Você está na página 1de 31
Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa
Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa
Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa

Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Professor: Rodrigo Almeida

Objectivos

Objectivos • Introdução à espectroscopia vibracional no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR): •

Introdução à espectroscopia vibracional no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR):

Aplicação à análise estrutural de proteínas.

Introdução às medidas fluorimétricas:

Espectros de excitação e emissão;

Introdução à fluorescência de proteínas:

O triptofano como composto modelo;

Aplicação ao estudo da estrutura e dinâmica de proteínas em

solução;

FTIR (I)

FTIR (I) • É um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região do

É um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região do infravermelho do espectro electromagnético da radiação emitida

pelas substâncias;

Baseia-se no facto das ligações químicas dos compostos possuírem

frequências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis de energia da molécula (níveis vibracionais).

As frequências de vibração dependem:

da geometria molecular;

das massas dos átomos.

FTIR (II)

FTIR (II) • As ligações podem vibrar de seis modos: Estiramento Estiramento Tesoura Torção Simétrico

As ligações podem vibrar de seis modos:

FTIR (II) • As ligações podem vibrar de seis modos: Estiramento Estiramento Tesoura Torção Simétrico
FTIR (II) • As ligações podem vibrar de seis modos: Estiramento Estiramento Tesoura Torção Simétrico
FTIR (II) • As ligações podem vibrar de seis modos: Estiramento Estiramento Tesoura Torção Simétrico
FTIR (II) • As ligações podem vibrar de seis modos: Estiramento Estiramento Tesoura Torção Simétrico

Estiramento

Estiramento

Tesoura

Torção

Simétrico

Assimétrico

Tesoura Torção Simétrico Assimétrico Balanço Rotação • Se a molécula receber radiação

Balanço

Tesoura Torção Simétrico Assimétrico Balanço Rotação • Se a molécula receber radiação

Rotação

Se a molécula receber radiação eletromagnética com a mesma energia de uma dessas vibrações, então a luz será absorvida.

Procedimento (FTIR)

Procedimento (FTIR) Pastilha com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco
Pastilha com KBr
Pastilha com KBr
Pastilha com mioglobina em KBr
Pastilha com
mioglobina em KBr
Pastilha com γ-globulina em KBr
Pastilha com
γ-globulina em KBr
com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco 5 DQB-Licenciatura em
com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco 5 DQB-Licenciatura em
com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco 5 DQB-Licenciatura em
Branco
Branco
com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco 5 DQB-Licenciatura em
com KBr Pastilha com mioglobina em KBr Pastilha com γ-globulina em KBr Branco 5 DQB-Licenciatura em

Espectros de FTIR Análise

conformacional

Espectros de FTIR – Análise conformacional KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis
Espectros de FTIR – Análise conformacional KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis
Espectros de FTIR – Análise conformacional KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Determinação da estrutura secundária das proteínas

Espectros de FTIR - Mioglobina CO 2 (interferente) Banda Amida II 1542,78 cm - 1

Espectros de FTIR - Mioglobina

CO 2 (interferente)
CO 2
(interferente)

Banda Amida II 1542,78 cm -1 84,9% T

Banda Amida A 3301,55 cm -1 87,46% T 3311,19 cm -1 87,53% T

Banda Amida I 1656,56 cm -1 82,12% T

T 3311,19 cm - 1 – 87,53% T Banda Amida I 1656,56 cm - 1 –

7

DQB-Licenciatura em Bioquímica

Análise estrutural - Mioglobina Banda Amida I 1656,56 cm - 1 – 82,12% T Estrutura

Análise estrutural - Mioglobina

Análise estrutural - Mioglobina Banda Amida I 1656,56 cm - 1 – 82,12% T Estrutura secundária

Banda Amida I 1656,56 cm -1 82,12% T

Mioglobina Banda Amida I 1656,56 cm - 1 – 82,12% T Estrutura secundária predominante: hélice α

Estrutura secundária

predominante: hélice α

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Comparação com a literatura - Mioglobina KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic

Comparação com a literatura -

Mioglobina

Comparação com a literatura - Mioglobina KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis
Comparação com a literatura - Mioglobina KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Espectros de FTIR – γ -Globulina Banda Amida II 1536,99 cm -1 – 27,16% T

Espectros de FTIR – γ-Globulina

Banda Amida II 1536,99 cm -1 – 27,16% T Banda Amida B 3085,56 cm -1
Banda Amida II
1536,99 cm -1 – 27,16% T
Banda Amida B
3085,56 cm -1 – 39,12% T
Banda Amida I
1643,06 cm -1 – 21,89% T
Banda Amida A
3288,05 cm -1 – 26,03% T

Banda Amida III 1238,08 cm -1 54,81% T

Análise estrutural - γ -Globulina Banda Amida I 1643,06 cm - 1 – 21,89% T

Análise estrutural - γ-Globulina

Análise estrutural - γ -Globulina Banda Amida I 1643,06 cm - 1 – 21,89% T Estrutura

Banda Amida I 1643,06 cm -1 21,89% T

-Globulina Banda Amida I 1643,06 cm - 1 – 21,89% T Estrutura secundária predominante: folha β

Estrutura secundária

predominante: folha β

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Comparação com a literatura

- γ-Globulina

Comparação com a literatura - γ -Globulina KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic
Comparação com a literatura - γ -Globulina KONG J. et al .: Fourier Transform Infrared Spectroscopic

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Espectroscopia de Fluorescência Espectroscopia de Fluorescência: tipo de espectroscopia electromagnética que analisa a

Espectroscopia de Fluorescência

Espectroscopia de Fluorescência: tipo de espectroscopia electromagnética que analisa a fluorescência de uma amostra.

Ocorre devido à presença de moléculas aromáticas.

Moléculas no

estado excitado

Emissão de fotão

Moléculas no estado excitado Emissão de fotão Aparelhos: Espectrofluorímetros Trp Indole Moléculas no

Aparelhos: Espectrofluorímetros

Trp
Trp
Emissão de fotão Aparelhos: Espectrofluorímetros Trp Indole Moléculas no estado fundamental Principal

Indole

Moléculas no

estado fundamental

Principal fluoróforo das proteínas: indole dos resíduos de Trp

Procedimento (Fluorescência) Triptofano em tampão Triptofano em etanol λ = 350 nm λ = 295

Procedimento (Fluorescência)

Triptofano em tampão Triptofano em etanol
Triptofano em tampão
Triptofano em etanol
(Fluorescência) Triptofano em tampão Triptofano em etanol λ = 350 nm λ = 295 nm 14

λ = 350 nm

Triptofano em tampão Triptofano em etanol λ = 350 nm λ = 295 nm 14 DQB-Licenciatura

λ = 295 nm

Triptofano - Emissão

Triptofano - Emissão Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol 50 000 000

Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol

50 000 000 40 000 000 30 000 000 20 000 000 10 000 000
50
000 000
40
000 000
30
000 000
20
000 000
10
000 000
0
310
330
350
370
390
410
430
450
Intensidade de Fluorescência

Comprimento de onda (nm)

Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol (Normalizado) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
310
330
350
370
390
410
430
450
Intensidade de Fluorescência
(normalizado)

Comprimento de onda (nm)

Trp. Em Tampãode Fluorescência (normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Etanol Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol

Trp. Em Etanol(normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Tampão Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol 15 DQB-Licenciatura

Trp. Em Tampão(normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol Trp. Em Etanol 15 DQB-Licenciatura

Trp. Em Etanol(normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol Trp. Em Tampão 15 DQB-Licenciatura

Triptofano - Excitação Espectro de Excitação do Triptofano em Tampão e em Etanol 200000000 100000000

Triptofano - Excitação

Espectro de Excitação do Triptofano em Tampão e em Etanol 200000000 100000000 0 Trp. Em
Espectro de Excitação do Triptofano em Tampão e em
Etanol
200000000
100000000
0
Trp. Em Tampão
250
260
270
280
290
300
310
320
-1E+08
Trp. Em Etanol
-2E+08
-3E+08
Comprimento de onda (nm)
Pico de
Intensidade de Fluorescência
Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol (Normalizado) 1 0 250 260 270 280
Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
1
0
250
260
270
280
290
300
310
320
-1
-2
-3
Comprimento de onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(normalizado)

Raman

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

Excitação VS Emissão do Triptofano Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol (Normalizado) 1

Excitação VS Emissão do Triptofano

Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol (Normalizado) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
310
330
350
370
390
410
430
450
Intensidade de Fluorescência
(normalizado)

Comprimento de onda (nm)

Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol (Normalizado) 1 0 250 260 270 280
Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
1
0
250
260
270
280
290
300
310
320
-1
-2
-3
Comprimento de onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(normalizado)

Trp. Em Tampãode onda (nm) Intensidade de Fluorescência (normalizado) Trp. Em Etanol Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol

Trp. Em EtanolIntensidade de Fluorescência (normalizado) Trp. Em Tampão Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol 17 DQB-Licenciatura em

Trp. Em Tampãode Fluorescência (normalizado) Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol Trp. Em Etanol 17 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Trp. Em Etanolde Fluorescência (normalizado) Trp. Em Tampão Trp. Em Etanol Trp. Em Tampão 17 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Procedimento (Fluorescência) Mioglobina comercial (nativa) Mioglobina em hidrocloreto de guanidina (desnaturada) λ =

Procedimento (Fluorescência)

Mioglobina comercial (nativa)
Mioglobina comercial (nativa)
Mioglobina em hidrocloreto de guanidina (desnaturada)
Mioglobina em hidrocloreto de
guanidina (desnaturada)
Mioglobina em hidrocloreto de guanidina (desnaturada) λ = 330 nm λ = 295 nm 18 DQB-Licenciatura

λ = 330 nm

Mioglobina em hidrocloreto de guanidina (desnaturada) λ = 330 nm λ = 295 nm 18 DQB-Licenciatura

λ = 295 nm

Mioglobina - Emissão Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) 50000000 40000000 30000000 20000000

Mioglobina - Emissão

Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)

50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 310 330 350 370 390 410 430 450 -10000000
50000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0
310
330
350
370
390
410
430
450
-10000000
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência

Mio DesnaturadaComprimento de Onda (nm) Intensidade de Fluorescência Mio Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e

Miode Onda (nm) Intensidade de Fluorescência Mio Desnaturada Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)

Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) – Normalizado 1 0,8 0,6 0,4 Mio
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
1
0,8
0,6
0,4
Mio Desnaturada
0,2
Mio
0
310
330
350
370
390
410
430
450
-0,2
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(Normalizada)
Mioglobina - Excitação Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada) 30 000 000 25

Mioglobina - Excitação

Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)

30 000 000 25 000 000 20 000 000 15 000 000 10 000 000
30
000 000
25
000 000
20
000 000
15
000 000
10
000 000
5 000 000
0
250
260
270
280
290
300
310
320
-5 000 000
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência

Mio Desnaturada000 Comprimento de Onda (nm) Intensidade de Fluorescência Mio Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e

Miode Onda (nm) Intensidade de Fluorescência Mio Desnaturada Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)

Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 -0,2 Comprimento
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
250
260
270
280
290
300
310
-0,2
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(Normalizada)

Mio Desnaturada310 -0,2 Comprimento de Onda (nm) Intensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio 20 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Miode Onda (nm) Intensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio Desnaturada 20 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Excitação VS Emissão Mioglobina Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) – Normalizado 1

Excitação VS Emissão Mioglobina

Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) – Normalizado 1 0,8 0,6 0,4 Mio
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
1
0,8
0,6
0,4
Mio Desnaturada
0,2
Mio
0
310
330
350
370
390
410
430
450
-0,2
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(Normalizada)

Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 -0,2 Comprimento
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
250
260
270
280
290
300
310
-0,2
Comprimento de Onda (nm)
Intensidade de Fluorescência
(Normalizada)

Mio Desnaturada310 -0,2 Comprimento de Onda (nm) Intensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio 21 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Miode Onda (nm) Intensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio Desnaturada 21 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Emissão Mioglobina VS Triptofano Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) – Normalizado 1

Emissão Mioglobina VS Triptofano

Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 310 330 350 370 390 410 430 450 -0,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
310
330
350
370
390
410
430
450
-0,2
Comprimento de Onda (nm)
tensidade de Fluorescência
(Normalizada)

Mio Desnaturadade Onda (nm) tensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e

Miotensidade de Fluorescência (Normalizada) Mio Desnaturada Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol

Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol

(Normalizado) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 320
(Normalizado)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
250
260
270
280
290
300
310
320
Intensidade de Fluorescência
(normalizado)

Comprimento de onda (nm)

Trp. Em TampãoIntensidade de Fluorescência (normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Etanol 22 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Trp. Em EtanolIntensidade de Fluorescência (normalizado) Comprimento de onda (nm) Trp. Em Tampão 22 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Procedimento (Intensidade de Fluorescência em função do pH) Soluções de mioglobina (pH 3 – 8)

Procedimento (Intensidade de

Fluorescência em função do pH)

Soluções de mioglobina (pH 3 – 8)
Soluções de mioglobina
(pH 3 – 8)
em função do pH) Soluções de mioglobina (pH 3 – 8) Medição da intensidade de fluorescência
Medição da intensidade de fluorescência λ em = 330 nm λ ext = 295 nm
Medição da intensidade de
fluorescência
λ em = 330 nm
λ ext = 295 nm
da intensidade de fluorescência λ em = 330 nm λ ext = 295 nm Medição do
Medição do pH
Medição do pH

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH Proteína: Mb comercial 24 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Proteína: Mb comercial

Intensidade de Fluorescência em função do pH Proteína: Mb comercial 24 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência em função do pH Proteína: Mb comercial 24 DQB-Licenciatura em Bioquímica

24

DQB-Licenciatura em Bioquímica

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH 25 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência em função do pH 25 DQB-Licenciatura em Bioquímica

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH Trp His 26 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Trp His
Trp
His

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH Trp His Gráfico fornecido pela PL 3, cuja solução
Trp His
Trp
His

Gráfico fornecido pela PL 3, cuja solução de Mb comercial foi filtrada.

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH Trp His Irace G, Balestrieri C, Parlato G, Servillo
Trp His
Trp
His

Irace G, Balestrieri C, Parlato G, Servillo L, Colonna G. Biochemistry. 1981; 792-799

Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Intensidade de Fluorescência em função do pH Espectro de emissão da Mb de coração de cavalo
Intensidade de Fluorescência em função do pH Espectro de emissão da Mb de coração de cavalo

Espectro de emissão da Mb de coração de cavalo a pH 7,2 (curva de baixo) e a pH 4,5 (curva de cima).

Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-19237

Conclusão

Conclusão Espectroscopia de Fluorescência vs FTIR espectros de excitação e de emissão das amostras Fluorescência

Espectroscopia de Fluorescência vs FTIR

espectros de excitação e de emissão das amostras Fluorescência intensidade de fluorescência da amostra
espectros de excitação e
de emissão das amostras
Fluorescência
intensidade de
fluorescência da amostra
espectro infravermelho da amostra FTIR estrutura secundária da proteína
espectro infravermelho da
amostra
FTIR
estrutura secundária da
proteína

Referências

Referências • Atkins PW, de Paula J. “ Physical Chemistry for the Life Sciences” . 2006.

Atkins PW, de Paula J. Physical Chemistry for the Life Sciences”. 2006.

Freeman/Oxford;

Jilie KONG et al.Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis

of Protein Secondary Structures. Institute of Biochemistry and Cell Biology,

SIBS, CAS. China, 2007;

Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-

19237;

Warren Gallagher. FTIR Analysis of Protein Structure”;

Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy.2006. 3rd edition.

Springer, NY.