Estudante: Ranniele Luíza Ventura

Disciplina: Bioinformática
Gênero: Aspergillus Identificação de nova espécie: 2023
Espécie Identificada: Aspergillus pseudolabamensis

O artigo apresenta a seguinte metodologia, com intuito de descobrir a espécie

do fungo do gênero Aspergillus que foram isolados de pacientes entre os anos
de 2015 a 2020, após obterem o resultado de que alguns isolados já eram de
espécies conhecidas através de análise combinada de sequenciamento de
DNA e características fenotípicas, depararam-se com a existência de uma
possível nova espécie, portanto iniciaram a identificação dos isolados que não
apresentaram resultados com espécies já descritas no MycoBank.
Os 5 isolados que não apresentaram espécies já conhecidas foram submetidos
a testes como: análises filogenéticas, análises fenotípicas e análises
morfológicas

Materiais e métodos

2.1. Isolados fúngicos
Neste estudo prospectivo realizado entre outubro de 2015 e janeiro de
2020, foram incluídos os isolados sequenciais da espécie Aspergillus recebidos
em nosso laboratório de micologia de referência (Fungus Testing Laboratory,
UT Health San Antonio) para identificação de espécies ou teste de
suscetibilidade antifúngica. Excluíram-se os isolados seriados dos mesmos
pacientes e os de animais, amostragens ambientais, unhas e orelhas, com
exceção daqueles incluídos na descrição da nova espécie. Subculturas de
todos os isolados foram preparadas em ágar de flocos de batata no dia do
recebimento antes de testes adicionais [ 15 ].

2.2. Identificação da espécie
Todos os isolados foram identificados em nível de espécie por análise
combinada de sequência de DNA e características fenotípicas (ou seja, colônia
e morfologia microscópica). Na preparação para a análise da sequência de
DNA, os isolados foram suspensos em Tampão G2 (Qiagen, Valencia, CA,
EUA) seguido de lise usando um instrumento bead beater (Precellys Evolution,
Bertin Instruments, Rockville, MD, EUA) e a adição de proteinase K e
incubação a 56 °C [ 16 , 17 ]. Um kit de tecido EZ1 DNA e um instrumento
BioRobot EZ1 (Qiagen) foram então usados para realizar a extração de DNA. A
calmodulina parcial ( CaM ) e a β-tubulina ( BenA) os genes foram então
sequenciados usando os pares de iniciadores publicados anteriormente CF1L
(5-GCCGACTCTTTGACYGARGAR-3) e CF4 (5-
TTTYTGCATCATRAGYTGGAC-3) e Bt2a (5-TGACCCAGCAGATGTT-3) e
Bt2b (5-GTTGTTGGGAATCCACTC-3), respectivamente [ 18 ]. As buscas
BLASTn das sequências foram então realizadas no GenBank, e os resultados
com pelo menos 90% de cobertura de consulta foram considerados
significativos com um valor E de 0,0 em 98-100% de identidade.

2.3. Descrição de Novas Espécies

Outras análises filogenéticas e análises fenotípicas foram realizadas em
cinco isolados adicionais, dois do mesmo paciente, que não puderam ser
identificados em nível de espécie. Para observações fenotípicas e
morfológicas, foram utilizados ágar extrato de malte (MEA, Oxoid Limited,
Hampshire, Reino Unido), ágar creatina (CREA), autolisado de levedura
Czapek (CYA) e ágar floco de batata (PFA). Os isolados foram inoculados em
três pontos em cada placa de cada meio e incubados a 25 °C, 37 °C e 40 °C no
escuro por 7 dias. As características da colônia foram examinadas após 7 dias
de incubação e a cor da colônia foi registrada seguindo as descrições de cores
no Methuen Handbook of Color [ 19]. Para observações micromorfológicas,
montagens microscópicas foram feitas em lactofenol azul de algodão de
colônias de MEA. Culturas de lâminas também foram realizadas e imagens de
microscopia eletrônica de varredura (SEM) também foram obtidas de
montagens tiradas de colônias de MEA.
Para análise filogenética, as culturas foram cultivadas em inclinações de
PFA e incubadas a 25 °C por 7 dias. O DNA foi extraído dos micélios colhidos
seguindo métodos previamente descritos [ 20 ]. A região ITS e partes de três
regiões gênicas, BenA , CaM , e os genes da segunda maior subunidade
( RPB2 ) da RNA polimerase II foram amplificados e sequenciados conforme
descrito anteriormente usando os seguintes pares de iniciadores: BMBC-R e
NL4R (ITS), Bt2a e Bt2b ( BenA ), CF1 e CF4 ( CaM ) e 5F e 7CR ( RPB2 )
[ 20]. O sequenciamento bidirecional foi realizado usando um sistema de
eletroforese capilar (analisador genético 3730 × L ou analisador genético 3500
× L, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). As sequências obtidas foram
inspecionadas manualmente, sequências contíguas foram geradas e os
alinhamentos das sequências foram produzidos usando o programa Muscle
implementado no SEQUENCHER v. 5.4.6., build 46289 (Gene Codes Corp.
Ann, Arbor MI, EUA) [ 21 ] . O software IQ-TREE foi usado para construir
árvores filogenéticas usando máxima verossimilhança, e o programa
ModelFinder foi usado para encontrar o modelo de substituição mais adequado
para cada gene de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC). Programas
para medir o suporte de ramificação (ou seja, o teste de Bayes aproximado
(aBayes) e programas de bootstraps ultrarrápidos (BS)) foram implementados
[ 22 ,23 , 24 , 25 , 26 ]. O tipo de cepa de A. fumigatus (NRRL 163) foi usado
como grupo externo. Foram realizadas análises de locus único
para ITS , LSU , BenA , CaM e RPB2 , bem como multi-locus. FigTree ver 1.4.4
( http://github.com/rambaut/figtree/ , acessado em 11 de novembro de 2020)
foi usado para visualizar árvores e editado usando o Canvas Draw 3 para MAC
(v. 3.0.5, build 274). Para aumentar a robustez das topologias de ML
observadas nos conjuntos de dados, os valores de aBayes implementados no
software IQTREE v2.2.0 também foram mostrados juntamente com os valores
de BS [ 24 , 25].

2.4. Suscetibilidade In Vitro
A susceptibilidade aos antifúngicos foi avaliada através dos métodos de
microdiluição em caldo do Clinical and Laboratory Standards Institution (CLSI)
para anfotericina B, isavuconazol, itraconazol, posaconazol, voriconazol e
micafungina [ 27]. As soluções estoque na concentração de 100X de cada
antifúngico foram preparadas em DMSO, e as diluições posteriores foram feitas
em RPMI tamponado com MOPS 0,165 M (pH 7,0), glicose 0,2% e vermelho
de fenol e sem bicarbonato. As concentrações finais dos testes variaram de
0,03 a 16 mg/L para a anfotericina B e os triazóis e de 0,015 a 8 mg/L para a
micafungina. Para a anfotericina B e os triazóis, as concentrações inibitórias
mínimas (CIM) foram lidas em 100% de inibição do crescimento após 48 h de
incubação a 35 °C, enquanto a concentração efetiva mínima (CEM) para a
micafungina, definida como a menor concentração que resultou em (por
exemplo, hifas curtas, atarracadas e anormalmente ramificadas), foi lida após
24 h de incubação na mesma temperatura. Hamigera inseticola ATCC MYA-
3630 (anteriormente identificado comoPaecilomyces variotii ) foi incluído como
isolado de controle de qualidade em cada dia de teste.

2.5. Análise de dados
A distribuição das espécies e os locais de cultivo foram descritos por meio
de estatística descritiva. Faixas MIC/MEC, valores MIC/MEC 50 e MIC/MEC 90
(isto é, valores MIC/MEC que inibiram 50% e 90% dos isolados,
respectivamente), valores modais MIC/MEC e média geométrica
(GM ) MIC / MEC os valores foram determinados para cada antifúngico. Quando os
valores de MIC/MEC medidos eram maiores do que a concentração mais alta
testada, a próxima concentração 2X mais alta foi atribuída para comparações
estatísticas. As diferenças nos valores GM MIC foram avaliadas quanto à
significância por ANOVA com o teste post hoc de Tukey para comparações
múltiplas e as correlações entre isavuconazol, posaconazol e voriconazol MICs
foram avaliadas pela correlação de Pearson usando valores MIC transformados
em log 2.

Taxonomia
Aspergillus pseudoalabamensis CF Cañete-Gibas, C. Sanders, J. Mele e
NP Wiederhold, sp. nov. ( Figura 4 ).
Figura 4. Aspergillus pseudoalabamensis sp. nov. (UTHSCSA DI16-489; CBS
149790). Colônias após 7 d a 25 °C, 37 °C e 40 °C, respectivamente em:
( A – C ) MEA; ( D – F ) CYA; ( G – I ) CREA; ( J ) vesícula, (seta azul) métulas
e fiálides; ( K ) (seta amarela) célula do pé; ( L ) (seta branca) conídios
acessórios; ( M ) (seta preta) vesícula reduzida; ( N – P ) (imagens SEM)—( N )
cabeça conidial colunar, ( O ) conidióforo finamente rugoso, e ( P) conídios
estriados.
Mycobank: MB847407.
Classificação—Fungos Dikarya Ascomycota Pezizomycotina
Eurotiomycetes Eurotiomycetidae Eurotiales Aspergillaceae Aspergillus ,
Infragen. classe: subgen. Circumdati, sec. Terrei, ser. Terrei.
Etimologia: pseudoalabamensis refere-se a A. alabamensis , espécie
morfologicamente semelhante e filogeneticamente próxima.
 Diagnóstico—A cor conidial em massa é amarelo pálido a alabastro
(2A3/5B2) tornando-se acinzentado a laranja acastanhado (5B3-5C3) quando
maduro. O estipe é finamente rugoso e os conídios são elipsoidais e
estriados. A espécie não cresce a 50 °C.
Tipo . Estados Unidos da América, Colorado, aspirado traqueal de um
paciente humano; 2016; holótipo = H-25222; Tipo Ex = UTHSCSA DI16-489 =
CBS 149790; Código de barras ITS : OL765285; marcadores
alternativos: BenA = OL792694; CaM = OL764871; RPB2 = OL764876.
Materiais adicionais examinados. Estados Unidos da América, Colorado.
Isolado do seio etmoidal direito de um paciente humano, 2015, cultura
UTHSCSA DI16-487 = CBS 149791; ITS = OL765283; BenA =
OL792695; CaM = OL764872; RPB2 = OL764877.
Isolado do seio etmoidal direito de um paciente humano, 2015, cultura
UTHSCSA DI16-488 = CBS 149792; ITS = OL765284; BenA =
OL792696; CaM = OL764873; RPB2 = OL764878.
Isolado de um esfregaço de ouvido de um paciente humano, 2019, cultura
UTHSCSA DI21-178 = CBS 149793; ITS = OL765286; BenA =
OL792693; CaM = OL764870; RPB2 = OL764875.
Isolado de uma amostra de escarro de um paciente humano, 2020, cultura
UTHSCSA DI21-179 = CBS 149794; BenA = OL792692; CaM =
OL764869; RPB2 = OL764874.
4.1. Características fenotípicas
Morfologia da colônia—Diâmetro da colônia após 7 dias (mm): 25 °C—
CYA 46, MEA 32, CREA 25–26; 37 °C—CYA 70, MEA 65, CREA 57–60; 40 °C
—CYA 29–32, MEA 27–30, CREA 22; 50 °C—sem crescimento em todos os
meios.
CYA, 25 °C, 7 dias: colônias levemente elevadas no centro e sulcadas
radialmente; margens inteiras, regulares; micélio branco; escleródios
ausentes; textura aveludada; grau de esporulação pobre nas margens e
esparso no centro; conídios em massa amarelo pálido a alabastro; pigmentos
solúveis ausentes; exsudados ausentes; creme de pigmentação reversa
( Figura 4 D–F).
MEA, 25 °C, 7 dias: colônias levemente elevadas no centro e sulcadas
radialmente; margens inteiras, regulares; micélio branco; escleródios
ausentes; textura aveludada; grau de esporulação pobre a moderado; conídios
maciços acinzentados a alaranjados acastanhados; pigmentos solúveis
ausentes; exsudados ausentes; creme de pigmentação reversa ( Figura 4 A–
C).
CREA, 25 °C, 7 dias: colônias levemente elevadas, margens inteiras,
regulares; micélio branco; escleródios ausentes; textura aveludada; grau de
esporulação pobre a moderado; conídios maciços acinzentados a alaranjados
acastanhados; nenhuma produção de ácido observada ( Figura 4 G–I).

4.2. Micromorfologia
Conidióforos bisseriados. Estipes hialinos, 150–325 × 2,5 μm, paredes
lisas a finamente rugosas, asseptadas, células do pé principalmente
assimétricas. Cabeças de conídios densamente colunares; vesículas,
subglobose, 12,5-22,5 μm de diâmetro. Metulae (L) 5 μm. Fialides (L) 5–6,5
μm, cilíndrico. Conídios elipsoidais, estriados, 2–2,3 × 1,42–1,60 μm. Conídios
acessórios espreitados. Não foram observados ascomas, ascósporos ou
células Hülle.
Notas: A. pseudoalabamensis está filogeneticamente intimamente
relacionado com A . alabamensis ; no entanto, pode ser diferenciada desta
espécie pelos dados de sequência de BenA , CaM e RPB2 . Os conídios de A.
pseudoalabamensis são amarelo pálido a acinzentado a laranja acastanhado
em massa, enquanto os de A. alabamensis são marrom amarelado brilhante a
marrom canela [ 29 ]. Além disso, conforme demonstrado por microscopia de
luz e SEM, os conidióforos de A. pseudoalabamensis são mais curtos (150–325
× 2,5 μm) e finamente rugosos do que os de A. alabamensis, que são mais
longos (150-500 μm × 4,5-6 μm) e lisos ( Figura 4 J-P) [ 29 ].