons quiméricos.[36] No entanto, as impressões digitais geradas
a partir de diferentes amostras da mesma cepa não estavam isentas de
variações. A correspondência de 14 das 15 marcas de sequência entre
diferentes amostras da cepa Belle Saison revelou um nível de variação nas
impressões digitais que precisa ser reconhecido. Idealmente, todo o universo
de levedura cervejeira seria amostrado diversas vezes para avaliar o nível
geral de variação analítica. No entanto, a abordagem apresentada neste
estudo provavelmente será mais aplicável a coleções limitadas de cepas de
levedura, como aquelas usadas em uma única cervejaria, e não a todo o
universo de levedura cervejeira. Uma fonte de
a variabilidade da correspondência de impressões digitais foi relacionada ao
comprimento médio de leitura da amostra. As taxas de erro podem ser
infladas por leituras NGS encurtadas causadas pela pré-fasagem que ocorre
durante o processo de sequência por síntese.[37,38]
A tipagem interdelta é mais adequada para identificar cepas de levedura
do que para abordar questões sobre similaridade e parentesco. As
semelhanças entre cepas de levedura mostradas por comparações de
características fisiológicas e origem geográfica não foram refletidas de forma
confiável pela tipagem interdelta.[39] Um estudo de 69 estirpes de S.
cerevisiae recolhidas na Hungria a partir de mostos de fermentação
espontânea não revelou nenhum agrupamento de estirpes com base na
origem geográfica ou características fenotípicas. As cepas agrupadas com
base na tipagem interdelta geralmente tinham origens geográficas diferentes
e as cepas com pouca semelhança de tipos interdelta eram frequentemente
coletadas no mesmo local e no mesmo ano de colheita. A transferência
horizontal de transposons LTR em leveduras[30] e as altas taxas de
movimento populacional entre regiões vinícolas provavelmente obscureceram
qualquer padrão que seria consistente com populações isoladas de leveduras.
Da mesma forma, a tipagem interdelta não refletiu o agrupamento de cepas
com base em características fisiológicas, como tolerância osmótica, ao etanol
ou ao cobre.[40] Não está claro se deveria ser esperada uma correlação
entre características fisiológicas e padrões gerados pela tipagem interdelta.
A pressão seletiva imposta pelo ambiente natural sobre as leveduras
provavelmente difere muito das pressões seletivas sobre os elementos
transponíveis que habitam o ambiente do genoma da levedura.[41]
A contaminação cruzada entre levedura de cerveja e a contaminação
por levedura selvagem estrangeira exigem diferentes ações corretivas para
localizar e erradicar a levedura invasora. No caso de contaminação cruzada
interna, as características sensoriais da levedura cervejeira com
contaminação cruzada podem informar a análise sensorial, identificando a
extensão e a origem da contaminação.[42] A contaminação cruzada é melhor
abordada concentrando-se nos elementos do sistema de fermentação,
especialmente nas peças utilizadas para armazenamento, propagação e
transferência de levedura entre fermentadores para re-infusão em série. Em
contraste, as respostas mais eficazes à contaminação por leveduras
selvagens estranhas dirigem-se ao ambiente da cervejaria onde a levedura
selvagem pode se estabelecer.[26,43] Qualquer equipamento de
processamento de cerveja que esteja exposto ao ambiente da cervejaria e
seja difícil de limpar será suscetível a colonização por leveduras selvagens.
Essas fontes ambientais são o foco da eliminação de leveduras selvagens
contaminação.
Este estudo examinou um número limitado de cepas de levedura para
demonstrar o princípio de uma abordagem de impressão digital genética que
pode ajudar os cervejeiros a discriminar entre cepas de levedura cervejeira e
identificar a contaminação cruzada interna e a contaminação por levedura
selvagem. A aplicação generalizada da impressão digital interdelta NGS
provavelmente revelará cepas de levedura cervejeira que não serão
diferenciadas com sucesso. Espera-se que o impacto dessas exceções na
abordagem global seja baixo no contexto das cervejarias que utilizam
coleções limitadas de cepas de levedura. Em última análise, o sequenciamento
de genomas inteiros de alto rendimento tem o potencial de se tornar uma
ferramenta definitiva para identificar cepas de levedura.
O sequenciamento do genoma revelou muito sobre as origens, domesticação
e evolução da levedura cervejeira[7,25,44,45] .
Avanços tecnológicos em sequenciamento e bioinformática
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a análise pode levar à identificação de cepas rotineiramente .[46,47] No
entanto, ainda há muito trabalho a ser feito até que esses recursos
genômicos possam ser adaptados para uso pelos cervejeiros. A impressão
digital Interdelta NGS é uma ferramenta acessível que os laboratórios de
qualidade de produção de cerveja e levedura podem utilizar para identificar
leveduras, combinando impressões digitais de cepas desconhecidas com
impressões digitais de referência de cepas de levedura catalogadas.
Reconhecimentos
Este trabalho foi inspirado no Projeto TSC para Excelência em Ecologia Microbiana.
A Heavy Seas Beer forneceu espaço de laboratório e instrumentação analítica.
Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesses foi relatado pelos autores.
ORCIDA
Matthew T. Cottrell http://orcid.org/0000-0003-0449-9999
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