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Instituto Superior Tcnico

Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

1 Semestre 2010/2011 2 Ano Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica

Upgrade dos apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular de Ins Amorim, baseado nas aulas tericas e laboratoriais de 2010, dos docentes Arsnio Fialho, Jorge Leito e Miguel Teixeira

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ndice
I. II. III. a. IV. V. VI. VII. a. b. c. d. i. ii. VIII. a. b. c. IX. X. XI. XII. a. i. ii. iii. XIII. a. b. c. XIV. XV. XVI. Evoluo Prebitica Evoluo Molecular .......................................................................................... 4 gua e pH........................................................................................................................................... 10 Aminocidos e Protenas ............................................................................................................... 13 Catlise Enzimtica ........................................................................................................................ 28 Glcidos ......................................................................................................................................... 34 Lpidos ................................................................................................................................................ 37 cidos Nucleicos ............................................................................................................................ 44 Metabolismo ................................................................................................................................. 48 Gliclise e Neoglucognese ........................................................................................................... 50 Ciclo de Krebs ................................................................................................................................ 53 Cadeia Respiratria ....................................................................................................................... 55 Outras vias metablicas ................................................................................................................ 59 Oxidao de cidos gordos ....................................................................................................... 59 Catabolismo proteico ................................................................................................................ 62 Fotossntese .................................................................................................................................. 62 Fase fotoqumica ........................................................................................................................... 65 Fase qumica .................................................................................................................................. 67 Variantes do processo ................................................................................................................... 68 Replicao do DNA ........................................................................................................................ 70 Reparao do DNA ............................................................................................................................. 75 Recombinao do DNA .................................................................................................................. 79 Transcrio de DNA ....................................................................................................................... 87 Regulao da Transcrio .............................................................................................................. 92 Opero da lactose ..................................................................................................................... 93 Opero do triptofano ................................................................................................................ 96 Regulao em eucariotas .......................................................................................................... 99 Processamento de RNA ............................................................................................................... 101 Processamento de tRNA .............................................................................................................. 101 Processamento de rRNA .............................................................................................................. 103 Processamento de mRNA ............................................................................................................ 104 Traduo de RNA ......................................................................................................................... 106 Ciclo Celular ................................................................................................................................. 111 Laboratrio Restrio de Plasmdeos ....................................................................................... 121

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A bioqumica estuda a estrutura e funo de biomolculas (compostos de carbono com uma grande variedade de ligaes qumicas e de grupos funcionais) e as reaces qumicas envolvidas nos processos biolgicos. Grupos Funcionais Nome do Grupo Funcional Hidroxilo Carbonilo Carboxilo Imino Estrutura Nome do Grupo Funcional Estrutura Amino Tiol Fosfato Pirofosfato

De todos os elementos qumicos, apenas uma pequena parte entra na composio das biomolculas. Os mais abundantes so H, O, C e N e existem vestgios de outros elementos como Na, Ca, K, P ou S. Em concentraes ainda mais reduzidas, mas desempenhando funes muito importantes, podemos encontrar Fe, Ni, Zn, I, Cu, etc. Quanto aos elementos que mais contribuem para a massa de um organismo, destacam-se O, C (mais abundante nos organismos que no resto do universo), H, N, P e S, que se ligam entre si por ligaes muito estveis, as ligaes covalentes. Os diferentes tomos e molculas reagem entre si e estabelecem diferentes ligaes e interaces: Covalentes tm origem na partilha de electres e so as ligaes mais fortes; No-covalentes Individualmente so mais fracas que as ligaes covalentes mas em conjunto tornam-se mais fortes e so essenciais para a estrutura e funo das macromolculas: Ligaes inicas um ou mais electres so transferidos de um tomo para o outro, mais electronegativo. Interaces de Van der Waals; Ligaes por pontes de hidrognio; Ligaes hidrofbicas. As biomolculas englobam 4 tipos de macromolculas: Lpidos; Protenas cujos monmeros so os aminocidos; Glcidos cujos monmeros so os monossacardeos; cidos Nucleicos cujos monmeros so os nucletidos. A formao destas macromolculas ocorre quando dois monmeros se juntam atravs de uma reaco de condensao (com libertao de uma molcula de gua, por exemplo). Todas estas molculas e macromolculas participam em reaces bioqumicas que apresentam uma srie de caractersticas: Do-se em ambiente aquoso (condies suaves); Esto associadas a variaes de energia. A sua forma mais vulgar de energia qumica o ATP (Adenosina TriFosfato);

Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Reaces bioqumicas diferentes localizam-se em diferentes partes da clula; Esto frequentemente organizadas em vias metablicas; So reguladas de acordo com a necessidade de controlar a quantidade e a actividade de enzimas do sistema.

I.

Evoluo Prebitica Evoluo Molecular

Com o arrefecimento da crusta terrestre tornou-se possvel a condensao da gua e a formao de massas de gua (sopas pr-biticas), onde se acumulavam vrias molculas. Como no havia proteco contra os raios ultra-violeta, estes alcanavam as massas de gua e, funcionando como fontes de energia (em conjunto com a energia geotrmica), criaram condies para o estabelecimento de novas ligaes qumicas entre as molculas j existentes. Deste modo surgiram molculas de origem biolgica, como cidos gordos, nucletidos, glucose, aminocidos, etc., molculas que conduziram ao aparecimento das primeiras formas de vida primitivas.

Em 1950 foi realizada uma experincia, a experincia de Urey-Miller, com o intuito de descobrir como ocorreram as primeiras reaces que originaram as macromolculas:

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Ilustrao 1 - Esquema da Experincia de Urey-Miller.

Com esta experincia foram verificados alguns factos: Glucose, ribose, desoxirribose e outros acares formaram-se a partir de CH2O quando este composto estava exposto radiao UV. A adenina, formada a partir de 5 HCN e radiao UV, foi provavelmente a primeira base a surgir. Formaram-se pptidos com mais de 50 aminocidos de comprimento. Os aminocidos e bases eram facilmente sintetizados a partir das molculas da atmosfera primitiva e num ambiente redutor, no ocorrendo a sua formao numa atmosfera neutra ou rica em oxignio. Apesar de ser impossvel recriar com exactido as condies da Terra primitiva, foi possvel verificar a sintetizao de macromolculas in vitro partindo de compostos inorgnicos. A glicina, um dos aminocidos mais abundantes produzidos na experincia Urey-Miller, sintetizada da seguinte forma:

Onde: CH2O formaldedo NH3 amonaco HCN cianeto de hidrognio

Ilustrao 2 - Frmula de Estrutura da Glicina.

NH2CH2COOH glicina NH2CH2CN ammonitrile

Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Apesar das experincias a seu favor, a teoria da sopa pr-bitica tem alguns pontos fracos como o facto de ser uma mistura diluda, j que nessas condies as molculas tm tendncia a separar-se e no a serem sintetizadas. Contudo, a evaporao da gua devido ao calor interno da Terra pode ter levado ao aumento da concentrao das substncias presentes nessa sopa, facilitado as reaces que levaram formao de molculas mais complexas. Produtos formados sob condies pr-biticas cidos carboxlicos Nucletidos e Bases Aminocidos Acares cido Frmico Adenina Glicina Pentoses cido Actico Guanina Alanina Hexoses cido Propanico Xantina cido -aminobutrico cidos Gordos (C4-C10) Hipoxantina Valina cido Gliclico Citosina Leucina cido Lctico Uracilo Isoleucina cido succnico Prolina cido arprtico cido glutmico Serina Treonina Pensa-se que a primeira molcula da vida a surgir ter sido o RNA pois este cido nucleico no necessita de enzimas ou primers para se replicar; pode, ele prprio, actuar como uma enzima; e, ainda nos dias de hoje, se encontram organismos cujo material gentico se restringe a molculas de RNA (ex. retro-vrus). Num primordial Mundo do RNA tero sido produzidas molculas de RNA com sequncias aleatrias. Alguns fragmentos ter-se-o auto-replicado, num processo catalisado por ribozimas segmentos do prprio RNA. Os segmentos seleccionados tero catalisado a sntese de pptidos especficos que, por sua vez, participaram na replicao do RNA. Deu-se ento um perodo de co-evoluo do RNA e protenas seguido da evoluo dos sistemas primitivos de traduo e do aparecimento no genoma de RNA. O papel cataltico e gentico deste genoma foi sendo separado ao longo do tempo, acabando o DNA por ser a fonte de material gentico e as protenas os principais agentes catalticos. Estes e muitos outros factores contriburam para a crescente complexidade do mundo prbitico e para a evoluo da vida.

Ilustrao 3 - RNA e a sua importncia na evoluo biolgica.

Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Desde o aparecimento das primeiras clulas at diversidade de organismos que se verifica nos dias de hoje deu-se uma grande evoluo. As primeiras clulas a surgir eram quimioheterotrficas e utilizavam como fonte de carbono e energia molculas sintetizadas por processos no biolgicos. A escassez de nutrientes favoreceu a evoluo de seres autotrficos capazes de sintetizar as suas prprias molculas orgnicas, primeiro a partir de compostos qumicos e, mais tarde, a partir da radiao solar. A evoluo de seres fotossintticos levou libertao de O2 para a atmosfera terrestre e, apesar de este gs ser txico para a maioria dos seres anaerbios (os nicos existentes at esta altura), o aumento da sua concentrao favoreceu a evoluo de seres aerbios. Estes seres apresentavam uma enorme vantagem em relao aos seres anaerbios quando competiam num ambiente rico em oxignio e, devido sua maior eficincia energtica, tinham ainda maior potencialidade de se desenvolverem para formas de vida mais complexas.

Relativamente organizao celular, as primeiras clulas tinham uma estrutura muito simples, sem ncleo individualizado, organitos celulares ou sistema endomembranar. Estas clulas procariticas foram sofrendo uma srie de alteraes at darem origem s clulas eucariticas, mais complexas e com um ncleo perfeitamente organizado e delimitado, diversos organitos celulares e sistema endomembranar.

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Comparao entre uma clula eucaritica e uma clula procaritica Escherichia coli Clula Animal ou Vegetal (Clula Procaritica) (Clula Eucaritica) Clula pequena e simples que cresce e se replica depressa. Pode adaptar-se Clula de grandes dimenses e muito complexa. rapidamente a alteraes do meio em que se encontra. Possui ncleo (onde se encontra a informao No possui um ncleo individualizado; o gentica), organelos membranados para assegurar ADN e outras molculas coexistem na variadas funes celulares, desde a digesto clula numa regio nucleide. No produo de energia e armazenamento de possui organelos membranados. nutrientes. Normalmente encontra-se sob forma Normalmente forma seres multicelulares. singular. Pode no precisar de oxignio para Precisa normalmente de oxignio para existir. existir. Existe ADN extra-cromossomal nas mitocndrias e Existe ADN extra-cromossomal sob nos cloroplastos. forma de plasmdeo. Diferencia-se em vrios tipos de clulas. Os ribossomas so do tipo 70S. Os ribossomas so do tipo 80S.

Ilustrao 4 - Clula de E. coli.

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Ilustrao 5 - Clula animal ( esquerda) e clula vegetal ( direita).

Esta evoluo das clulas procariticas para clulas eucariticas pode ser explicada pela teoria da endossimbiose. O modelo endossimbitico, desenvolvido por Lynn Margulis, defende que os seres eucariontes tero resultado da evoluo conjunta de vrios organismos procariontes, os quais foram estabelecendo associaes simbiticas entre si. Este modelo admite que os sistemas endomembranares e o ncleo resultaram de invaginaes da membrana plasmtica e que as mitocndrias e os cloroplastos, at h cerca de 2100 M.a., eram organismos autnomos. Nessa altura, algumas clulas de maiores dimenses (clulas hospedeiras) tero capturado clulas mais pequenas, como os ancestrais das mitocndrias e dos cloroplastos. Alguns destes ancestrais conseguiram sobreviver digesto no interior da clula procaritica de maiores dimenses, estabelecendo relaes de simbiose. A ntima cooperao entre estas clulas ter conduzido ao estabelecimento de
Ilustrao 6 Modelo endossimbitico.

Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular uma relao simbitica estvel e permanente que trouxe inmeras vantagens, desde uma maior capacidade de metabolismo aerbio (levado a cabo pelas mitocndrias) at a uma maior facilidade de obter nutrientes (produzidos pelo endossimbionte autotrfico). Alguns aspectos que suportam a teoria so os seguintes: As mitocndrias tm um ADN mitocondrial e dividem-se como algumas bactrias; Algumas protenas usadas na mitocndria so importadas do citoplasma e traduzidas a partir de mRNA produzidos a partir de genes nucleares; A mitocndria e a clula hospedeira apresentam uma relao simbitica; H mil milhes de anos, uma bactria aerbica sofreu endocitose por uma clula eucaritica anaerbica que, desde ento, a manteve para produzir energia. Existem evidncias em sequncias do ADN, membrana e comportamentos da mitocndria que so semelhantes aos encontrados em bactrias. A dada altura, organismos unicelulares comearam a agrupar-se e a organizar-se em colnias. As vantagens deste tipo de relaes acabaram por prevalecer e surgiram os primeiros seres multicelulares. Com o decorrer da evoluo deu-se a diferenciao celular e a especializao de grupos de clulas em determinadas funes. Hoje em dia, considera-se que todos os organismos vivos pertencem a um dos domnios/ramos da rvore da vida e que evoluram a partir de um ancestral comum. Os domnios baseiam-se no RNA Ribossomal.

Ilustrao 7 - rvore da vida.

II.

gua e pH

A gua a substncia qumica predominante nos organismos vivos, perfazendo cerca de 70% da sua massa. um ptimo solvente para a maioria das molculas polares e apresenta diversas caractersticas que fazem dela uma molcula nica. Entre as principais caractersticas da gua destacam-se: Molcula polar ligao entre tomos com electronegatividades diferentes (a partilha dos electres entre os tomos assimtrica); Forma pontes de hidrognio; Constante dielctrica elevada.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular As pontes de hidrognio ocorrem quando dois tomos muito electronegativos (oxignio, flor ou azoto, os elementos mais electronegativos, ou seja, com maior tendncia para captar um electro) competem pelo mesmo tomo de hidrognio, o doador dos electres que acabam por ser atrados principalmente pelos tomos electronegativos. Apesar de isoladamente cada ligao hidrognio no ser muito energtica (sendo, contudo, mais forte com um ngulo de ligao de 180), a uma escala macroscpica estas interaces tornam-se bastante relevantes. No estado slido, cada molcula de gua forma 4 ligaes hidrognio estveis com molculas vizinhas. Por outro lado, no estado lquido essas ligaes esto constantemente a formar-se e a ser quebradas, durando cerca de 1 ns. No entanto, em qualquer Ilustrao 8 - Estabelecimento de dos casos, a quebra das ligaes requer uma quantidade uma ponte de hidrognio entre considervel de energia, justificando o facto de os pontos de duas molculas de gua. fuso e ebulio da gua serem elevados. Assim, as pontes de hidrognio so fortes o suficiente para serem teis mas fracas o suficiente para serem quebradas e restabelecidas de forma reversvel. Como as molculas de gua formam pontes de hidrognio, a gua adquire propriedades nicas: Tenso Superficial mede a fora da superfcie da gua. A tenso superficial Coeso da gua elevada, de tal forma que permite a alguns insectos permanecer sua superfcie sem se afundarem. A adeso a atraco entre duas substncias diferentes. A gua estabelece Adeso pontes de hidrognio com outras superfcies, como o vidro, o solo, tecidos vegetais e algodo. Os seus pontos de fuso e ebulio so elevados devido formao de pontes de hidrognio, que mantm as molculas mais ligadas umas s outras e leva a que apenas com mais energia elas se desagreguem. Temperatura Tambm o seu calor especfico e calor latente de fuso e evaporao so elevados, o que implica fornecer maior quantidade de energia para que a gua mude de fase. A gua um bom solvente para molculas hidroflicas como algumas Solvncia molculas polares e sais, e mau solvente para molculas hidrofbicas como os cidos gordos. A Energia Livre de Gibbs Permite fazer uma previso acerca das concentraes e direco de uma reaco qumica; Traduz-se pela equao: , onde H a variao da entalpia, T a temperatura e S a variao da entropia; A reaco procede espontaneamente na direco em que foi escrita; A reaco requer energia para ocorrer.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A gua um bom solvente de molculas polares pois forma pontes de hidrognio com os mesmos e tambm dissolve sais atravs de interaces electrostticas. Neste ltimo caso, a gua rodeia os ies que compem o sal e diminui as interaces electrostticas entres eles, contrariando a sua tendncia para cristalizar e tornando-os solveis. Durante a sua dissoluo h um aumento da entropia e a energia livre de Gibbs negativa, o que significa que a dissoluo favorecida. Quando uma molcula apolar (os elementos que a constituem tm electronegatividades muito semelhantes) colocada em gua, a gua tenta dissolv-la, criando uma espcie de jaula em torno dessa molcula. Este processo desfavorvel pois a entropia das molculas de gua diminui. Contudo, a molcula apolar tende a agregar-se a outras
Ilustrao 9 - Dissoluo de um sal pela gua.

molculas iguais a si para diminuir a rea de contacto com a gua. Este o efeito hidrofbico.

Molculas anfiflicas (como cidos gordos), que contm simultaneamente grupos polares e grupos no-polares, tendem a dispor-se em aglomerados de modo a que as suas regies hidrofbicas no estejam em contacto com a gua, verificando-se assim a formao de micelas. Nas micelas, as molculas mantm-se juntas no porque existam interaces entre si mas porque essa configurao contribui para a estabilidade do sistema e para o aumento da sua entalpia. A formao deste tipo de estruturas constitui o princpio base da formao de membranas celulares.

Ilustrao 10 - Formao de micelas.

Uma outra propriedade caracterstica das molculas de gua a sua tendncia para sofrerem ionizao segundo a reaco:

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Produto Inico da gua pH Constante de dissociao de um cido Equao de Henderson-Hasselbach

A 25C, ,

O valor de pKa expressa a fora relativa de um cido: quanto mais baixo for o valor de pKa mais forte o cido. Este valor corresponde ao valor de pH do ponto mdio de uma curva de titulao, ou seja, ao ponto para o qual [HA]=[A-] (ponto isoelctrico). O pH do sangue ronda os 7.4 e pequenas variaes, como 0.2, so suficientes para provocar a morte de um indivduo. No entanto, o pH noutros locais do organismo pode ter valores muito diferentes (ex. pH do estmago pode variar entre 2.5 e 3.0) de acordo com as reaces que ocorrem nos diferentes rgos/tecidos. Apesar dos diferentes valores que se podem registar nos mais variados tecidos, necessrio que, em cada caso, o pH se mantenha constante, qualquer que seja o seu valor ideal, para que as reaces metablicas se dem correctamente. para isso muito importante a existncia de solues tampo. Alguns cidos ou bases e os seus conjugados podem ser utilizados como solues tampo na medida em que mantm o pH do meio relativamente constante face a pequenas variaes das concentraes de outros cidos/bases da soluo. cidos e bases fracas so os que melhor desempenham esta funo. O intervalo de pH em que as solues se comportam como tampo . Uma curva de titulao permite determinar o pKa de um cido fraco.

Ilustrao 11 - Curvas de Titulao.

III.

Aminocidos e Protenas

As Protenas so as molculas mais abundantes e mais versteis de todos os organismos vivos. Esto presentes em todos os locais das clulas e resultam da expresso de informao gentica. So formadas por polmeros de aminocidos ligados atravs de ligaes peptdicas,

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular surgem em dimenses variadas, como pequenos pptidos at grandes cadeias, e desempenham variadssimas funes, desde mediar reaces qumicas a transmitir impulsos nervosos e a controlar o crescimento e diferenciao celular. Tanto podem ser estruturais como participar num ciclo enzimtico, e podem ser reactivas ou meramente mediadoras. Entre os diferentes tipos de protenas conhecidas podem destacar-se: Enzimas (ex. amilase); Hormonas (ex. insulina); Protenas transportadoras (ex. hemoglobina); Protenas de armazenamento (ex. mioglobina); Protenas estruturais (ex. colagnio); Protenas protectoras (ex. anticorpos); Protenas contrcteis (ex. actina e miosina); Protenas Txicas. Apesar da sua grande diversidade, as protenas so formadas apenas por 20 tipos de aminocidos cuja natureza e sequncia condiciona a estrutura final da cadeia polipeptdica e, consequentemente, a funo da protena. Algumas das propriedades dos aminocidos que mais contribuem para a estrutura e funo das protenas so: Estereoqumica (disposio espacial das molculas); Hidrofobilidade e polaridade relativas; Propriedades das ligaes hidrognio; Propriedades de ionizao. Cada aminocido apresenta a estrutura representada na imagem direita. o grupo R que permite distinguir os aminocidos, dando-lhes propriedades diferentes. A glicina o nico aminocido cujo carbono central, o carbono-, possui duas ligaes iguais, pois o seu Ilustrao 12 - Estrutura de um aminocido. grupo R um hidrognio. Todos os outros aminocidos possuem um carbono- quiral, ou seja, um carbono com todas as 4 ligaes diferentes. A treonina e a isoleucina apresentam dois carbonos quirais e, portanto, podem apresentar 4 estereoismeros. Devido sua configurao tetradrica, dois aminocidos com a mesma constituio qumica podem apresentar imagens espelhadas, que representam uma classe de estereoismeros os enatefilos. De um modo simples, podemos classificar cada ismero em L (levo) ou D (dextro) conforme o seu grupo amina esteja orientado para a esquerda ou direita, Ilustrao 13 - Ismeros da Alanina. respectivamente, numa representao esquemtica do aminocido (esta classificao tem origem na comparao dos aminocidos com gliceraldedo, que tambm apresenta este tipo de ismeros).

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Peptidoglicanos, constituintes das paredes celulares de clulas bacterianas, so formados por D-aminocidos. No entanto, essa uma excepo pois, apesar de em laboratrio a sntese de aminocidos dar origem a molculas L e D, na maioria dos organismos vivos apenas se encontram L-aminocidos. Classificao dos aminocidos

Alanina Apolares

Glicina

Isoleucina

Leucina

Prolina Metionina Polares sem carga

Valina

Serina Asparagina Cistena Glutamina

Treonina

Bsicos

Histidina Arginina

Lisina

cidos

cido Asprtico

cido Glutmico

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Aromticos

Fenilalanina

Tirosina

Triptofano

Os aminocidos apolares so tendencialmente hidrofbicos; Os aminocidos polares sem carga so hidroflicos e possuem grupos R ionizveis; Os aminocidos bsicos ou positivamente carregados possuem um grupo R com carga positiva e comportam-se como bases; Os aminocidos cidos ou negativamente carregados possuem um grupo R com carga negativa e comportam-se como cidos; Os aminocidos aromticos apresentam anis no seu grupo R, so hidrofbicos e absorvem radiao UV, enquanto todos os outros aminocidos absorvem radiao IV. Os aminocidos a laranja tm de ser obtidos pela dieta visto que o corpo humano incapaz de os produzir. Os aminocidos tm grupos ionizveis (grupo amina, grupo carboxlico e, por vezes, tambm o grupo R), pelo que podem encontrar-se sob a forma de catio ou anio. Excepto para valores de pH extremos, coexistem vrias formas ionizveis de um aminocido, predominando uma delas, de acordo com a natureza cida ou bsica do meio. Em condies fisiolgicas, nomeadamente em meio aquoso, os aminocidos designam-se zwiteries porque se apresentam na forma de dipolos inicos, com ambos os grupos amina e carboxlico ionizados. Estes grupos comportam-se como cidos ou bases fracas, respectivamente, pelo que possvel representar uma curva de titulao de um aminocido. Em aminocidos com grupos R no ionizveis (aminocidos dibsicos) destacam-se dois pontos na curva de titulao que correspondem, cada um, ao pKa de um dos grupos amina ou carboxlico. pKa do grupo amina (NH3+) corresponde ao pH para o qual h 50% do aminocido na forma aninica e na forma de zwiterio, tendo um valor bsico. pKa do grupo carboxilo (COO-) corresponde ao pH para o qual h 50% do aminocido na forma de zwiterio e na forma catinica, tendo um valor cido.

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Ilustrao 14 - Titulao da Alanina, um aminocido dibsico.

Para aminocidos com grupos R ionizveis (aminocidos tribsicos) distingue-se um outro pKa, num local que varia conforme a natureza cida ou bsica do grupo. O ponto isoelctrico corresponde ao pH no qual predomina a forma de zwiterio do aminocido, ou seja, o aminocido no tem carga. Para um aminocido dibsico, o seu ponto isoelctrico calcula-se pela expresso: Onde: . Para um aminocido tribsico, o pI a Ilustrao 15 - Curva de Titulao para a Histidina, um mdia dos pKas de valor mais prximo, aminocido tribsico. correspondentes passagem de um estado neutro para negativo ou de um estado positivo para neutro. e

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Exemplo de um problema: Qual o pH de uma soluo de glicina em que o grupo NH3 est 1/3 dissociado? A equao Henderson-Hasselbalch apropriada :

Se o grupo NH3 est 1/3 dissociado, existe uma parte de glicina com carga negativa para duas partes de glicina neutra. O pKa a utilizar neste caso o do grupo amina (9.6). Tem-se ento:

A formao de pptidos d-se por reaco de polimerizao de condensao de aminocidos. A ligao peptdica forma-se entre o tomo de carbono do grupo carboxlico e o tomo de azoto do grupo amina, com eliminao de gua. As duas extremidades da cadeia assim formada so designadas por "terminal amino" e "terminal carboxlico" ou N-terminus e C-terminus. As ligaes peptdicas so ligaes covalentes muito estveis, com 40% de carcter duplo (tm comprimento de 0,133 nm, so mais curtas que uma ligao simples e mais longas que uma ligao dupla), e tm uma disposio espacial dos seus tomos bem definida. O carcter duplo parcial da ligao C-N inibe a rotao em torno da ligao peptdica e os quatro tomos O, C, N e H definem um plano, o plano peptdico. Uma cadeia polipeptdica pode ento ser considerada como um conjunto de planos que podem rodar em torno das ligaes N-C (ngulo ) ou C-C (ngulo ).
Ilustrao 16 - Reaco de condensao para formao de um pptido.

Ilustrao 17 - Pptido.

Os ngulos de diedro, e , no podem assumir valores arbitrrios pois certas configuraes da molcula so impossveis devido sobreposies de nuvens atmicas. Deste modo, estes

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular ngulos esto restritos a determinados valores que podem ser representados recorrendo a um grfico de Ramachandran:

Ilustrao 18 - Grfico de Ramachandran.

Os diagramas de Ramachandran indicam quais as combinaes dos ngulos de diedro possveis numa ligao peptdica e so semelhantes para todos os aminocidos. Pequenas variaes podem ocorrer devido complexidade dos grupos R envolvidos: as zonas favorveis tendem a diminuir quando a complexidade dos aminocidos aumenta. As ligaes peptdicas so maioritariamente trans, ou seja, os grupos laterais de aminocidos consecutivos esto de lados opostos. As configuraes cis, por norma, so mais desfavorveis energeticamente pelo que ocorrem numa razo de cerca de 1/1000 em relao s trans. A excepo est no aminocido prolina, em que as configuraes cis e trans tm a mesma energia a sua razo cis/trans 1/4. As ligaes cis conferem instabilidade s protenas, pelo que as clulas desenvolveram mecanismos capazes de reverter as configuraes das ligaes.

Ilustrao 19 - Configuraes trans e cis.

Os aminocidos ligam-se entre si em nmero variado, dando origem a cadeias de dimenses e constituio diversa. Pptidos ou Oligopptidos cadeias com 10 resduos, no mximo; Polipptidos apresentam geralmente entre 10 e 50 resduos; Protenas tm mais de 50 aminocidos e pesos moleculares elevados (expressam-se em Dalton 1Da=1uma). No entanto, a distino entre pptidos e protenas no se baseia unicamente na sua dimenso, mas sim nas respectivas funes biolgicas de cada molcula.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular As protenas apresentam 4 nveis de organizao estrutural: Estrutura primria Sequncia linear de aminocidos, determinada pela informao gentica a partir da qual a protena transcrita, que se mantm por ligaes covalentes (peptdicas). A sequncia de uma protena l-se a partir do terminal amina para o terminal carboxilo; Estrutura secundria Arranjo local dos aminocidos em cadeia hlices- e folhas- (60% das estruturas mais frequentes), loops, turns, etc., que se mantm por ligaes fracas (pontes de hidrognio e interaces Van der Waals) e se consegue atravs da variao dos ngulos e ; Estrutura terciria Arranjo 3D da molcula em soluo que se mantm por ligaes fracas (pontes de hidrognio e interaces Van der Waals); Estrutura quaternria Organizao da protena em subunidades que se mantm por ligaes fracas (pontes de hidrognio e interaces Van der Waals). Nem todas as protenas apresentam este tipo de estrutura.

Ilustrao 20 - Estruturas de uma protena.

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Hlice- Folhas- Turns Loops

Estruturas Secundrias Forma cilndrica com o esqueleto da cadeia linear em hlice e os grupos laterais em direco ao exterior. Forma-se quando o oxignio do grupo carboxlico forma uma ligao de hidrognio com o hidrognio do grupo amina de um aminocido quatro resduos a seguir, em direco ao terminal-C. Ao longo da hlice, todos os tomos de oxignio do grupo carboxlico estabelecem este tipo de ligao na mesma direco, o que confere direccionalidade a este arranjo peridico. ngulos caractersticos: A solubilidade desta estrutura fica determinada pela natureza das cadeias laterais porque os seus grupos polares j esto envolvidos em ligaes hidrognio. Cada espira da hlice representa, aproximadamente, 3.6 resduos de aminocidos e envolve 13 tomos 3.613 helix. Cada resduo estende-se por 1.5 , logo o passo da hlice (altura de cada volta) tem 5.4 . A hlice possui um momento dipolar bem definido: o terminal amina possui uma carga parcialmente positiva e o terminal carboxilo possui uma carga parcialmente negativa. Cadeias, de 5-8 resduos, agrupadas lado a lado, cujas folhas adjacentes se ligam por pontes de hidrognio. A natureza das ligaes estabelecidas leva as folhas a formarem planos e a terem uma conformao final pregueada. Tm uma direco definida pelo que folhas adjacentes podem progredir na mesma direco paralelas, ou em direces opostas anti-paralelas (menos estveis). Em ambas as situaes, cadeias laterais R dispem-se para um e outro lado da folha. Nas zonas de ligao, que fazem a continuao de uma folha para a outra, podem existir turns e loops. Pequenas estruturas em forma de U, formadas por 3 ou 4 aminocidos, que redireccionam o esqueleto da cadeia para o seu interior, revertendo a sua direco, e permitem que as protenas se tornem estruturas compactas. Em cada turn estabelece-se apenas uma ligao hidrognio entre o oxignio do grupo carboxlico do primeiro resduo e o hidrognio do grupo amina do quarto aminocido. -turns so das estruturas mais comuns e fazem a ligao entre cadeias anti-paralelas de folhas-. Muitas vezes contm resduos de glicina ou prolina e formam-se preferencialmente superfcie da protena, de modo a que os grupos que no esto envolvidos na ligao hidrognio possam interagir com a gua. Fazem a ligao entre vrios elementos da estrutura secundria das protenas (ex. ligam folhas- paralelas). Podem ocorrer em vrias formas e tamanhos. No entanto, tambm se localizam superfcie das protenas e, por isso, podem desempenhar um papel importante no reconhecimento de processos biolgicos (por exemplo, os antignios podem diferenciam-se entre si pelos loops que ligam as suas folhas-). Devido sua estrutura no organizada, uma mutao que ocorra numa zona associada a um loop tem tendncia a ser menos grave do que se ocorresse numa folha ou numa hlice pois no implica a destruio da estrutura proteica e, consequentemente, a perda de funo.

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Ilustrao 21 - Estrutura Secundria - Hlice-.

Ilustrao 22 - Estrutura Secundria - Folhas-.

Ilustrao 23 - Estrutura Secundria - Turns.

As cadeias polipeptdicas podem ainda apresentar sequncias com estrutura no tipificada, chamas sequncias random. Apesar do nome, estas sequncias so bem definidas para cada protena e mantm-se mesmo aps renaturao, no encaixando, contudo, em nenhuma das tipologias anteriores.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A funo das protenas est relacionada com a sua configurao tri-dimensional e esta configurao, por sua vez, especificada pela sequncia de aminocidos pelo que a natureza dos vrios resduos favorece a adopo de diferentes tipos de estrutura secundria. Por exemplo, o cido glutmico, a alanina e leucina do sobretudo origem a hlices-; a valina e a isoleucina originam folhas-; e a prolina, a glicina e a asparagina esto muitas vezes associadas a turns. Aos diferentes tipos de estruturas secundrias esto associados ngulos e diferentes, pelo que Ilustrao 24 - Diagrama de Ramachandran. a cada tipo corresponde uma zona especfica de um diagrama de Ramachandran. A adopo de estruturas secundrias por parte das protenas traz vantagens: Permite uma compactao da estrutura, o que tende a minimizar o contacto das cadeias laterais hidrofbicas com a gua; As ligaes por pontes de hidrognio entre os grupos polares CO e NH das cadeias principais (ligaes essas que estabilizam as estruturas) compensam a energia gasta para as desviar das interaces com a gua. Destacam-se ainda 3 aminocidos com caractersticas especiais: Prolina o seu grupo amina no livre, encontrando-se ligado ao radical, o que lhe confere grande rigidez; introduz quebras nas hlices e nas folhas; Glicina Pode ser encontrada em qualquer lugar do diagrama de Ramachandran e, nas protenas, muitas vezes encontrada em regies flexveis; Cistena forma pontes de dissulfureto.
Ilustrao 25 - Pontes de dissulfureto estabelecidas entre cistenas.

A estrutura terciria das protenas referese ao arranjo tridimensional dos resduos de aminocidos e tem uma importncia fundamental para a actividade biolgica das protenas. Por exemplo, resduos de aminocidos muito distantes na cadeia linear podem aproximar-se devido a enrolamentos e formar regies indispensveis ao funcionamento da protena, como o centro activo das enzimas.
Ilustrao 26 - Estrutura terciria da Ribonuclease.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Enquanto os elementos da estrutura secundria so estabilizados por ligaes hidrognio, a estrutura terciria influenciada essencialmente pela natureza dos grupos R dos aminocidos e depende de diversos tipos de ligaes: inicas, electrostticas, pontes de hidrognio, ligaes hidrofbicas e covalentes. Podem ainda estabelecer-se ligaes difusas que ajudam a estabilizar a estrutura da protena atravs de pontes cruzadas (crosslinks). As pontes mais comuns so as pontes dissulfureto, formadas pela ligao S-S entre duas cistenas aminocido cistena aps a oxidao do seu grupo HS, e que ocorrem maioritariamente em meio extracelular. A estabilizao da estrutura final leva dobra de elementos da estrutura secundria e, como maioritariamente devida a foras de interaco fracas, est em constante alterao (mantendo, no entanto, uma conformao base), o que tem consequncias importantes para a sua funo. Por fim, a estrutura quaternria no est presente em todas as protenas. Tambm influenciada pelos grupos R, no linear e tem origem na associao entre vrias cadeias polipeptdicas, idnticas ou diferentes, atravs de ligaes no covalentes. Permite o aumento da estabilidade da protena pela reduo da relao superfcie/volume, contribui para a economia e eficincia energtica e favorece a cooperatividade e a aproximao de centro catalticos eficaz nas vias metablicas/catalticas. A desnaturao de uma protena resultado da alterao (perda) das suas estruturas secundria, terciria e quaternria, mas no da sua estrutura primria pois as ligaes peptdicas s so afectadas em condies extremas. A desnaturao leva perda de funo da protena e pode ser devida a agentes qumicos, como o pH, ou fsicos, como a temperatura. Quando so repostas as condies fisiolgicas a protena adquire a sua conformao funcional ocorre renaturao. Nalguns casos, nomeadamente quando a estrutura primria alterada, a protena no capaz de recuperar a sua funo. Em 1953 Frederick Sanger sequenciou as duas cadeias proteicas da insulina (protena com 51 resduos composta por dois polipptidos ligados por pontes de dissulfureto) atravs de um processo de identificao do terminal amina de uma cadeia. Os resultados de Sanger estabeleceram que todas as molculas de uma determinada protena tm a mesma sequncia de aminocidos. As protenas podem ser sequenciadas de duas maneiras: Sequenciao real da cadeia polipeptdica; Sequenciao do DNA do gene correspondente. Tambm o processo de Edman permite sequenciar uma protena: Ocorre uma reaco do terminal amina com fanil-isotiocianato; A protena modificada submetida a hidrlise cida e liberta o terminal amina modificado, que identificado por cromatografia; Segue-se novo ciclo de reaco com o prximo aminocido da protena, que se tornou no terminal amina. Deste modo os aminocidos vo sendo sucessivamente (e ordenadamente) individualizados, o que permite determinar a sequncia completa de uma protena.

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Purificao e Anlise proteica

Ilustrao 27 - Separao de protenas com base na sua massa.

A separao das protenas pode basear-se em propriedades fsicas ou qumicas: Solubilidade; Foras interactivas; Hidrofobicidade dos resduos; Carga dos aminocidos; Ponto isoelctrico; Tamanho e forma. A cromatografia um processo utilizado para separar componentes, podendo separar as vrias protenas de uma amostra.

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Ilustrao 29 - Cromatografia de excluso por peso molecular: as protenas so separadas pelo tamanho. Tambm se chama filtrao gel. O gel possui poros de determinados tamanhos; as molculas de maiores dimenses no entram nos poros e migram mais rapidamente; as molculas pequenas entram nos poros e demoram mais tempo a migrar ao longo do gel. Ilustrao 28 - Cromatografia de troca inica.

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Ilustrao 30 - Cromatografia por afinidade: as protenas com afinidade com o gel do tubo ficam ligadas ao mesmo, enquanto que as protenas sem afinidade saem do tubo.

Na primeira experincia realizada a bioqumica utilizouse a tcnica da electroforese em gel de SDSPoliacrilamida para separar protenas. O SDS um detergente que cobre as protenas de carga negativa e confere uma taxa carga/massa similar a todas as protenas a que se liga. O SDS tambm contribui para desnaturar as protenas.
Ilustrao 31 - Aco do SDS sobre uma protena.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Outra tcnica de separao de protenas combina dois mtodos de separao: primeiro as protenas so separadas segundo o seu ponto isoelctrico num gel com um pH decrescente; depois o gel colocado num poo medida feito num gel de SDS-Poliacrilamida para se dar a electroforese e separar as protenas por pesos moleculares.

Ilustrao 32 - Separao de protenas pela combinao de dois mtodos: ponto isoelctrico e electroforese.

a. Catlise Enzimtica
As enzimas, uma classe particular de protenas, so catalisadores bioqumicos cuja funo baixar a energia de activao necessria a uma dada reaco e permitir que esta decorra a uma velocidade muito mais elevada. Em condies biologicamente favorveis, muitas reaces comuns em bioqumica no so favorveis e s ocorrem devido interveno de enzimas. Entre as caractersticas das enzimas possvel destacar: So todas de natureza proteica, embora possam conter uma parte no proteica o
Ilustrao 33 - Aco cataltica.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular cofactor; Baixam a energia do estado transiente, diminuindo a energia de activao necessria a uma reaco aceleram a sua velocidade (velocidade at 1016x superior!); No modificam a constante de equilbrio K; Encontram-se intactas no final da reaco; Tm elevada especificidade; A sua actividade pode ser sujeita a controlo. De acordo com o tipo de reaco que catalisam, as enzimas classificam-se da seguinte forma: Subclasses N Classe Tipo de Reaco catalisada importantes Dehidrogenases; Oxidases; Transferncia de electres (ies hidratados Peroxidases; 1 Oxidorredutases ou tomos H) Reductases; Monooxigenases; Dioxigenases. C1 Transferases; Glicosiltransferases; 2 Transferases Transferncia de grupos Aminotransferases; Fosfotransferases. Esterases; Hidrlises (transferncia de grupos Glicosidases; 3 Hidrolases funcionais para a gua) Peptidases; Amidases. C-C liases; Adio de grupos para formar ligaes C-O liases; 4 Liases duplas ou formao de ligaes duplas para C-N liases; remoo de grupos C-S liases. Epimerases; Transferncia de grupos entre uma mesma Cis trans isomerases; 5 Isomerases molcula para formar ismeros Transferases intramoleculares. C-C ligases; Formao de ligaes C-C, C-S, C-O ou C-N C-O ligases; 6 Ligases por reaces de condensao acopladas a C-N ligases; clivagem de ATP C-S ligases. As enzimas so divididas em classes, subclasses, sub-subclasses e nmeros de srie. Na sua nomenclatura internacional (EC) indicam-se 4 nmeros que correspondem, respectivamente, a cada uma das subdivises mencionadas. Ex: Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) As enzimas podem ter especificidade para um determinado tipo de substrato e/ou de ligao, apresentando diversos nveis de especificidade. A especificidade controlada pela estrutura um encaixe nico do substrato com a enzima assegura a selectividade. s enzimas pouco especficas costuma dar-se o nome de enzimas promscuas. Em qualquer enzima, o substrato liga-se ao centro activo onde a reaco catalisada. O centro activo, constitudo pelo conjunto de aminocidos que entram em contacto com o substrato, compreende o local de fixao, que se combina com o substrato por ligaes fracas, e o centro cataltico, que actua sobre o substrato levando-o a sofrer a reaco qumica.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A interaco enzima-substrato pode dar-se segundo dois modelos: Chave-fechadura: sistema rgido, a configurao da enzima no alterada aquando da ligao do substrato; Induced-fit: a enzima e o substrato alteram a sua conformao aps a ligao. A ligao entre a enzima e o substracto pode estabelecer-se devido a interaces hidrofbicas ou inicas, por exemplo.

Ilustrao 34 - Modelos da interaco enzima-substrato.

Um grande nmero de enzimas necessita, para a sua aco cataltica, de um cofactor ou de uma coenzima que promova a reaco. Os cofactores so elementos qumicos, como ies metlicos ou grupos prostticos (grupos orgnicos de natureza no proteica), e as coenzimas so molculas, orgnicas ou metaloorgnicas, mais complexas e de natureza no proteica. A reaco entre uma enzima (E) e um substrato (S) de modo a dar um produto (P) pode ser representada por:

(Numa fase inicial, assume-se que a reaco inversa formao do produto P negligencivel porque se verifica [P]~0 ). Cintica enzimtica Michaelis-Menten Concentrao total de enzima Taxa de formao de [ES] Taxa de desaparecimento de [ES] Como se assume , ento Assim, Constante de Michaelis Assim, Velocidade da reaco Ento tem-se Quando [S] suficiente para saturar a enzima, a velocidade da reaco mxima. Em saturao, [ES]=[ET]

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Equao Michaelis-Menten Turnover number ndice de eficincia cataltica

Quando:

Ilustrao 35 - Cintica de Michaelis-Menten.

A equao de Michaelis-Menten assume algumas condies: Formao de um complexo ES enzima substrato; Equilbrio rpido entre o complexo ES e a enzima livre; A dissociao de ES em E+P mais lenta que a formao do complexo ES a partir de E+S e que a reaco inversa, a dissociao de ES para voltar a dar E+S. Vmax uma constante e representa um valor terico pois nunca alcanada na realidade implicaria que todas as enzimas estivessem ligadas ao substrato. Km, constante de Michaelis, a constante de equilbrio para a dissociao do complexo E-S; definida como a concentrao de substrato quando a velocidade de reaco metade da velocidade mxima; caracterstica de cada enzima e no depende da concentrao do substrato; uma medida da afinidade da enzima em relao ao seu substrato, sendo 1/Kmo valor dessa medida. Deste modo, quanto menor for o valor de Km maior a afinidade enzima-substrato e menor a quantidade de substrato necessria para atingir metade da velocidade mxima. O turnover number, que se representa por Kcat, uma medida da actividade cataltica mxima de uma enzima. O Kcat definido como o nmero de molculas de substrato que so convertidas em produto por molcula de enzima e unidade de tempo quando a enzima est saturada de substrato.

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Ilustrao 36 - Curva de Michaelis para diferentes concentraes de substrato e para diferentes enzimas.

A interpretao da cintica enzimtica de Michaelis no estabelece uma relao linear entre as grandezas em estudo. Na cintica de Lineweaver-Burk representam-se as variveis 1/v e 1/[S], em vez de v e [S], obtendo-se uma relao linear mais fcil de interpretar. Equao linear de Lineweaver-Burk:

A velocidade das reaces afectada por uma srie de factores, tais como a temperatura e o pH do meio, ou a presena de activadores ou inibidores. A actividade enzimtica tende a aumentar com a elevao da temperatura de forma exponencial, at que se atinge um determinado valor de T a que a enzima desnatura. A relao da velocidade com o pH um pouco mais complexa, na medida que o pH do meio influencia vrios aspectos das enzimas, desde o seu estado de ionizao ionizao dos aminocidos do centro activo e, em casos extremos, desnaturao. Cada enzima tem assim uma gama de valores de T e pH para os quais a sua actividade optimizada.
Ilustrao 37 - Equao de Lineweaver-Burk.

Ilustrao 38 - Variao da actividade enzimtica com a temperatura e com o pH.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A regulao alostrica, alterao da conformao proteica e das propriedades de um dos locais de ligao (pode ser o centro activo) de uma enzima pela associao de uma molcula ligante a outro local de ligao da mesma enzima (sem ser o centro activo), inclui mecanismos tanto de activao como de inibio enzimtica e muito importante pois intervm no controlo das sequncias centrais do metabolismo. Inibidores so compostos que, ligando-se a uma enzima, reduzem a sua actividade e a velocidade da reaco catalisada. Os chamados inibidores reversveis no provocam alteraes irreversveis nas enzimas em que actuam. Existem diversos tipos de inibidores que provocam a diminuio da velocidade da reaco actuando de modo diferente sobre a enzima: Inibidores competitivos so quimicamente semelhantes ao substrato e ligam-se ao centro activo das enzimas impedindo a ligao enzima-substrato. Tm semelhanas estruturais com o substrato para se conseguirem
Ilustrao 39 - Cintica alostrica de uma enzima.

associar mas no reagem com a Ilustrao 40 - Inibio competitiva. enzima e, portanto, no do origem a nenhum produto. Uma inibio deste tipo diminui medida que se aumenta a concentrao de substrato para concentraes mais elevadas mais provvel que a enzima se ligue ao substrato que ao inibidor, mantendo-se assim o valor de vmax. Apenas Km alterado, verificando-se o seu aumento;

Ilustrao 41 - Inibio competitiva.

Inibidores no competitivos ligam-se a locais da enzima que no o seu centro activo antes ou depois da formao do complexo ES, pelo que podem formar-se trs tipos de complexos: ES, ESI (enzimasubstrato-inibidor) ou EI. Como continuam a permitir a ligao do substrato o valor de Km mantm-se inalterado. No entanto, como apenas o complexo ES funcional verifica-se a diminuio de vmax;
Ilustrao 42 - Inibio no competitiva.

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Ilustrao 43 - Inibio no competitiva.

Inibidores anti-competitivos ligam-se a locais da enzima que no o seu centro activo apenas aps a formao do complexo ES. H a formao de dois complexos, ES e ESI, sendo o complexo ES o nico com actividade cataltica. Como o inibidor apenas se liga ao complexo ES, medida que a concentrao de substrato aumenta a inibio mais acentuada. Verifica-se a diminuio do Km e de vmax na mesma proporo.
Ilustrao 44 - Inibio anti-competitiva.

Ilustrao 45 - Inibio anti-competitiva.

IV.

Glcidos

Glcidos, glcidos ou hidratos de carbono, as molculas mais abundantes na Terra, so compostos de carbono, oxignio e hidrognio [(CH2O)n], e podem conter outros elementos como azoto e enxofre. Desempenham diversas funes, desde energticas (glucose e sacarose) a funes de armazenamento ou estrutural. Classificam-se em: Monossacardeos so os monmeros dos glcidos, como a frutose, glucose e galactose; Dissacardeos so compostos por dois monmeros, sendo, portanto, dmeros, tais como a sacarose, a maltose e a lactose; Oligossacardeos so compostos por 3 a 10 monmeros;

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Polissacardeos so compostos por mais de 10 monmeros, dividindo-se ainda em: Polissacardeos de armazenamento como o amido e o glicognio, que so polmeros de reserva energtica nas clulas vegetais e animais, respectivamente; Polissacardeos estruturais como a celulose e a quitina, que so constituintes da parede celular de clulas vegetais e fungos, respectivamente.

Ilustrao 46 - Exemplos de glcidos em ambiente celular.

Alguns glcidos apresentam grupos aldedo (H-C=O) ou cetona (C=O). Se o grupo carbonilo (C=O) se localizar no final da cadeia carbonada (inclusive num grupo aldedo), ento o glcido uma aldose. Caso contrrio, uma cetose. Os hidratos de carbono tm estereoismeros cuja classificao (comparao com gliceraldedo) segundo uma representao no plano se baseia na posio do grupo OH do carbono mais afastado do grupo aldedo ou cetona: D - lado direito; L - lado esquerdo. Ao contrrio do que acontece nos aminocidos, em que a forma mais comum L-aminocido, no caso dos glcidos, estes apresentam-se maioritariamente sob a forma D.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Pentoses e hexoses (glcidos com 5 e 6 carbonos, respectivamente) tm tendncia a assumir uma forma cclica, principalmente quando se encontram em meio aquoso. No processo de ciclizao h eliminao de uma molcula de gua quando o grupo carbonilo reage com um grupo OH distante e o glcido passa a formar um anel, designado de hemiacetal. Tambm nestes casos se verifica a existncia de ismeros, desta Ilustrao 47 - Aldose e cetose. vez relacionados com a posio do grupo OH correspondente ao carbono-1: se este se localizar abaixo do anel tem a designao , caso se localize acima do anel designa-se . Alm dos glcidos constitudos unicamente por monmeros existem tambm derivados de acares: lcoois no possuem o aldedo ou a cetona. Ex.: D-ribitol; cidos o aldedo ou mesmo o grupo OH so oxidados para um grupo carboxilo. Ex.: cido glucnico e cido glicurnico; Amino acares o grupo amina substitui um grupo OH. Esse grupo amina pode tambm ser acetilado. Ex.: glucosamina e N acetylglucosamine. A formao de polissacardeos d-se pelo estabelecimento de ligaes glicosdicas. Estas Ilustrao 48 - Ciclizao de glcidos. A forma ciclizada mais comum a piranose (anel com reaces de condensao resultam numa ligao 5 carbonos e 1 oxignio), ocorrendo tambm covalente e na libertao de uma molcula de gua e furanose (anel com 4 carbonos e 1 oxignio). tm liberdade de rotao. De acordo com o nmero de carbonos implicados na ligao e da configurao ou de cada monmero, as ligaes tm diferentes classificaes. Cada monmero pode estabelecer vrias ligaes glicosdicas em simultneo.

Ilustrao 49 - Exemplos de ligaes glicosdicas.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Tal como as protenas apresentam uma estrutura tridimensional, tambm os glcidos podem adquirir essa mesma estrutura, consoante os tomos entre os quais a ligao glicosdica estabelecida. (1 4) Zig-zag ribbon like (1 3) & (1 4) U-turn hollow helix (1 2) Twisted crumpled (1 6) Sem uma conformao ordenada Os polissacardeos podem ser classificados de acordo com o tipo de monmeros e com o tipo de cadeia que formam: Homopolissacardeos Heteropolissacardeos Constitudos por apenas um tipo de Constitudos por diversos tipos de monmeros monmeros NoNoRamificados Ramificados ramificados ramificados Cadeia ramificada; alguns Cadeia ramificada; alguns Cadeia Cadeia monmeros estabelecem monmeros estabelecem simples simples mais do que uma ligao mais do que uma ligao

Para alm de ligaes glicosdicas os glcidos podem estabelecer outros tipos de ligaes. Por exemplo, podem estabelecer-se pontes de hidrognio entre monmeros adjacentes como acontece na celulose (glcido que o organismo humano no consegue digerir sem o auxlio de outros organismos) e os peptidoglicanos (encontrados na parede celular de procariontes) formam cadeias ligadas entre si por aminocidos (L e D).

V.

Lpidos

Lpidos so compostos de carbono e hidrognio (cadeias alifticas, formadas por CH2), geralmente com mais de 8 carbonos, caracterizados por uma baixa solubilidade em gua e elevada solubilidade em solventes no-polares (como o benzeno e o clorofrmio). Desempenham funes variadas destacando-se os papis de reserva energtica (armazenam cerca de 38 KJ/mol contra os 17 KJ/mol das protenas e glcidos), precursores hormonais, constituintes das membranas biolgicas, cofactores, etc. A sua composio qumica variada e dividem-se em vrias classes, entre as quais se destacam os cidos gordos e os fosfolpidos.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Os cidos gordos so cidos carboxlicos (tm um grupo COOH) com cadeias de hidrocarbonetos formadas por um nmero variado de carbonos (entre 4 e 36). Raramente ocorrem livres na natureza e podem ser considerados como a unidade fundamental da classe dos lpidos. O grupo carboxlico, que tem um pKa entre 4-5, encontra-se ionizado em condies fisiolgicas e constitui a extremidade polar do cido gordo. A cadeia hidrocarbonada apolar e as ligaes covalentes entre os tomos de carbono so maioritariamente simples, mas tambm podem apresentar carcter duplo. Se todas ligaes C-C forem simples, o cido gordo diz-se saturado. Caso existam ligaes duplas, ento o cido gordo insaturado monoinsaturado se tiver apenas uma ligao dupla ou polinsaturado se estas forem em maior nmero. O nvel de saturao dos cidos gordos est relacionado com o seu ponto de fuso. Regra geral, quanto mais insaturado o lpido for menor ser a sua temperatura de fuso.
Ilustrao 50 - cido Gordo.

Na nomenclatura dos cidos gordos indica-se o nmero de tomos de carbono da cadeia hidrocarbonada e o n de ligaes duplas, separados por :. Em ndice superior e antecedido do smbolo , indica-se a posio das ligaes duplas. Assume-se que essas ligaes so cis, excepto se especificado em contrrio, e numeram-se os carbonos a partir do grupo carboxilco. Ex: C 18:3 9,12,15. Todos os cidos gordos sintetizados pelo organismo humano so do tipo cis, ou seja, nas suas ligaes duplas C=C os tomos de hidrognio ligados aos tomos de carbono encontram-se orientados para o mesmo lado. Esta insaturao em cis altera a conformao das caudas carbonadas deixam de ser lineares e passam a estar dobradas, formando-se um ngulo de ~30 na zona da ligao dupla. Este facto muito importante quando os cidos gordos se encontram em membranas ou agregados pois confere flexibilidade s estruturas. cidos gordos insaturados em trans so produzidos por algumas bactrias presentes no sistema digestivo dos ruminantes e so obtidos pelos humanos atravs do consumo de produtos lcteos, carne animal ou pelo consumo de produtos que sofreram hidrogenao. A natureza da ligao trans no altera a conformao das caudas carbonadas do mesmo modo que a ligao cis (no altera muito significativamente a linearidade da cadeia de carbonos) e est associada ao aumento dos nveis de LDL (mau colesterol) e diminuio de HDL (bom colesterol), pelo que recomendvel a sua ingesto moderada.

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Ilustrao 51 - cidos gordos insaturados.

A partir de cidos gordos podem formar-se diferentes tipos de lpidos, sendo os triglicridos dos mais simples. Os triglicridos constituem uma grande fonte de reserva energtica (encontram-se armazenados nas clulas adiposas) e so formados a partir de uma molcula de glicerol associada a trs cidos gordos. Se esses cidos gordos forem iguais o triglicrido diz-se simples. A hidrlise de um triglicrido/diglicrido uma forma de obter energia metablica. A reaco de degradao leva formao de um diglicrido/monoglicrido e libertao de um cido gordo, energia e uma molcula de gua. Posteriormente o cido gordo pode ser degradado fornecendo grandes quantidades de energia.

Ilustrao 52 - Formao de um triglicrido.

Os fosfolpidos pertencem a uma outra classe de lpidos. Estas molculas so os principais constituintes das membranas biolgicas e apresentam duas zonas com polaridade distintas so molculas anfipticas, ou anfiflicas. Tm uma cabea polar hidroflica formada por um grupo fosfato ligado a uma molcula de glicerol e, por vezes, a um outro grupo varivel. Ao glicerol ligam-se dois cidos gordos, que podem ser diferentes entre si, e que constituem a cauda apolar hidrofbica. Ilustrao 53 - Fosfolpido. Quando se encontram em meio aquoso estas molculas tendem a associar-se de modo a que as regies polares estejam em contacto com a gua e as regies apolares no. Os agregados que se formam s so estveis em ambiente aquoso e,

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular dependendo do tipo de lpidos, podem originar micelas estruturas esfricas constitudas por cidos gordos (com forma mais cnica), ou lipossomas bicamadas de forma cilndrica formadas por fosfolpidos (com forma mais cilndrica). Este princpio est na base da formao das membranas biolgicas.

Ilustrao 54 - Micelas, lipossomas e bicamadas fosfolipdicas.

As membranas biolgicas so compostas por lpidos, maioritariamente fosfolpidos, glicolpidos, colesterol, e protenas, que conferem especificidade. As funes das membranas so: Individualizao das clulas; Compartimentalizao celular; Criao de uma barreira selectiva; Localizao de sistemas enzimticos (metabolismo energtico); Localizao de sistemas de transporte (transporte de molculas para o interior e manuteno da concentrao inica); Localizao de sistemas de reconhecimento especfico (hormonas, antignios, etc). As membranas so uma bicamada fosfolipdica assimtrica intercalada por outras molculas, tanto de natureza lipdica (colesterol) como de natureza proteica (protenas transportadoras). Os fosfolpidos tm liberdade para sofrer rotaes, movimentos laterais e, por vezes, at trocas entre camadas.
Ilustrao 55 - Movimentos laterais e flip-flop que ocorrem numa membrana fosfolipdida.

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A fluidez das membranas afectada pelo nvel de saturao das cadeias carbonadas (quanto mais insaturadas forem maior ser a fluidez) e pela presena de colesterol. Se as membranas fossem constitudas por cadeias saturadas verificar-se-ia uma cristalizao das mesmas a temperaturas mais baixas, ou seja, haveria uma grande tendncia das cadeias para se empacotarem de forma extremamente ordenada e as interaces intermoleculares seriam fortes, o que diminuiria a fluidez da membrana. Com as ligaes duplas cis ao longo da cadeia de carbonos, esta deixa de ser linear e no se arruma to perfeitamente como na situao anterior, o que permite diminuir a temperatura de transio de fase e aumentar a fluidez da membrana.

Ilustrao 56 - 4 Dos fosfolpidos mais abundantes nas membranas celulares dos mamferos.

superfcie das membranas destacam-se zonas mais densas, as jangadas lipdicas, que so mais ricas em colesterol e cidos gordos saturados. Estas jangadas so menos fluidas que as zonas adjacentes e so ricas em protenas com determinadas funes. So bem definidas mas podem deslocar-se ao longo da membrana. O colesterol um tipo de lpido formado por um conjunto rgido de anis associado a uma pequena cadeia carbonada. maioritariamente hidrofbico mas apresenta um grupo hidrxido OH polar, pelo que uma molcula anfiptica. produzido apenas por animais (no fgado), intercala-se nas membranas plasmticas (pode formar pontes de hidrognio com os fosfolpidos adjacentes) regulando a sua fluidez (diminuindo-a, neste caso), e um precursor de hormonas como a testosterona e o estrognio.

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Ilustrao 57 - Colesterol.

As protenas que ocorrem numa membrana tm vrias funes. Podem ser: Intrnsecas atravessam a membrana por completo, tm uma conformao de hlice onde os grupos hidrofbicos dos aminocidos so projectados para o exterior da hlice, para contactarem com as caudas hidrofbicas dos fosfolpidos, enquanto os grupos hidroflicos formam pontes de hidrognio entre si no interior da hlice. Perifricas
Ilustrao 58 - Organizao dos grupos polares e apolares numa protena intrnseca.

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Principais funes das protenas numa membrana plasmtica:

O transporte de substncias para o interior da clula pode classificar-se da seguinte forma:

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Transporte passivo as substncias movem-se espontaneamente a favor do seu gradiente de concentrao, atravessando a membrana sem gastos energticos. A taxa de difuso pode ser aumentada atravs das protenas membranares transportadoras. Difuso molculas hidrofbicas e pequenas molculas carregadas podem difundir atravs da membrana. Difuso facilitada muitas das substncias hidroflicas difundem atravs membrana com o auxlio de protenas transportadoras, quer pelos seus canais quer pela alterao de forma das mesmas. Transporte activo algumas protenas injectam substncias, no interior ou no exterior da membrana celular, contra o seu gradiente de concentrao atravs da utilizao de energia proveniente, habitualmente, do ATP.

Ilustrao 59 - Difuso, Difuso Facilitada e Transporte activo.

VI.

cidos Nucleicos

Os cidos nucleicos so macromolculas (polmeros de nucletidos) onde armazenada a informao gentica de uma clula. Esto presentes em todos os seres vivos e podem surgir sob a forma de DNA (cido desoxirribonucleico) ou RNA (cido ribonucleico). O DNA actualmente a forma dominante de informao gentica, embora alguns organismos, como os retrovrus, utilizem apenas RNA. As unidades fundamentais dos cidos nucleicos, os nucletidos, so formadas por uma base azotada e um grupo fosfato ligados a uma pentose. A estrutura bsica de um nucletido compreende ento: Base azotada Purinas: formadas por um anel duplo (penta-anel e hexa-anel) Adenina (A) Guanina (G) Pirimidinas: formadas por um anel simples (hexa-anel) Citosina (C) Timina (T) exclusiva do DNA Uracilo (U) exclusiva do RNA Pentose acar de 5 carbonos Ribose RNA Desoxirribose DNA (tem menos um grupo OH do que a ribose)

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Grupo fosfato responsvel pelo carcter cido das molculas. Tem um pKa1, pelo que em condies fisiolgicas (pH7) est sempre ionizado e com carga negativa. Assim, os cidos nucleicos necessitam de Mg2+, poliaminas, histonas e outras protenas para equilibrar esta carga.

Ilustrao 60 - Bases azotadas

Ilustrao 61 Pentoses e grupo fosfato.

Na formao de cada nucletido intervm reaces de condensao: a base azotada liga-se ao carbono 1 da pentose, dando origem a nuclesidos. As bases azotadas tm a capacidade de rodar em torno do acar a que esto ligadas, podendo apresentar configurao syn ou anti, sendo a ltima a mais comum.
Ilustrao 62 - Ismeros do nuclesido de adenina.

Com a ligao de um grupo fosfato ao carbono 5 da pentose, forma-se um nucletido. Os nucletidos livres so tri-fosfatos dNTP, perdendo dois grupos fosfato durante as reaces de polimerizao passam a dNMP (ex: dAMP nucletido de adenina monofosfato). No caso do RNA temos NTP e NMP, respectivamente. A polimerizao de nucletidos, que d origem aos cidos nucleicos propriamente ditos, requer a formao de ligaes fosfodiesters entre o grupo hidroxilo do carbono 3 de um nucletido e o grupo fosfato do carbono 5 do nucletido seguinte. A cadeia polinucleotdica adquire assim uma direco, apresentando no terminal 5 um grupo fosfato (terminal negativo) e no terminal 3 um grupo hidrxido (terminal positivo), e a sua sntese sempre feita na direco 5-3.

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Ilustrao 63 - Nucletido do ADN.

Em 1928, Fredrick Giffith descobriu um factor gentico nas bactrias que modificava bactrias inofensivas em bactrias mortais e, em 1952, Rosalind Franklin obteve a primeira imagem de raio-X do DNA. Finalmente em 1953, com base nos resultados de experincias anteriores, James Watson e Francis Crick apresentaram, na Universidade de Cambridge, o modelo de dupla hlice para o DNA. Segundo este modelo, a molcula de DNA composta por duas cadeias polinucleotdicas, que se dispem em sentidos inversos, designando-se, por isso, antiparalelas. No esqueleto da cadeia distinguem-se duas cadeias laterais e degraus centrais: as bandas laterais so formadas por molculas do grupo fosfato alternadas com pentoses e unidas por ligaes fosfodiesters; os degraus centrais so pares de bases ligados por pontes de hidrognio. A especificidade das ligaes hidrognio entre as purinas e pirimidinas a chamada complementaridade de bases: a adenina liga-se timina por uma ligao dupla (A=T) e a guanina liga-se citosina atravs de uma ligao mais forte, uma ligao tripla (G C) a quantidade de adenina e timina, e de guanina e citosina numa clula sensivelmente a mesma (Regra de Chargaff). O DNA de dupla-hlice (dsDNA double-stranded DNA) adquire, geralmente, a forma uma dupla hlice de mo direita com aproximadamente 10 pares de bases (3.4 cada par) por volta, ou seja, tem um passo de 34 ; 20 de dimetro e uma rotao de 36 entre os resduos. De um ponto de vista vertical, a distncia entre as cadeias de DNA pode ser pequena minor groove, ou grande major groove.
Ilustrao 64 - Estrutura do ADN.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular O RNA apresenta uma estrutura em cadeia simples e est presente em 3 formas: RNA mensageiro (mRNA): cadeia de nucletidos que transporta a informao para a sntese de protenas aos ribossomas; RNA de transferncia (tRNA): transfere os aminocidos para os ribossomas; RNA ribossmico (rRNA): entra na constituio dos ribossomas. Nos seres procariontes, o DNA encontra-se no hialoplasma e uma molcula circular. J nas clulas eucariticas, 99% do material gentico est no ncleo e apresenta-se sob a forma de cromatina filamentos de DNA associados a protenas, as histonas. Tipo de Cadeia ADN Dupla Hlice Simples, por vezes dobrada Pentose Desoxirribose Bases Azotadas A, G, C, T Localizao Principalmente no ncleo Forma-se no ncleo e migra para o citoplasma Quantidade Constante para todas as clulas da mesma espcie Varivel de clula para clula e com a actividade celular

RNA

Ribose

A, G, C, U

Uma vez que o DNA se encontra sob a forma de uma dupla hlice, a sua estrutura pode ser modificada por factores externos, como a temperatura ou acidez do meio. O aquecimento do material gentico enfraquece e quebra as ligaes por pontes de hidrognio entre bases complementares, levando desnaturao do DNA. A quantificao deste processo pode fazer-se atravs da medio da absorvncia a 260 nm (pico de absoro das bases azotadas), verificando-se que quanto maior for o valor medido maior a desnaturao da cadeia em cadeia simples, as bases outrora viradas para o interior da molcula, esto mais sujeitas radiao, absorvendo-a em maior quantidade. Registando os valores de absorvncia medida que se aumenta a temperatura do meio verifica-se que estes vo aumentando, o que indica que a elevao da temperatura actua como agente desnaturante. Representando graficamente a absorvncia em funo da temperatura obtm-se as curvas de melting, nas quais se distingue um ponto de inflexo. Este ponto corresponde temperatura qual 50% da cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada e designa-se temperatura de melting (TM), ou de fuso. Esta temperatura depende directamente do contedo de citosina e guanina da molcula, pois quanto maior for o contedo CG maior o nmero de ligaes triplas. Como estas ligaes so mais fortes, para que sejam quebradas e ocorra desnaturao necessria uma temperatura mais elevada, pelo que a um maior contedo CG corresponde uma maior TM.

Ilustrao 65 - Temperaturas de Melting.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Aps a desnaturao, se a temperatura diminuir h hibridao do DNA, ou seja, restabelecem-se as ligaes hidrognio entre as bases complementares e volta a formar-se uma cadeia dupla. As molculas de RNA so cadeias simples no lineares que apresentam estrutura secundria, como ganchos e hlices, pelo que pode ocorrer desnaturao do RNA. Cada molcula possui uma curva de melting diferente, em funo do seu tipo de estrutura Ilustrao 66 - Variao da Temperatura de secundria, que pode no estar associada a nenhum ponto de inflexo, pelo que no se define temperatura Melting com a maior quantidade de ligaes GC. de melting para o RNA.

VII.

Metabolismo

Entende-se por metabolismo o conjunto de todas as reaces qumicas que se do dentro das clulas. Inclui: Catabolismo processos oxidativos e exergnicos nos quais h libertao de energia pela degradao de produtos complexos em produtos mais simples. Ex: glicogenlise produz glicose a partir de glicognio; Anabolismo processos redutivos endergnicos que requerem o uso de energia para formar produtos complexos a partir de molculas mais simples. Ex: glicognese armazena excesso de glicose sob a forma de glicognio. Lipognese armazena glicose e aminocidos sob a forma de lpidos. Enquanto as vias catablicas convergem para poucos produtos finais as vias anablicas divergem para a sntese de muitas biomolculas diferentes. Por exemplo, o catabolismo de lpidos, glcidos e protenas origina um intermedirio comum acetil-CoA, que utilizado na respirao celular. Este intermedirio, por processos anablicos, pode depois dar origem s mais variadas molculas, desde fosfolpidos a triglicridos, hormonas esterides e vitaminas. A maioria dos processos metablicos inclui uma srie de reaces e est organizada em vias metablicas reguladas por enzimas. As enzimas intervenientes podem encontrar-se isoladas, em complexos multienzimticos ou formar sistemas associados a membranas. A localizao de todo o complexo numa zona especfica da clula, como uma regio da membrana, permite que o processo seja mais eficiente. Uma via metablica tem incio num substrato especfico e termina num determinado produto. Durante todo o processo do-se vrios passos, cada um catalisado por uma enzima especfica, e os produtos de uma reaco tornam-se substratos das seguintes, pelo que se designam intermedirios. O facto de as vias estarem divididas em vrias reaces permite no s que se obtenham produtos que, de forma espontnea, no seria possvel obter (acoplamento de reaces termodinamicamente favorveis a processos desfavorveis), como tambm que se regule o calor/energia libertado e se mantenha a temperatura da clula dentro de valores fisiolgicos. Embora as vias anablicas e catablicas de degradao e sntese dos mesmos compostos sejam semelhantes, necessrio que apresentem alguns passos diferentes. S assim se obtm mecanismos de regulao que permitem favorecer uma das vias e inibir a outra, e tambm s deste modo que ambas as vias podem ocorrer em simultneo e de forma espontnea, j que

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular se no existisse qualquer diferena entre elas as leis do equilbrio termodinmico ditariam que as vias apenas se dessem num sentido. As principais vias metablicas da maioria dos organismos apresentam muitas semelhanas, o que sugere que todas as formas de vida descendem de um ancestral comum. A molcula de ATP, por exemplo, o intermedirio energtico mais utilizado por todos os seres vivos embora outras molculas, como o NAD ou NADP, tambm desempenhem o mesmo papel. O ATP, adenosina trifosfato, armazena energia nas ligaes dos seus grupos fosfato e a sua sntese ou degradao est acoplada a muitos processos endergnicos ou exergnicos, respectivamente. Atravs do ciclo do ATP, a energia conseguida durante a fotossntese ou outros processos catablicos
Ilustrao 67 - Ciclo do ATP.

transportada para os processos celulares que necessitam de energia.

Ilustrao 68 - ATP.

As reaces de oxidao-reduo adquirem uma enorme importncia na produo de ATP e de energia. Sempre que uma substncia oxidada, perdendo energia por atingir um nvel mais estvel, outra substncia sofre reduo e adquire mais energia. Existem coenzimas que agem como aceitadoras de electres. Algumas das mais importantes so o FAD (dinucletido de flavina-adenina), o NAD (dinucletido de nicotinamida-adenina), e o NADP (dinucletido de nicotinamida-adenina fosfato), cujas formas reduzidas so, respectivamente, FADH, NADH e NADPH. Estas coenzimas so transportadoras de electres e armazenam energia sob a forma de electres num alto nvel energtico.

Ilustrao 69 - FAD (a) e NAD (b).

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A sntese de ATP d-se por 3 processos: Gliclise, ou outras vias metablicas que levem formao de acetil-CoA (metabolismo glicdico, lipdico ou proteico); Ciclo de Krebs, ou ciclo do cido ctrico; Cadeia respiratria.

a. Gliclise e Neoglucognese
A gliclise o processo no qual uma molcula de glicose degrada, atravs de 10 reaces catalisadas enzimaticamente, e forma 2 molculas de cido pirvico, um composto de 3 carbonos. comum a todos os organismos, no utiliza oxignio e d-se no citoplasma, onde se localizam as enzimas necessrias ao processo. Pode dividir-se em 3 fases:

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Ilustrao 70 - Gliclise.

A equao global da gliclise :

O balano energtico desta fase : Reaco 1 3 6 7 10 Balano energtico final

ATP NADH+H+ -1 0 -1 0 0 2 2 0 2 0 2 2

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular O produto final da gliclise o cido pirvico, que vai depois ser utilizado na respirao celular. Em condies anaerbicas (ausncia de oxignio) ocorre fermentao. H vrios tipos de fermentao, cada um com produtos finais diferentes, mas em todos os casos o balano final de ATP sempre de 2 molculas: Fermentao alcolica ocorre, por exemplo, nas plantas e leveduras, e os produtos finais so o CO2 e o etanol. Neste tipo de fermentao o cido pirvico proveniente da gliclise descarboxilado, libertando CO2 e originando aldedo actico, um composto com 2 carbonos. Por aco do NADH reduzido, tambm proveniente da fase da gliclise, forma-se etanol.

Fermentao lctica verifica-se, por exemplo, nos bacilos lcticos, e o cido pirvico reduzido a cido lctico. Aps a gliclise, o piruvado combina-se com o H+ transportado pela NADH e origina o cido lctico.

O ciclo de Cori traduz uma cooperao metablica entre os msculos e o fgado quando ocorre fermentao lctica. Aps ser produzido nos msculos, o cido lctico transportado pelo sangue at ao fgado, onde novamente convertido em glucose pelo processo da gluconeognese. Na respirao aerbia (em presena de oxignio) o cido pirvico, formado durante a gliclise, transportado para o interior das mitocndrias, onde vai integrar o ciclo de Krebs e a cadeia de transporte electrnico. No final de todo este processo o balano terico final de ATP ser de 36 nos organismos eucariotas e de 38 nas bactrias.
Ilustrao 71 - O processo que se segue gliclise depende da presena ou ausncia de oxignio.

Os seres humanos consomem cerca de 160 gramas de glucose por dia, sendo que 75% dessa quantidade consumida no crebro. Os fluidos corporais contm apenas 20 gramas de glucose e as reservas de glicognio rendem cerca de 180 a 200 gramas de glucose. , portanto, necessrio que os seres humanos e outros organismos sejam capazes de sintetizar a sua prpria glicose. A neoglucognese, ou gluconeognese, a via metablica que conduz sntese de glicose a partir de cido pirvico. Ocorre, principalmente, no fgado e nos rins e, apesar da maioria das suas reaces serem inversas s da glicose, algumas, que por razes de ordem termodinmica no so reversveis ( ), variam. Nesses casos, as reaces so catalisadas por enzimas diferentes e constituem os principais pontos de regulao das duas vias. Os passos alterados so:

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Reaco 10 converso de piruvato em fosfoenolpiruvado; Reaco 3 converso da frutose-1,6-fosfato em frutose-6-fosfato; Reaco 1 converso da glicose-6-fosfato em glicose. A regulao da neoglucognese est relacionada com a regulao da gliclise: Quando a gliclise est em funcionamento, a gluconeognese no est a realizar-se; Quando o estado energtico da clula elevado a gliclise deve ser desligada e o piruvato, entre outros, deve ser utilizado para a sntese e armazenamento de glucose; Quando o estado energtico da clula baixo a glucose deve ser rapidamente degradada de modo a fornecer energia; Os passos regulados da gliclise so os mesmos passos que so regulados na direco oposta. Destacam-se ainda outros processos que envolvem a glucose: Glicognese processo de formao de glicognio quando a glucose existe em excesso; Lipognese processo de produo de lpidos, atravs de aminocidos e glucose, quando as reservas de glicognio esto lotadas; Glicogenlise processo de formao de glucose a partir da quebra das ligaes do glicognio.

b. Ciclo de Krebs
O ciclo de Krebs, ou ciclo do cido ctrico, d-se na matriz mitocondrial e consiste na oxidao de acetil-CoA a CO2 com libertao de energia sob a forma de electres, que armazenada em NADH e FADH2, molculas transportadoras de electres. A acetil-coenzima A o produto de diversas vias metablicas mas no um produto final da gliclise. Para que o cido pirvico possa integrar o ciclo de Krebs necessrio um passo preparatrio em que o piruvato convertido em acetil-CoA. Ilustrao 72 - Formao da acetilcoenzima A. Na respirao aerbia, aps a etapa da gliclise o cido pirvico entra nas mitocndrias e, ao nvel da matriz mitocondrial, sofre 3 reaces que culminam na formao de acetil-CoA: Descarboxilao removido um carbono ao cido pirvico. Forma-se acetaldedo e dixido de carbono; Oxidao so removidos dois H ao acetaldedo. Forma-se cido actico e reduz-se NAD+ a NADH+H+; Formao de acetil-CoA o cido actico combina-se com uma coenzima A e forma-se acetil coenzima A. O acetil-CoA vai agora integrar o Ciclo de Krebs, que tem 8 passos:

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Ilustrao 73 - Ciclo de Krebs.

A equao global do Ciclo de Krebs :

O balano energtico desta fase : Balano do Ciclo de Krebs Por acetil-CoA Por ciclo ATP 1 2 NADH+H+ 3 6 FADH2 1 2 CO2 2 4

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c. Cadeia Respiratria
A cadeia respiratria, ou cadeia de transporte electrnico, a etapa em que culminam todos os processos oxidativos de degradao de glcidos, lpidos ou protenas. Esta fase d-se nas cristas mitocondriais e permite a sntese de ATP utilizando a energia libertada durante a reduo de O2 a H2O, cujos electres so doados pelo NADH e FADH2 provenientes da gliclise e ciclo de Krebs. Nas cristas mitocondriais encontra-se um conjunto de 3 complexos enzimticos (I, III, IV), ligados por dois transportadores electrnicos (CoQ e Citocromo C). O conjunto destas 8 enzimas, associadas a tomos metlicos (cofactores) capazes de aceitar e doar electres, forma a cadeia respiratria. Seis das protenas que fazem parte desta cadeia encontram-se fixas, enquanto as restantes duas so mveis. Quando os cofactores NADH+H+ e FADH2 libertam hidrognio para a cadeia respiratria d-se incio ao processo de fosforilao oxidativa. Neste processo as reaces de oxidao e fosforilao esto acopladas, o que permite a sntese de ATP: Cada H fornecido cadeia separado em H+ + e-; Os protes so bombeados para o espao intermembranar criando um gradiente de pH e um potencial electroqumico transmembranar de H+. Por cada NADH+H+ so bombeados 10 H+ e por cada FADH2 apenas 6 H+, pois o FADH2 liberta os seus protes apenas no segundo transportador; Os electres vo passar de transportador electrnico em transportador electrnico at serem entregues ao oxignio; Os electres so fornecidos ao O2, dando origem a ies; Os ies oxignio atraem H+ e forma-se gua; O potencial de H+ provoca a difuso destes ies de novo para o interior da matriz mitocondrial e permite a sntese de ATP via ATPsintase; O complexo V, ATPsintase, formado por trs partes. A corrente criada pela passagem de H+ provoca a rotao de duas dessas partes, o rotor e o haste, e activa os stios activos da terceira parte, o basto, onde formado ATP a partir de ADP+Pi; Cada NADH origina 3 ATP e cada FADH2, como s leva ao bombeamento de 6 H+, permite apenas a sntese de 2 ATP.

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Ilustrao 74 - Complexos enzimticos que participam na cadeia respiratria.

Ilustrao 75 - Processo de bombeamento de protes pelos complexos enzimticos.

Curiosidade o cianeto uma substncia que adere cadeia transportadora de electres e impede a produo de ATP, asfixiando as clulas e podendo levar morte do indivduo.

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Em 1960, Peter Mitchell props uma teoria, a teoria quimiosmtica, para a formao de ATP (teoria que lhe valeu o prmio Nobel em 1978). Quando os protes so bombeados para o espao intermembranar cria-se um gradiente de pH e um potencial electroqumico transmembranar de H+. Os protes regressam, contudo, matriz (movimentando-se para uma zona de menor concentrao de H+) atravs da ATP sintetase. O fluxo de protes atravs desta enzima fornece a energia necessria para a fosforilao do ADP a ATP.

Ilustrao 76 - ATP sintetase.

Ilustrao 77 - Modelo da teoria quimiosmtica.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular O balano energtico desta fase : N de molculas ATP por molcula ATP formado + NADH+H 10 3 30 FADH2 2 2 4 Total 34 O balano final : ATP NADH+H+ FADH2 CO2 Gliclise 2 2 Obteno de acetil-CoA 2 2 Ciclo de Krebs 2 6 2 4 Cadeia Respiratria 34 -10 -2 Por molcula de glicose 38 0 0 6 Nos eucariontes, as molculas de NADH formadas na gliclise so incapazes de atravessar a membrana da mitocndria, sendo necessria a sua converso para FADH2. Como na gliclise se formam 2 NADH, ento, os 6 ATP provenientes destes NADH passam a ser somente 4 (uma vez que so obtidos pelo NADH convertido em FADH2 e este s origina 2 ATP, em vez de 3). Assim, o total de ATP produzido num eucarionte de 36. O valor de 36 ATP , contudo, um valor terico. Na prtica, verifica-se que os organismos eucariontes produzem apenas 30 ATP por molcula de glicose. Esta diferena deve-se ao facto de a clula utilizar o gradiente de protes criado durante o transporte electrnico para outros propsitos que no apenas a actividade da ATPsintetase.

Ilustrao 78 - As vrias etapas de produo de ATP.

A equao global da oxidao da glucose :

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d. Outras vias metablicas


Uma pessoa de 70 Kg tem cerca de 135000 kcal de energia armazenadas como gordura, 24000 kcal sob forma de protenas e 720 kcal de reservas de glicognio, assim como 80 kcal de glucose em circulao no sangue. importante, pois, que o nosso organismo tenha mecanismos extra para produzir ATP, partindo de outras matrias-primas. Outras vias metablicas que levam produo de energia metablica so a oxidao dos cidos gordos (as reservas de lpidos no corpo humano perfazem cerca de 85% do total de energia disponvel) e o catabolismo de protenas.
Ilustrao 79 - As vrias vias que conduzem produo de ATP.

i.

Oxidao de cidos gordos

Os triglicridos podem ser degradados e dar origem a 3 cidos gordos, que entram no ciclo de oxidao dos cidos gordos, e a uma molcula de glicerol, que se torna um substrato da gliclise. As enzimas responsveis pela quebra das ligaes dos cidos gordos so as lipases. Para poderem entrar no ciclo de oxidao os cidos gordos livres tm que ser activados, isto , tm que ser convertidos em acil-CoA gordo e transportados para as mitocndrias, onde se vai dar todo o processo de extraco de energia. A activao dos cidos gordos d-se no citoplasma, pela enzima acil-CoA gordo sintetase e com gasto de 2 ATP, e o seu transporte est dependente da bomba de carnitina, onde o grupo acil-CoA substitudo por acil-carnitina para poder entrar na mitocndria. Uma vez dentro do organelo a acil-carnitina volta a ser convertida em acil-CoA. A enzima acilcarnitina transferase I, enzima responsvel pela substituio do grupo acil-CoA do cido gordo, pode ser inactivada por malonil-CoA. Este processo impede o transporte de cidos gordos para a mitocndria quando estes se encontram a ser sintetizados.

Ilustrao 80 - Processo de activao de um cido gordo.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A oxidao de cidos gordos (activados) ocorre no interior das mitocndrias e envolve trs etapas: 1 Etapa -oxidao: uma cadeia de cidos gordos oxidada dando origem a resduos de acetil-CoA; 2 Etapa acetil-CoA entram no ciclo de Krebs e so oxidadas a CO2; 3 Etapa os electres provenientes das oxidaes anteriores entram na cadeia respiratria e permitem a sntese de ATP.
Ilustrao 81 - Bomba de carnitina.

A -oxidao um ciclo em espiral e engloba 4 reaces: Reaco 1, oxidao remoo de H dos carbonos e (primeiros dois carbonos ligados a hidrognios), formao de uma ligao dupla C=C em trans e reduo de FAD a FADH2; Reaco 2, hidratao adio de H2O ligao dupla acabada de formar, processo catalisado pela enzima enoil-CoA hidratase. Ao carbono adicionado um H e ao carbono adicionado um grupo OH, formando um grupo hidroxilo (COH). A enzima enoil-CoA hidratase s actua em ligaes duplas do tipo trans. Consequentemente, cidos gordos insaturados, que contm ligaes duplas do tipo cis, requerem a aco um outra enzima uma isomerase, que converte as ligaes cis em trans; Reaco 3, segunda oxidao oxidao do grupo hidroxilo, formao de um grupo cetona no carbono e reduo de NAD+ a NADH; Reaco 4, clivagem a ligao entre C e C clivada dando origem a uma molcula de acetil-CoA e a um acil-CoA gordo com menos dois carbonos que entra de novo no ciclo de -oxidao.

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Ilustrao 82 - -oxidao de um cido gordo.

A oxidao de cidos gordos o processo mais rentvel para a obteno de energia metablica. O nmero de carbonos de um cido gordo determina o nmero de oxidaes necessrias e o nmero de acetil-CoA formadas, determinando consequentemente a quantidade de ATP que pode ser sintetizada. Deste modo, por cada cido gordo com n carbonos (n par) tem-se: Balano energtico final n carbonos N de ciclos Informaes Activao do cido gordo -oxidao Ciclo de Krebs (Acetil-CoA) -

ATP -2

(1 ciclo origina 1 NADH e 1 FADH2) (existem n/2 acetil-CoA)

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ii.

Catabolismo proteico

O catabolismo de protenas nos mamferos d-se principalmente no fgado e envolve: Quebra das ligaes peptdicas e degradao das protenas em aminacidos; Deaminao dos aminocidos (remoo de um grupo amina NH2) com formao de amnia (NH3) e de um cido orgnico; A amnia entra no ciclo da ureia e produz ureia, que eliminada pelo organismo; O cido orgnico formado pode entrar em diferentes fases da gliclise ou do ciclo de Krebs, de acordo com a natureza do seu grupo R. Por exemplo, a deaminao da alanina d origem a piruvato mas o aspartato j origina oxaloacetato. Devido s diferentes molculas que podem resultar do catabolismo das protenas no possvel estimar a quantidade de ATP formado de um modo geral cada caso um caso.
Ilustrao 83 - Entrada dos diversos aminocidos no Ciclo de Krebs.

VIII.

Fotossntese

Fotossntese o processo atravs do qual alguns seres vivos produzem matria orgnica a partir de matria mineral utilizando energia luminosa (armazenada, posteriormente, nas ligaes qumicas da matria produzida). Os seres que realizam este processo chamam-se fotoautotrficos e neles esto includas as plantas, as algas e algumas bactrias. A equao que traduz o processo :

A fotossntese d-se ao nvel dos cloroplastos. O prolongamento da sua membrana forma tilacides onde se encontram os pigmentos fotossintticos, responsveis pela absoro da luz, e a cujo conjunto se d o nome de grana. Estas estruturas esto inseridas no estroma, uma matriz fluida.

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Ilustrao 84 A maioria dos cloroplastos encontra-se nas folhas das plantas, existindo, contudo, um pouco por todas as zonas verdes da mesma.

Existem diversos pigmentos fotossintticos, que apresentam diversas cores e se encontram em diferentes seres vivos: Tipo de pigmento Clorofilas Cor Distribuio Plantas, algas, algumas bactrias Plantas, algas verdes Algas castanhas, diatomcia Algas vermelhas Algas e plantas Algas castanhas, diatomcias

Caratenides Ficobilinas

A B Verde C D Carotenos Laranja Xantofilas Amarela Ficoeritrina Vermelha Algas vermelhas, algumas bactrias Ficocianina Azul

Os dois grandes grupos de pigmentos fotossintticos que absorvem energia luminosa, elevando electres para nveis de energia mais altos (o que aumenta a energia potencial), so as clorofilas e os carotenides. Cada um destes pigmentos absorve preferencialmente uma gama de radiaes: as clorofilas a e b absorvem principalmente radiaes correspondentes s faixas azul-violeta e vermelho-alaranjado (apresentando assim cor verde), enquanto os carotenides se restringem faixa azul-violeta. No entanto, apenas a clorofila a participa directamente nas reaces luminosas. Todos os outros pigmentos apenas adicionam energia clorofila ou dissipam energia que foi absorvida em excesso.

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Ilustrao 85 - Clorofila a.

Note-se que os fotes azuis, mais energticos, excitam os electres para estados de energia mais elevados que no caso dos fotes vermelhos. Em 1930, Van Niel, estudando o comportamento de bactrias sulfurosas capazes de realizar a fotossntese, concluiu que o oxignio libertado neste processo provinha da gua e no do dixido de carbono. Marcou a gua com oxignio O18 e verificou que este era libertado na fotossntese e no integrava os compostos orgnicos formandos. Mais tarde, na experincia de Calvin, atravs da marcao do dixido de carbono com carbono radioactivo comprovou-se que as substncias formadas, de carcter radioactivo, derivavam do CO2 fornecido. Atravs de uma experincia realizada em 1951, Gaffron provou que a luz era necessria para iniciar o processo fotossinttico, o qual poderia depois continuar durante alguns segundos mesmo na sua ausncia. A fotossntese compreende assim duas fases sucessivas: Fase fotoqumica, ou fase luminosa/clara dependente da luz. D-se a excitao dos pigmentos fotossintticos e a fotlise da gua. uma fase exergnica, produzindo-se ATP, NADPH e O2; Fase qumica, ou fase escura tambm conhecida como Ciclo de Calvin. Esta fase depende no da luz mas sim da presena de CO2 e endergnica. A partir de dixido de carbono e ATP e electres do NADPH, provenientes da fase fotoqumica, produz-se glicose (C6H12O6).

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a. Fase fotoqumica
A fase fotoqumica ocorre nos tilacides e transforma a energia luminosa captada pelos pigmentos fotossintticos em energia qumica. Nesta fase intervm dois fotossistemas conjuntos de pigmentos associados a protenas que se encontram na membrana dos tilacides e providenciam a energia necessria para excitar os electres da clorofila: Fotossistema II (PSII) absorve comprimentos de onda correspondentes a 680 nm e participa na sntese de ATP. Encontramse na face da membrana dos tilacides que est virada para o interior do grana; Fotossistema I (PSI) absorve comprimentos de onda correspondentes a 700 nm e participa na sntese de NADPH. Encontra-se na face da membrana que est em contacto com o estroma.
Ilustrao 86 - Fotossistema.

Ilustrao 87 - Tilacides.

Nos fotossistemas os fotes so absorvidos pelos pigmentos antena e a sua energia canalizada para o centro de reaco, composto por uma clorofila a e por um aceitador

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular primrio de electres. A energia captada oxida a clorofila e o electro libertado removido atravs da reduo do aceitador primrio de electres, podendo ento ser conduzido por dois caminhos: Fotofosforilao acclica; Fotofosforilao cclica.

Ilustrao 88 - Fotofosforilao.

Na fotofosforilao acclica a clorofila a do centro de reaco do PSII oxidada e os electres libertados vo ser transferidos para outras molculas atravs de sucessivas reaces de oxidao-reduo, dando incio ao transporte electrnico que permite a sntese de ATP por quimiosmose. As protenas responsveis por esse transporte so as plastocianinas. Electres provenientes da fotlise da gua reduzem a clorofila desse sistema, deixando-a apta a recomear um novo ciclo, e libertado O2 segundo a reaco: . Ao longo do transporte electrnico os electres vo perdendo energia e ao chegar ao PSI, j num baixo nvel energtico, reduzem a Cla+ a existente. Pela incidncia da luz solar, a Cla oxidada de novo e d-se incio a mais um transporte electrnico que, juntamente com os protes libertados pela gua, contribui para a reduo de NADP+ a NADPH.

Ilustrao 89 - Fosforilao acclica.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A fosforilao do ATP d-se por quimiosmose, ou seja, a difuso de ies, neste caso H+, permite a sntese de ATP aquando da passagem de 2H+ pela enzima ATP Sintetase. A difuso destes protes garantida pelo gradiente de concentrao existente entre o estroma e o interior do tilacide, um meio de pH muito mais baixo. Uma vez que na fotlise da gua se libertam no s e- como tambm H+, este processo ajuda a assegurar a diferena de pH necessria ao sucesso da fotossntese. Ao passarem para o estroma um dos H+ utilizado na formao de NADPH enquanto o outro de novo enviado por transporte activo para o interior do tilacide. A energia necessria a este transporte provm da energia libertada durante o transporte electrnico de electres no PSII e durante a fotofosforilao cclica.

Ilustrao 90 - Processo de produo de ATP.

A fotofosforilao cclica s contribui para a sintetizao de ATP. Um electro sai do PSI em direco zona de transporte activo de H+, voltando depois ao PSI onde recebe energia para recomear o processo. Durante o seu percurso o e- liberta energia que vai ser utilizada no transporte activo de H+ que cria o gradiente necessrio sntese de ATP.

b. Fase qumica
A fase qumica tambm conhecida como Ciclo de Calvin, ocorre no estroma dos cloroplastos e onde se d a produo de acares. Este ciclo engloba 3 fases: Fase 1, fixao de CO2 3 molculas de CO2 reagem com 3 molculas de RuBP (ribulose bifosfato), um composto com 5 carbonos e 2 fosfatos, dando origem a um composto com 6C muito instvel. A enzima que participa nesta reaco a RuBP carboxilase, ou rubisco. O composto instvel divide-se rapidamente formando 6 molculas de 3-fosfoglicerado, que tm apenas 3C cada; Fase 2, produo de acares seguidamente, d-se a fosforilao do 3-fosfoglicerado em 1,3-bifosfoglicerado utilizando-se 6 ATP e a sua reduo em gliceraldedo 3fosfato (PAGL) recorrendo-se a 6 NADPH. Formam-se ento 6 PGAL, dos quais um abandona o ciclo e mobilizado para a sntese de molculas orgnicas. Os restantes 5 PGAL permanecem no ciclo de Calvin;

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Fase 3, regenerao de RuBP 5 gliceraldedo 3-fosfato originam 3 molculas de RuMP (ribulose monofosfato), um composto com 5C mas apenas 1P. Recorrendo-se a 3 ATP regeneram-se os 3 RuBP que sero utilizados para dar incio a um novo ciclo.

Ilustrao 91 - Ciclo de Calvin.

Quando se fala no ciclo de Calvin consideram-se 3 ciclos como a unidade, pois apenas assim se permite a formao e regenerao correcta de todos os elementos. O ATP e NADPH utilizados neste processo provm da fase fotoqumica e o ADP e NADP+ resultantes so reintegrados nessa fase, onde se regeneram. Durante este processo gasta-se mais ATP do que NADH o que explica a necessidade da fotofosforilao cclica.

c. Variantes do processo
Tanto a mitocndria como os cloroplastos geram ATP via difuso de ies H+, resultante de uma concentrao de H+ diferente no interior e exterior dos tilacides. Ambos utilizam uma cadeia transportadora de electres e um complexo ATP sintetase similar. A diferena surge ao nvel do combustvel a utilizar no processo. O processo de fotossntese descrito do tipo C3, que o tipo mais comum e ocorre em plantas que tendem a ocupar reas onde a intensidade da luz do Sol e a temperatura so

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular moderadas, a concentrao de dixido de carbono cerca de 200 partes por milho ou superior e a concentrao de gua no solo tambm elevada. As plantas que utilizam este tipo de fotossntese no podem crescer em zonas quentes pois a rubisco incorpora mais oxignio em RuBP medida que a temperatura aumenta (comea a ocorrer fotorrespirao, com libertao de CO2 e sem produo de ATP e NADPH). Os outros tipos de fotossntese so: Fotossntese C4 ocorre principalmente em gramneas (como a cana-de-acar e o milho), plantas adaptadas a altas temperaturas. As clulas mesfilas das plantas C4 captam o CO2, com o auxlio da enzima FosfoEnolPiruvato carboxilase (PEP) e formam cidos com 4 carbonos, como o cido mlico. Estes cidos podem ser descarboxilados a 3PGA, utilizado ento pela rubisco. Tambm podem ser descarboxilados nas clulas da bainha vascular, libertando CO2 e aumentando a concentrao deste gs. Esta grande concentrao de CO2 permite evitar a competio entre CO2 e O2 na rubisco. Este tipo de fotossntese mais eficiente que C3 pois h um maior aproveitamento de CO2 e menor perda de gua, graas a uma menor dependncia do controlo da abertura e fecho dos estomas. Fotossntese CAM (Metabolismo cido das Crassulceas) ocorre em plantas suculentas, adaptadas a condies ridas. As plantas CAM abrem os estomas durante a noite, absorvendo dixido de carbono durante este perodo e reduzindo a perda de gua por transpirao, e armazenam-no sob a forma de cido mlico. Durante o dia, com a incidncia de luz solar, o cido mlico entra no Ciclo de Calvin para originar molculas de glicose.

Ilustrao 92 - Fotossntese C4 e CAM.

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IX.

Replicao do DNA

Durante a diviso celular necessrio copiar o material gentico para que toda a informao possa ser transferida da clula-me para a clula-filha sem erros. A clula cria cpias do seu prprio DNA atravs de um processo de replicao semi-conservativa no qual 50% do DNA da clula-filha pertenceu anteriormente clula-me cria-se uma nova cadeia com base numa cadeia-molde original.

Ilustrao 93 - Experincia que apoia a teoria de que o DNA se replica de forma semi-conservativa.

Para que ocorra replicao necessrio que o DNA se encontre na forma de cadeia simples. Existem 3 enzimas responsveis por esta tarefa (helicases, SSB e girases) que, embora no participem directamente no processo de replicao, so auxiliares de replicao. A replicao tem incio em zonas especficas, denominadas origem de replicao (Ori). Nos procariotas existe apenas uma destas regies, contrariamente ao que acontece nos eucariotas, que apresentam vrias origens de replicao. As regies Ori so ricas em timina e adenina a natureza desta ligaes mais fraca que as de guanina e citosina o que facilita a abertura da cadeia dupla, e so reconhecidas por um par de enzimas, as helicases. Cada helicase envolve uma cadeia simples do DNA e move-se num Ilustrao 94 - Aco das helicases e das SSB. dado sentido, quebrando as pontes de hidrognio entre bases complementares. Essa quebra bidireccional existem duas foras de replicao para cada origem de replicao, e requer consumo de ATP. Quando j se encontra em cadeia simples o DNA tem tendncia a voltar a estabelecer uma cadeia dupla, uma vez que esta a sua forma mais estvel. Para impedir esse processo existe um conjunto de protenas, as SSB (single-stranded DNA-binding proteins), que actuam estabilizando a cadeia simples.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular H medida que ocorre a separao do DNA um outro tipo de enzimas, as DNA-girases ou topoisomerases, vo distorcendo a cadeia para que esta no se enrole em si prpria e dificulte ou impea o processo de replicao. Uma vez separada em cadeia simples a molcula de DNA pode finalmente ser replicada. Os dNTPs existentes na clula vo sendo mobilizados e inseridos sequencialmente na cadeia (respeitando a complementaridade de bases) libertando um pirofosfato (dois fosfatos), por aco das DNA polimerases. Estas enzimas actuam Ilustrao 95 - Aco das topoisomerases sobre o DNA. apenas no sentido 53 e so incapazes de colocar os primeiros nucletidos, pelo que no do incio replicao. Para isso existem as RNA polimerases, ou primases. As RNA polimerases comeam o processo de replicao adicionando alguns NTPs cadeia de DNA e formam os chamados primers, ou iniciadores, constitudos por cerca de 3 a 10 nucletidos de RNA. Uma vez sintetizados estes pedaos de RNA a DNA polimerase III (pol III) continua a replicao no sentido 53, agora j utilizando dNTPs.

Ilustrao 96 - Aco das primases e das DNA polimerases.

A replicao d-se em simultneo nas duas cadeias do DNA. No entanto, enquanto na cadeia 3-5 (leading strand) ocorre replicao contnua no sentido da abertura da cadeia, isto , a pol III actua sem interrupes no sentido 5-3, na cadeia 5-3 (lagging strand) d-se replicao descontnua. Como a polimerase s actua no sentido 5-3 e est acoplada a um complexo que se movimenta na direco da abertura da cadeia dupla, o nico modo de fazer com que a enzima v nessa direco sintetizar a lagging strand por partes. Os fragmentos descontnuos so chamados fragmentos de Okasaki e esto associados, cada um, a um novo primer. Quando a polimerase chega ao final de um destes fragmentos e encontra o fragmento anterior, dissocia-se da cadeia e a replicao desse pedao termina.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular medida que ocorre a replicao, a polimerase I (pol I) percorre as cadeias formadas em busca de erros de sntese, corrigindo-os, e de primers, substituindo-os pelos nucletidos de DNA correctos. Tem, por isso, actividade de exonuclease hidrolisa DNA ou RNA nos sentidos 5-3 ou 3-5, para alm de actividade de polimerase adiciona Ilustrao 97 - Replicao do DNA. novos nucletidos. Tambm as DNA polimerases III actuam como exonucleases. No entanto, enquanto as DNA polimerases I so capazes de reconhecer e corrigir erros de insero de nucletidos em qualquer ponto da cadeia e em qualquer sentido, as pol III apenas detectam erros nos ltimos nucletidos adicionados correco in loco, e no sentido 53.

Ilustrao 98 - Configurao da DNA polimerase III consoante a sua funo.

Na tabela seguinte resumem-se as diferenas entre as diferentes polimerases: Polimerase I II III Polimerizao (53) Sim Sim Sim Exonuclease (35) Sim Sim Sim Exonuclease (53) Sim No No N de Cpias 400 ? 10-20

Note-se a importncia da aco, principalmente, da polimerase I, cujas correces do DNA permitem reduzir a taxa de erros do DNA para , enquanto que, sem a sua aco, a taxa de erro seria de . Como a pol I no consegue estabelecer a ligao entre os nucletidos que substitui e os que se encontram nas extremidades dos fragmentos de Okazaki, formam-se lacunas entre o grupo fosfato de um nucletido e o carbono 3' do outro. Essas falhas so posteriormente corrigidas pelas DNA ligases atravs do estabelecimento de uma ligao covalente.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Como as DNA polimerases apenas estendem os primers na direco 5-3 so incapazes de copiar a extremidade 5 (onde ocorre replicao descontnua) de cromossomas lineares, pelo que se torna necessria a interveno de mecanismos especializados nesta tarefa. Existem ento projeces de nucletidos na extremidade 3, os chamados telmeros, que no so mais do que repetidas de Ilustrao 99 - Na extremidade 3' do DNA no h local de colocao de um sequncias primer, o que origina problemas na replicao descontnua do DNA nessa nucletidos nos terminais dos extremidade. cromossomas. Estas sequncias so replicadas custa de enzimas, as telomerases, que catalisam a sntese dos telmeros mesmo na ausncia da DNA polimerase. As telomerases so transcriptases reversas, ou seja, sintetizam DNA a partir de um molde de RNA, e cada telomerase tem um molde complementar da sequncia do telmero. As telomerases ligam-se ento ao telmero e prolongam-no, sintetizando uma cadeia simples de DNA a partir do RNA complementar. Findo este processo, a telomerase desconecta-se e a replicao de mais uma poro da cadeia de DNA pode dar-se por replicao descontnua convencional. Forma-se um novo telmero que pode ser prolongado de novo.

Ilustrao 100 - Aco das telomerases.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A maioria das clulas somticas no tem nveis de telomerases suficientemente altos para manter o comprimento dos seus telmeros por um nmero indefinido de divises celulares. Deste modo, medida que a clula envelhece verifica-se o desaparecimento progressivo dos telmeros e o encurtamento dos cromossomas, o que pode levar morte ou senescncia (envelhecimento) celular. Algumas patologias humanas, como o envelhecimento precoce, tm vindo a ser associadas a mutaes nas telomerases. Por outro lado, verifica-se que clulas cancergenas apresentam nveis anormalmente altos destas enzimas, o que lhes permite dividirem-se indefinidamente. O problema da existncia e replicao dos telmeros no se pe nos organismos procariotas pois estes tm um cromossoma circular. Neste caso, no existe nenhuma ponta solta e, portanto, todo o DNA replicado sem problemas. importante referir que a replicao do DNA mitocondrial feita por enzimas especficas e que as enzimas mencionadas anteriormente, nomeadamente as polimerases, so responsveis pelo processo de replicao em E.coli. Nos mamferos intervm outros complexos, como exemplificado na imagem seguinte:

Ilustrao 101 - Enzimas intervenientes na replicao do DNA em E. coli e em mamferos.

Na seguinte tabela encontram-se algumas das enzimas que participam na replicao do DNA em mamferos: Capacidade de DNA Polimerase Localizao Funo Proofreading (reviso) Tem actividade da RNA primase inicia a replicao do DNA Ncleo Ncleo Mitocndria Substitui a pol para continuar a replicao Similar a pol , existe em leveduras Ncleo Replicao do DNA Reparao do DNA Replicao do DNA mitocondrial Replicao do DNA No No Sim Sim

Ncleo Ncleo

Replicao do DNA Reparao do DNA

Sim -

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X.

Reparao do DNA

Alteraes no DNA so de grande importncia visto esta molcula guardar uma cpia permanente do genoma da clula. Se uma alterao no for corrigida antes da replicao ento vai ser perpetuada para todas as geraes seguintes. Apesar da replicao ser muito fivel podem verificar-se algumas modificaes do DNA no final deste processo devido insero de bases incorrectas. E no s nesta fase da vida da clula, mas em todas as fases do ciclo celular, podem ocorrer alteraes na sequncia e estrutura do DNA, espontneas ou induzidas por diversos factores externos como qumicos e radiao. Alteraes ao nvel da molcula de DNA podem impedir os processos de replicao e transcrio, bem como aumentar a frequncia de mutaes. Para manter a integridade dos seus genomas as clulas desenvolveram mecanismos de reparao que actuam no sentido de reverter reaces qumicas responsveis pela alterao do DNA e/ou substituir bases incorrectas ou danificadas. As alteraes espontneas dos nucletidos manifestam-se das seguintes formas: Deaminao remoo de um grupo amina de uma base; Depurinao remoo da base purina de um nucletido); Metilao adio de grupos metilo; embora seja um processo normal nos nucletidos, caso se d de forma incontrolada prejudicial. A deaminao ocorre principalmente nos nucletidos de citosina e adenina e o resultado da substituio, na base, de um grupo amina (NH2) por um tomo de oxignio. A deaminao da adenina d origem a hipoxantina, uma base modificada, e da alterao da citosina resulta uracilo pelo que esta base, considerada exclusiva do RNA, pode surgir em DNA danificado. Durante a replicao de uma regio que sofreu deaminao vai formar-se uma cadeia mutada e outra cadeia intacta pois apenas uma das cadeias originais est modificada. Na deaminao da citosina, por exemplo, um dos moldes ter um nucletido de uracilo pelo que a cadeia complementar ir apresentar uma adenina no local de guanina ocorre uma mutao. A outra cadeia molde, como tem um nucletido de guanina que complementar da citosina, vai manter-se inalterada.

Ilustrao 102 - Deaminao de uma citosina.

Na depurinao h remoo total da base de um nucletido, por clivagem da ligao entre essa base e a desoxirribose. No local do nucletido fica apenas a base associada ao grupo fosfato e designa-se esse local por local AP local apurnico ou apirimidnico. semelhana do que acontece na deaminao, a replicao de uma regio danificada vai dar origem a uma cadeia mutada e outra cadeia intacta. S que neste caso, a cadeia mutada tem um nucletido a menos no local em que ocorre depurinao pois no apresenta nenhuma base que permita a ligao de uma base complementar. Esta mutao pode ter consequncias gravssimas para a clula, visto que se ocorrer numa regio codificante pode modificar completamente a protena resultante.

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Ilustrao 103 - Depurinao de uma adenina.

Das alteraes induzidas por radiao ou qumicos, destacam-se a formao de dmeros de timina e de aductos de DNA, e a alquilao. A exposio radiao UV induz a formao de ligaes entre timinas de nucletidos adjacentes, dando origem a um dmero de timina. As duas bases de timina ligam-se entre si, formando um anel de ciclobutano, e deixam de estabelecer ligaes com as adeninas da cadeia complementar (ligao TT mais forte que a ligao A-T). Consequentemente h distoro da estrutura das cadeias de DNA, o que pode bloquear a transcrio ou a replicao. A reparao directa dos dmeros de timina d-se atravs de fotorreactivao. Nesta reaco, inversa dimerizao, utilizada energia da luz visvel para quebrar o anel de ciclobutano e permitir que as timinas se liguem de novo s adeninas complementares. Apesar de as bactrias utilizarem este processo muito frequentemente, os Ilustrao 104 - Fotoreactivao para corrigir um dmero mamferos e, nomeadamente, os seres de timina. humanos, no so capazes de corrigir os dmeros de timina directamente, estando por isso mais sujeitos aos efeitos novios da radiao UV. Muitos agentes qumicos so agentes alquilantes, isto , so agentes reactivos que transferem grupos metilo ou etilo para bases do DNA, modificando-as quimicamente. A alquilao da guanina em particular d origem a O6-metilguanina, uma base complementar da timina em vez da citosina, pelo que a cadeia complementar desta molcula vir alterada. Este tipo de alterao do DNA pode ser reparada directamente por aco de enzimas (O6 metilguanina metiltransferase) que transferem o grupo metilo, adicionado posio O6 da guanina, para um resduo de cistena presente no stio activo da enzima.

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Ilustrao 105 - AAlquilao da guanina.

Ilustrao 106 - Reparao de uma alquilao de uma guanina.

Muitos agentes carcinognicos danificam o DNA pela introduo de grandes grupos aos nucletidos, os aductos de DNA, que alteram a configurao normal das cadeias e, por vezes, at da prpria molcula de DNA.

Ilustrao 107 - Introduo de aductos de DNA numa guanina.

Nem todas as alteraes do DNA podem ser reparadas directamente, como acontece com os dmeros de timina e a alquilao, pelo que as clulas tm mecanismos que permitem reparar vrios tipos de danos. Os mecanismos mais importantes, tanto em procariotas como em eucariotas, so os mtodos de reparao por exciso exciso de base, exciso de nucletido e mismatch repair. Estes mecanismos reconhecem a zona danificada e eliminam a base ou nucletido alterados permitindo depois a sntese de uma nova cadeia de DNA a partir da cadeia complementar intacta. A reparao por exciso de base permite corrigir problemas em bases individuais, quer estas tenham sido danificadas por oxidao ou ionizao quer sejam o resultado de deaminao ou depurinao. Neste processo de reparao a base danificada reconhecida e, por aco de

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular enzimas especficas, clivada a ligao entre a pentose e a base, formando-se um local AP. Este local posteriormente reconhecido por uma AP endonuclease que quebra a ligao fosfodiester entre o fosfato do local AP e a pentose do nucletido adjacente, deixando um nick (interrupo) na cadeia. O que resta do nucletido a ser reparado ento removido e, por aco da DNA polimerase e DNA ligase, adicionada uma nova base.

Ilustrao 108 - Reparao por exciso de base.

A reparao por exciso de nucletidos corrige dmeros de timina e aductos de ADN atravs da remoo de uma poro da cadeia de DNA que contm a leso. Em E.coli existe um sistema, o sistema Uvr, constitudo por 3 protenas (UvrA, UvrB e UvrC) que actua neste sentido. A zona danificada reconhecida por uma protena (UvrA) e outras protenas, as nucleases, clivam ligaes fosdiesters na extremidade 3 e 5 da leso (UvrB e UvrC, respectivamente). Por aco de helicases, so quebradas as pontes hidrognio entre as bases complementares e removido um oligonucletido (com cerca de 12 a 13 bases) que contm a regio Ilustrao 109 - Reparao por exciso de nucletidos. alterada. DNA polimerase I e ligases actuam, de seguida, no sentido de sintetizar correctamente o pedao da cadeia excisado.

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O sistema mismatch repair reconhece e corrige bases no complementares adicionadas nova cadeia de DNA durante o decorrer da replicao. Em E. coli esse sistema, designado sistema MUT, formado por um conjunto de 3 protenas (MutS, MutL e MutH) que reconhecem a cadeia-filha por esta ainda no estar metilada (a metilao ocorre nos resduos de adenina de sequncias GATC). MutS reconhece a base alterada e forma um complexo com as restantes protenas. De seguida, a MutH, uma endonuclease, cliva a nova cadeia (ainda no metilada) no local da sequncia GATC e a MutS e MutL, juntamente com uma helicase e uma endonuclease, removem a cadeia de DNA entre o local de clivagem e a base mal colocada. Posteriormente, polimerases e ligases procedem sntese do DNA em falta.

Ilustrao 110 - Sistema mismatch repair.

XI.

Recombinao do DNA

O genoma de um organismo tem uma enorme plasticidade, facto para o qual contribui a recombinao gentica troca de material gentico. Podem distinguir-se 2 tipos de recombinao: Recombinao homloga entre sequncias de DNA semelhantes homlogas; Site-specific requer homologia localizada e pode ser considerada um subgrupo da recombinao homloga; Recombinao no homloga ou heterloga entre sequncias de DNA no homlogas;

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Transposo elementos genticos (transposes) movem-se ao longo do genoma, sendo inseridos e/ou retirados de diferentes locais. Do ponto de vista biolgico, a recombinao tem diversos papis importantes, dos quais podemos destacar: Gerar novas combinaes de genes/alelos. Ex: crossing-over da meiose; Gerar novos genes. Ex: rearranjo de imunoglobulinas; Integrar elementos de DNA especficos. Ex: vrus; Reparar DNA. Relativamente utilidade prtica deste fenmeno, em biologia molecular utiliza-se recombinao para, por exemplo, mapear genes em cromossomas e criar clulas e organismos transgnicos.

Ilustrao 111 - Recombinao gentica atravs de vrus.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A recombinao homloga requer extensa homologia gentica, ou seja, necessrio que haja uma extensa complementaridade entre os nucletidos de 2 cadeias de cromossomas diferentes, ou mesmo de zonas do mesmo cromossoma que estejam repetidas ou invertidas. Usualmente a recombinao envolve a quebra de duas molculas de DNA na mesma regio, onde as sequncias so muito semelhantes, e a juno de um DNA ao outro, o que resulta num processo de "cross-over". Neste tipo de recombinao o local de troca pode estar localizado em qualquer zona da regio homloga e no implica a alterao do arranjo dos genes nos cromossomas. O processo mediado por enzimas e pode dar-se segundo dois modelos: Recombinao por copy choice d-se durante a replicao, quando duas cadeias de DNA prximas e homlogas esto a ser replicadas simultaneamente e, a dada altura, trocam de cadeia molde; Recombinao por breakage and rejoining (que ocorre com a aco de enzimas) no se d durante o decorrer da replicao e requer que as duas cadeias de DNA homlogas sofram um nick no mesmo local. A partir desses nicks, uma das cadeias de cada molcula parcialmente separada e emparelha com a cadeia da outra molcula que lhe complementar. Em ambos os casos, h o cruzamento de duas cadeias de DNA e a formao de heteroduplexes, regies da molcula de DNA formadas por cadeias de origens diferentes. zona de cruzamento d-se o nome de juno de Holliday e da sua resoluo pode resultar uma recombinao com ou sem alterao de genes.

Ilustrao 112 - Modelos da recombinao homloga.

Aps a formao da juno de Holliday, que pode migrar ao longo da cadeia, as duas molculas rodam em torno do seu ponto de ligao. Dependo do sentido dessa rotao, as cadeias cruzam em direces diferentes e o produto final deste processo pode resultar em heteroduplexes recombinantes ou no recombinantes. Para separar as duas molculas ento necessrio cortar as cadeias cruzadas ao nvel da juno. Se o corte for horizontal ento, aps a ligao das cadeias obtm-se molculas iguais s originais heteroduplexes no-recombinantes. Por outro lado, se o corte for vertical verifica-se a recombinao propriamente dita, pois s neste caso h alterao na composio da cadeia as molculas resultantes so heteroduplexes recombinantes e, caso a regio recombinada seja codificante, o gene pode deixar de ser transcrito ou a sua traduo pode resultar numa protena completamente diferente da protena original.

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Ilustrao 113 - Juno de Holliday e recombinao gentica.

No processo de recombinao homloga intervm enzimas e protenas especficas, como as DNA polimerase e ligase e protenas SSB. Em E.coli, existem dois sistemas principais que tm um papel fundamental na regulao dos mecanismos de recombinao sistema Rec e sistema Ruv. O Sistema Rec constitudo por 4 protenas RecA e complexo RecBCD, e est envolvido nos passos centrais da recombinao homloga. O complexo RecBCD liga-se ao DNA de cadeia dupla (dsDNA) e processa-o, transformando-o em cadeias simples (ssDNA) prontas a serem utilizadas pela RecA. A protena Ilustrao 114 - Aco do complexo RecBCD: RecBCD makes ss RecA tem trs locais especficos de nicks where RecA binds; Heterotrimeric product of recB, recC and recD SOS genes; Complex binds to free end of dsDNA and unwind ligao ao DNA, pelo que comea it in ATP dependent reaction; Cleavage of both DNA strands; por se ligar a ssDNA, formando um After Chi sequence (GCTGGTGG), stops cleaving 3 end. filamento de DNA-protenas, e, de seguida, associa-se tambm a dsDNA. Segue-se o alinhamento das cadeias homlogas e a RecA, custa de ATP, catalisa o emparelhamento da cadeia simples com a sua cadeia complementar proveniente do dsDNA, dando origem a um heteroduplex.

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Ilustrao 115 - Aco da protena RecA.

O Sistema Ruv responsvel pela resoluo das junes de Holliday. A protena RuvA reconhece a juno e recruta a protena RuvB. O complexo RuvAB, que tem actividade de helicase, catalisa a migrao da juno, promovendo a variao da extenso do heteroduplex, e RuvC, que tem actividade de endonuclease, cliva as cadeias cruzadas. DNA ligases actuam no sentido de ligar as cadeias das molculas recombinantes, e termina o processo recombinao. A recombinao site-specific apenas requer homologia de pequenas regies especficas e permite a introduo ou perda de informao gentica. A grande variedade de imunoglobulinas do organismo humano deve-se a fenmenos de recombinao site-specific durante a maturao de linfcitos B e a construo de organismos geneticamente modificados (OMG) pode ser feita utilizando este processo. Na criao de OGMs e tambm em processos de recombinao, por exemplo, entre cromossomas de bactrias e plasmdeos, o que acontece que existem genes flanqueados por informao gentica homloga a uma regio do DNA. Por recombinao, essa informao inserida na molcula. Por outro lado, recombinao entre sequncias homlogas de uma mesma molcula pode levar perda da regio entre essas sequncias.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Os eventos recombinantes podem ser classificados em dois grupos: Recombinao intermolecular entre molculas diferentes; Cross-over simples forma-se uma nica juno de Holliday; Cross-over duplo formam-se duas junes de Holliday; Recombinao intramolecular entre regies da mesma molcula; Repeties directas as sequncias homlogas so exactamente iguais. Implica a perda irreversvel de DNA; Repeties invertidas as sequncias homlogas esto invertidas. Pode resultar na perda de funcionalidade de um gene mas um processo reversvel. Este tipo de recombinao muito utilizada por bactrias patognicas que, ao inverterem as suas sequncias, baralham o sistema imunitrio do hospedeiro.

Ilustrao 116 - Tipos de recombinao.

A produo de flagelina, um agente virulento, por parte das salmonelas um bom exemplo de recombinao intramolecular com repeties invertidas. As bactrias podem produzir, alternadamente, flagelina H1 ou H2 conforme a orientao de uma das suas sequncias, o chamado segmento H. Este segmento flanqueado por duas sequncias invertidas, podendo sofrer inverso por recombinao, e contm o promotor do gene da flagelina H2 e de um repressor do gene da flagelina H1. Quando o segmento H se encontra numa orientao que permite a sua transcrio, produzida H2 e silenciado o gene da H1. Quando ocorre recombinao, o gene de H2 deixa de ser transcrito e passa a ser produzida H1. A alterao do tipo de flagelina produzida pela salmonela permite-lhe resistir mais tempo num organismo pois assim que o sistema imunitrio do hospedeiro j est preparado para combater um tipo de virulncia ela altera o tipo de flagelina produzida, desencadeando uma nova resposta imunitria.

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Ilustrao 117 - Produo de flagelina pelas salmonelas.

A recombinao no homloga no requer qualquer semelhana entre sequncias de DNA, estando antes associada ao movimento de sequncias transposes, ao longo do genoma. Os transposes so encontrados tanto em procariotas como em eucariotas e, em algumas leveduras e protozorios, fazem parte de mecanismos de regulao de genes. As unidades fundamentais dos transposes so as sequncias de insero (IS), sequncias de 800 a 2000 nucletidos que contm um gene que codifica a protena transposase flanqueado por curtas sequncias invertidas repeties invertidas (IR).

Ilustrao 118 Sequncia de insero.

A transposase responsvel por encontrar sequncias especficas de DNA e cortar a molcula nessa zona, separando a dupla-cadeia e deixando as sequncias complementares por emparelhar. Ao nvel dos transposes, esta protena cliva as extremidades da sequncia de insero e junta a IS cadeia previamente cortada. As falhas no DNA resultantes deste processo so reparadas por DNA polimerase e ligase.

Ilustrao 119 - Insero de um transposo.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Destacam-se 2 tipos de mecanismos de transposio: Transposio mediada por DNA; Transposio conservativa o transposo move-se do stio dador para o local alvo; Transposio replicativa uma cpia do transposo inserida no local alvo, mantendo-se o elemento original. A frequncia desta transposio de cerca de 1 em 104 a 107 divises celulares. Transposio mediada por RNA feita uma cpia de RNA do retrotransposo que depois traduzida em DNA e inserida no genoma. Este tipo de transposio ocorre, por exemplo, nos retrovrus como o HIV.

Ilustrao 120 - Transposio conservativa.

Ilustrao 121 - Transposio replicativa.

Ilustrao 122 - Retrotransposio.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular A insero de transposes em locais no especficos do genoma pode interferir com a expresso de genes, o que pode ter consequncias negativas para a clula. No entanto, em algumas leveduras e protozorios, transposes fazem parte de mecanismos de regulao gentica. Alguns transposes mais complexos, como os transposes compostos, so formados por genes flanqueados por sequncias de insero. Esses genes, por exemplo de resistncia a antibitico, podem ser copiados para vrios locais do genoma e contribuir para uma maior resistncia por parte desse organismo.

Ilustrao 123 - Transposo composto.

XII.

Transcrio de DNA

Transcrio o processo atravs da qual se sintetiza RNA a partir da informao contida nos genes da molcula de DNA. Este processo apresenta algumas diferenas nos organismos procariotas e eucariotas e est sujeito a mecanismos de regulao, verificando-se que os genes so transcritos de acordo com as necessidades da clula. O genoma de procariontes constitudo maioritariamente por regies codificantes, isto , regies que contm genes e codificam a sntese de RNA. J nos eucariotas, a maior parte do seu genoma est sob a forma de regies intergnicas regies no codificantes (cerca de 98% do genoma humano so regies no codificantes). Sabe-se actualmente que estas regies, anteriormente sem qualquer funo atribuda e designadas por junk-DNA, tm um papel importante na transcrio. Os genes contm informao para a sntese de vrios tipos de RNA, cujo processo de transcrio o mesmo: RNA mensageiro, mRNA molde utilizado pelos ribossomas para a sntese de protenas; RNA de transferncia, tRNA intermedirio entre mRNA e os aminocidos durante a sntese proteica ao nvel dos ribossomas; RNA ribossomal, rRNA um dos constituintes dos ribossomas. Um gene apresenta 3 regies: Regio promotora onde se encontra o promotor, o local onde a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio essencial ao incio da transcrio mas no transcrito. Tem sequncias especficas em determinados locais as zonas consenso, que so reconhecidas pela polimerase e que tm que ser semelhantes para todos os genes pois nos procariotas s existe uma RNA polimerase (apesar de se verificar a existncia de vrios factores que direccionam a transcrio para locais diferentes, de acordo com as condies a que a clula sujeita).

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Nos procariotas existem duas zonas consenso de 6 nucletidos cada uma, uma na regio -10 e outra na regio -35, respectivamente 10 e 35 nucletidos antes do incio da transcrio propriamente dita, em +1. A regio -10, tambm designada caixa TATA, rica em adenina e timina e, devido natureza mais fraca das suas ligaes, mais sensvel aco das helicases pelo que a cadeia dupla se abre preferencialmente nesta zona. Os promotores dos eucariotas so maiores e mais complexos. A sua caixa TATA encontra-se na posio -25 e outras zonas consenso localizam-se em -50, -75 e -100. Parte estrutural zona transcrita. Encontra-se apenas numa das cadeias e a sua regio complementar, no codificante, denomina-se zona nonsense. Zona de terminao onde a transcrio terminada.

Ilustrao 124 - Promotor de um procariota.

Ilustrao 125 - Promotor de um eucariota.

Na transcrio intervm uma enzima especfica, a RNA polimerase. Esta enzima transcreve a informao contida no DNA para RNA e, semelhana das DNA polimerases, catalisa o crescimento de cadeias de RNA no sentido 5-3. No entanto, no necessita de um primer para iniciar o processo. A RNA polimerase, assim como o processo de transcrio de procariotas e eucariotas apresenta algumas diferenas: A RNA polimerase de E. coli um complexo enzimtico formado por 5 subunidades (duas , , , e ). O factor essencial para o reconhecimento da regio promotora do gene e para a correcta ligao da RNA polimerase ao DNA mas no tem actividade cataltica, libertando-se da enzima quando j se encontram sintetizados alguns nucletidos de RNA; Nos eucariotas existe uma polimerase diferente para cada tipo de RNA (mensageiro, de transferncia e ribossomal) mas todas so complexos formados por 12 a 17 subunidades e partilham algumas caractersticas, tanto entre si como com a polimerase dos Ilustrao 126 - RNA polimerase procaritica. procariotas. Tipo de RNA sintetizado mRNA miRNA tRNA rRNA 5.8S, 18S, RNA polimerase II II III I

Genes nucleares

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular 28S 5S snRNA e scRNA Genes mitocondriais Genes dos cloroplastos

III II e III Mitocondrial Cloroplastos Semelhantes RNA polimerase bacteriana

O processo de transcrio pode ser dividido em 3 fases: Iniciao RNA polimerase liga-se a uma zona no especfica do DNA e migra ao longo da cadeia at encontrar o promotor. A liga-se especificamente s zonas -35 e -10 e, ao nvel da caixa TATA, helicases e girases promovem a abertura da cadeia dupla de DNA ao longo de 12-14 nucletidos. A transcrio iniciada na posio +1 pela adio de 2 NTPs cadeia molde e, aps a polimerizao de cerca de 10 nucletidos no sentido 53, o factor libertado e d-se incio prxima fase. Nota: os nucletidos livres encontram-se na forma de trifosfatos NTPs, pelo que durante a sua polimerizao so libertadas molculas de pirofosfato (dois fosfato); Elongao o crescimento da cadeia de RNA continua. A polimerase mantm-se ligada ao DNA e vai desenrolando a cadeia dupla sua frente e hibridizando a cadeia que deixa para trs, ficando apenas uma regio com cerca de 15 pares de nucletidos na forma de cadeias simples. A transcrio continua at que a polimerase encontre um sinal de terminao; Terminao quando a RNA polimerase encontra a zona de terminao dissocia-se do DNA e o processo de transcrio termina. Existem dois mecanismos diferentes responsveis pela terminao: Dependente de factor , independente da sequncia a terminao est dependente de uma protena, o factor , que se liga a longos segmentos (cerca de 60 nucletidos) no final da molcula de RNA; Independente de factor , dependente da sequncia a zona de terminao formada por duas sequncias invertidas de citosina e guanina, intercaladas por outras bases e seguidas de nucletidos de adenina. A transcrio das zonas ricas em CG leva associao das bases complementares e formao de uma estrutura secundria um gancho de terminao, que destabiliza a ligao da RNA polimerase ao DNA e leva sua dissociao. Para alm do seu papel na terminao da transcrio, os ganchos de terminao desempenham tambm um papel protector: o RNA mensageiro tem um tempo de vida muito curto, sendo rapidamente digerido por RNAses no sentido 3-5. A formao de ganchos de terminao nos terminais do mRNA dificulta a sua digesto por parte dessas enzimas e funciona como uma forma de proteco, permitindo que o RNA se mantenha ntegro o tempo suficiente para que ocorra traduo.

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Ilustrao 127 - Processo de transcrio dos procariotas.

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Ilustrao 128 - Formao de um gancho de terminao.

O processo de transcrio acima descrito diz respeito aos organismos procariotas. Nos eucariotas a estrutura dos promotores e das RNA polimerases diferente, pelo que vo existir algumas diferenas nos mecanismos de transcrio. O reconhecimento do promotor e a ligao da RNA polimerase no esto associados a um factor mas dependem de diversos factores de transcrio factores gerais, comuns transcrio de todos os genes, ou especficos para determinados genes. Os factores de transcrio so, geralmente, protenas que tm uma regio que se liga ao DNA e outra regio que interage com outras protenas e estimula a transcrio. Na iniciao da transcrio, a RNA polimerase II associa-se ao promotor, ao mediador e a outros factores de transcrio, dando origem ao complexo RNA polimerase II/Mediador o complexo de iniciao. A este complexo podem ligar-se ainda estimuladores (enhancers), que so sequncias de DNA que se associam a factores de transcrio que regulam a actividade da RNA polimerase. Os estimuladores situam-se em regies intergnicas que podem estar localizadas em qualquer ponto dos cromossomas, sendo a sua ligao possvel devido existncia de loops na Ilustrao 129 - Factores de transcrio dos eucariotas. molcula de DNA. A transcrio iniciada quando se d a fosforilao dos resduos de serina e treonina do CDT (carboxi terminal domain), uma sequncia de aminocidos que faz parte da RNA polimerase.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Iniciada a transcrio, o complexo de iniciao dissocia-se e o CDT fosforilado permite a ligao de factores de transcrio que intervm na elongao e no processamento de RNA.

Ilustrao 130 - Transcrio dos eucariotas.

Na terminao da transcrio em eucariotas, a RNA polimerase reconhece uma sequncia de terminao e libertada cerca de 10-35 nucletidos depois. As sequncias de terminao, por exemplo AAUAAA, so sempre semelhantes, embora possam no ser exactamente iguais em todos os genes

a. Regulao da Transcrio
O genoma de um organismo contm milhares de genes que no so todos transcritos em simultneo. Existem mecanismos de regulao, tanto em procariotas como em eucariotas, que actuam ao nvel da iniciao ou da elongao no sentido de silenciar ou promover a transcrio de determinados genes, de acordo com as necessidades da clula. Em organismos procariotas a regulao d-se principalmente na etapa da iniciao e pode envolver diversos mecanismos, dos quais iremos estudar dois exemplos: a regulao do opero da lactose e do opero do triptofano em E.coli.

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i.

Opero da lactose

A lactose pode ser degrada em glicose e galactose, molculas de onde extrada energia metablica, por aco de uma enzima especfica, a -galactosidase. Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo da lactose s so sintetizadas quando existe lactose disponvel na clula, evitando assim a sntese de protenas e RNA desnecessrias, pelo que se diz que h regulao da transcrio por induo do substrato. Essa induo pode ser positiva ou negativa.

Ilustrao 131 Degradao da lactose.

Os genes responsveis por esse metabolismo distribuem-se por uma estrutura monocistrnica e por uma estrutura tricistrnica. O opero da lactose, a estrutura tricistrnica, constitudo por um promotor, um operador e por 3 genes que so transcritos em conjunto: Promotor (P) sequncia promotora, local de ligao da polimerase; Operador (O) sequncia qual se pode ligar uma protena reguladora (LacI), que impede a transcrio dos genes do opero; Gene LacZ codifica a -galactosidase, enzima responsvel pela quebra da ligao glicosdica entre a glucose e a galactose. o gene mais importante, apresentando maior afinidade na regio RBS, e o facto de estar na extremidade 5 protege o seu transcrito de mRNA de uma degradao demasiado precoce; Gene LacY codifica a permease, uma protena de membrana especfica para o transporte de lactose para o interior das clulas; Gene LacA codifica a transacetilase, uma protena que modifica a galactose mas que no essencial ao seu metabolismo. o gene menos importante e, por esse motivo, est mais sujeito degradao que os restantes genes. A estrutura monocistrnica consiste em: Promotor (Pi) promotor do gene LacI; Gene LacI gene repressor que codifica uma protena reguladora (LacI). Na ausncia de lactose, LacI liga-se ao operador do opero da lactose e impede a transcrio dos seus genes. Quando h lactose disponvel na clula, esta liga-se protena reguladora LacI, alterando a sua configurao tridimensional. Consequentemente, deixa de existir afinidade entre esta protena e o operador pelo que os genes do opero podem ser transcritos. So sintetizadas as protenas LacZ, LacY e LacA e a lactose degradada. Este tipo de regulao diz-se por induo negativa visto a presena de LacI impedir a transcrio.

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Ilustrao 132 - Na ausncia de lactose, o opero silenciado pela LacI.

Ilustrao 133 - Na presena de lactose, a protena LacI bloqueada e os genes so transcritos.

Apesar de a lactose ser uma fonte de energia, como a glicose um acar mais simples o seu metabolismo mais rpido. Como tal, quando existe glucose disponvel na clula esta vai ser utilizada primeiro e, s quando a glucose se tiver esgotado, que a lactose comea a ser usada como fonte de energia. Na presena apenas de um acar, um grfico do crescimento populacional de uma colnia de bactrias do tipo (1). Mas na presena de dois acares, digamos glucose e lactose, o crescimento do tipo (2) e diz-se um crescimento diauxico. Em (2) verifica-se que as bactrias se dividem exponencialmente para depois o seu crescimento estabilizar (a) medida que o acar mais simples, neste caso a glucose, consumido. Segue-se uma nova etapa de crescimento e estabilizao (b) quando consumido o acar restante, a lactose. Se representssemos os nveis de -galactosidade na clula ao longo do tempo obteramos uma curva do tipo (c).

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Ilustrao 134 - (1) Crescimento normal. (2) Crescimento diauxico. (a) Glucose e lactose disponveis; consumo de glucose. (b) Apenas lactose disponvel; consumo de lactose. (c) Nveis de -galactosidade.

Verifica-se ento que a o opero da lactose reprimido na presena de glucose. Esta represso catablica pela glucose mediada por um mecanismo de induo positiva associado aos nveis de AMP cclico (cAMP adenosina monofosfato cclica): cAMP associa-se a uma protena reguladora, CAP (catabolic activator protein), que se liga a uma sequncia de DNA perto do promotor do opero da lactose. A CAP actua interagindo com a subunidade da RNA polimerase e facilita a sua ligao ao promotor, promovendo a transcrio. Quando os nveis de glucose na clula so baixos h maior produo de cAMP, pelo que favorecido o metabolismo da lactose. Por outro lado, em condies de elevada disponibilidade de glucose, a produo de cAMP baixa e o operador da lactose silenciado.

Ilustrao 135 - Na ausncia de glicose h maior produo de cAMP e o opero da lactose activado.

Resumindo, a regulao da transcrio do opero da lactose uma regulao por induo do substrato: Induo negativa LacI impede a transcrio. Na presena de lactose LacI desactivado e a lactose degrada; Induo positiva CAP promove a transcrio do opero. Na presena de glucose cAMP no activa o CAP e no h degradao da lactose.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Lactose Lactose+Glucose LacI inactivado LacI inactivado cAMP-CAP funcional cAMP-CAP no funcional Elevada transcrio do opero Baixa transcrio do opero Em engenharia gentica comum utilizar-se o promotor do opero da lactose (Plac) para clonar genes de interesse em plasmdeos, pois para iniciar a transcrio basta fornecer lactose clula. No entanto, em vez de lactose utiliza-se uma molcula sinttica anloga lactose mas no metabolizvel, IPTG (IsoPropilTrioGalactosdeo), que inibe o repressor LacI mas no consumida pela clula, o que torna o processo mais rentvel e igualmente eficaz.

ii.

Opero do triptofano

A regulao da transcrio do opero do triptofano pode ser generalizada para os restantes aminocidos e uma regulao por represso do produto final pois, ao contrrio do opero da lactose que est sempre silenciado na ausncia do substrato, o opero do triptofano est sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminocido abunda na clula. A represso da transcrio requer dois elementos: Apo-repressor protena que por si s no capaz de se ligar ao operador e inibir a transcrio. Necessita de um co-repressor para adquirir a sua forma activa; Co-repressor elemento que se liga ao apo-repressor, activando o complexo repressor e inibindo a transcrio. Neste caso, o co-repressor o prprio triptofano. O opero do triptofano uma estrutura pentacistrnica que apresenta regies especficas: Promotor (P) regio promotora, local de ligao da polimerase; Operador (O) tal como no opero da lactose, uma sequncia qual se podem ligar protenas reguladoras que impedem a transcrio dos genes do opero; Regio R (R) codifica o apo-repressor; Regio Lder (L) e regio do Atenuador (A) localizadas entre o promotor/operador e os genes. Participam na regulao da transcrio por um mecanismo diferente do repressor, o mecanismo de atenuao; Genes E, D, C, B, A codificam as protenas que intervm na sntese de triptofano.

Ilustrao 136 - Situao de ausncia do triptofano.

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Ilustrao 137 - Situao de presena de triptofano.

Para alm da regulao por um complexo repressor existe um outro mecanismo que controla a transcrio de triptofano. Este mecanismo, associado s regies L e A, de regulao por atenuao e permite que a transcrio seja inibida mesmo quando a quantidade de triptofano na clula no suficiente para activar o apo-repressor ou quando este mecanismo no eficaz. Se no houve represso ao nvel do operador inicia-se a transcrio das regies L e A. O RNA resultante pode ser dividido em 4 zonas 1 (L) e 2, 3 e 4 (A), ricas em contedo CG e que tendem a formar ganchos. Dependo dos ganchos que se formam pode ou no ocorrer transcrio: Gancho 2-3, gancho de anti-terminao: este gancho forma-se relativamente longe da RNA polimerase, no a destabilizando, pelo que a transcrio dos genes continua; Gancho 3-4, gancho de terminao: a sua formao destabiliza a RNA polimerase e provoca a sua dissociao do DNA, interrompendo a transcrio. A quantidade de triptofano disponvel na clula que vai determinar o tipo de gancho que se forma.

Ilustrao 138 - Ganchos que se podem formar.

Logo aps a transcrio inicia-se a traduo da regio L no chamado pptido Lder. Este pptido formado por 14 aminocidos e na posio 11 e 12 requer a introduo do triptofano. De acordo com a quantidade de Trp disponvel duas situaes so possveis:

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Se a concentrao de Trp elevada a traduo rpida, o que apenas permite a formao de um gancho 3-4. A transcrio pra e no sintetizado Trp, que existe em abundncia; Se existe carncia de Trp a traduo mais demorada e as zonas 2, 3 e 4 ficam livres para se associarem entre si. Como o gancho 2-3 mais forte forma-se preferencialmente, implicando a continuao da transcrio e a posterior sntese de triptofano. A regulao por atenuao exclusiva dos procariotas pois implica que a transcrio e a traduo ocorram em simultneo, o que no se verifica em organismos eucariotas.
Ilustrao 139 - Formao de ganchos consoante a ausncia ou presena de triptofano.

Ilustrao 140 - Diferentes tipos de controlo positivo e negativo da transcrio.

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iii.

Regulao em eucariotas

Como nos organismos eucariotas no existem estruturas policistrnicas nem ocorre transcrio e traduo em simultneo, os mecanismos reguladores j descritos s se aplicam a seres procariotas. Nos eucariotas existem inmeros factores de transcrio e estimuladores, como j foi visto anteriormente, e vrios mecanismos, como a metilao, que regulam o processo de transcrio. Metilao a adio de grupos metilo no carbono-5 de resduos de citosina que precedem uma guanina, as chamadas ilhas CpG. As enzimas responsveis pela metilao so as metilases e as deacetilases catalisam o processo inverso. A regulao da transcrio d-se pela presena ou ausncia de metilao do promotor de um gene: quando o promotor se encontra metilado verifica-se que a transcrio inibida; se o promotor no est metilado ento a transcrio decorre normalmente.

Ilustrao 141 - Processo de metilao das ilhas CpG.

Nos eucariotas necessria a interaco com vrias protenas e entre diferentes regies do cromossoma para que ocorra a transcrio. No entanto, o DNA encontra-se muito compactado e associado a protenas, as histonas, o que pode comprometer a sua disponibilidade para a transcrio. O DNA precisa ento de ser uma estrutura compacta, para que se possa concentrar no ncleo da clula, mas simultaneamente dinmica, de modo a permitir a transcrio. O genoma dos eucariontes est concentrado no ncleo e organizado em cromossomas. Os cromossomas s se encontram individualizados durante a diviso celular, chamando-se cromatina sua forma indiferenciada. A unidade bsica da cromatina so os nucleossomas, sequncias de cerca de 200 nucletidos enroladas em torno de um conjunto de protenas, as histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). A cadeia dupla de DNA d duas voltas em torno de dois discos de 4 histonas (H2A, H2B, H3 e H4) empilhados e ligados lateralmente por uma outra histona (H1). Os nucleossomas so depois compactados e, no seu conjunto, podem apresentar-se na forma de:

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Eucromatina contm genes e sequncias que participam na transcrio. No est demasiado compactada; Heterocromatina contm apenas regies no codificantes (por exemplo, a regio do centrmero) e est extremamente compactada. A descompactao da cromatina est associada acetilao (adio de grupos acetil Ac) das histonas e demetilao do DNA. Por outro lado, a compactao da cromatina acompanhada pela metilao do seu DNA e pela desacetilao das histonas.

Ilustrao 142 - Nucleossoma.

Ilustrao 143 - Condensao da cromatina.

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Ilustrao 144 - A descondensao da cromatina permite a transcrio.

XIII.

Processamento de RNA

Aps a sua transcrio, os RNAs sofrem processamento antes de adquirirem a sua forma funcional. rRNAs e tRNAs de procariotas e eucariotas so processados, em contraste com os mRNAs, em que os nicos sujeitos a este processo so provenientes de organismos eucariotas.

a. Processamento de tRNA
Os aminocidos so adicionados s protenas durante a traduo por intermdio de RNA de transferncia. Como existem 20 aminocidos tm que existir, pelo menos, 20 tRNAs. Na realidade verifica-se que, conforme a espcie, existem 60 a 80 molculas diferentes de RNA de transferncia, o que indica que um mesmo aminocido pode ser transportado por vrios tRNAs. Cada molcula de tRNA codificada por um gene diferente e da sua transcrio resulta uma sequncia de nucletidos, pr-tRNA, que se organiza numa estrutura secundria caracterstica. Essa estrutura, comum ao pr-tRNA e ao tRNA, em forma de trevo devido s ligaes hidrognio que se estabelecem entre bases complementares e levam formao de ganchos. Por ser muito estvel, permite ao RNA ter um tempo de vida na clula bastante longo. O processamento do pr-tRNA leva sua maturao em RNA e sua activao. O processamento tem duas fases, sendo que em algumas molculas de pr-tRNA ainda necessrio clivar previamente sequncias nos seus terminais, processo levado a cabo pela enzima RNase P. O processamento engloba ento 2 fases sucessivas: Adio de uma sequncia CCA ao terminal 3. Nalguns casos esta sequncia codificada no prprio gene do RNA de transferncia, mas noutros casos tem que ser colocada por aco de uma enzima. neste local que posteriormente se vai ligar covalentemente o aminocido;

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Alterao de bases. Aproximadamente 10% das bases de nucletidos em posies especficas so modificadas. O papel desta modificao ainda no foi bem esclarecido.

Ilustrao 145 - Processamento do tRNA.

Aps o processamento ainda necessrio activar o tRNA, passando este a ser designado aminoacil tRNA. A activao d-se pela ligao de um aminocido ao terminal 3, reaco com gasto de ATP e mediada pela enzima aminoacil tRNA sintetase. Existe uma enzima para cada aminocido, verificando-se que a activao de diferentes tRNAs que transportam o mesmo aminocido feita pela mesma enzima.

Ilustrao 146 - Activao do tRNA.

Uma vez activado, o tRNA pode seguir para os ribossomas e intervir na sntese proteica. A sequncia de 3 nucletidos, anti-codo, que permite o reconhecimento do codo de mRNA e a adio do aminocido correcto, oposta ao local de ligao do aminocido, localizando-se no terminal de um dos ganchos da molcula de tRNA.

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Ilustrao 147 - tRNA final.

b. Processamento de rRNA
Os ribossomas, locais onde ocorre a sntese proteica, so formados por rRNA e protenas ribossomais. Cada ribossoma tem duas subunidades, uma subunidade pequena e outra grande, formadas por diferentes rRNAs que so caracterizados pelo seu coeficiente de sedimentao (S). Tambm os prprios ribossomas se caracterizam por este coeficiente. Ser Tipo de Ribossoma Tipo N de Protenas rRNA constituintes Tipo N de Protenas rRNA constituintes Procariota 70S 30S 21 16S (1540 nucletidos; este rRNA tem valor taxonmico e utilizado para determinar, por exemplo, a espcie de bactrias) 50S 34 5S (120 nucletidos) e 23S (2900 nucletidos) Eucariota 80S 40S 33

Subunidade pequena

18S (1900 nucletidos) 60S 49 5S (120 nucletidos), 5.8S (160 nucletidos) e 28S (4700 nucletidos)

Subunidade grande

Ilustrao 148 - Ribossomas de procariotas e eucariotas.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular No processamento de rRNA d-se a clivagem do transcrito de pr-rRNA nas sequncias finais. Nos procariotas essa clivagem feita em simultneo para os 3 rRNAs mas nos eucariotas, para alm de o 5S ser codificado separadamente, o transcrito que contm as restantes sequncias primeiro divido em duas molculas precursoras uma que contm apenas 18S e outra onde se encontram 5.8S e 28S, e s depois que estas so clivadas dando origem ao produto final. Posteriormente, o rRNA 5.8S liga-se ao 28S atravs de pontes hidrognio.

Ilustrao 149 - Processamento de rRNA de procariotas.

Ilustrao 150 - Processamento de rRNA de eucariotas.

c. Processamento de mRNA
Nos procariotas, o mRNA est pronto a ser traduzido logo aps a transcrio. J nos organismos eucariotas, o transcrito de pr-mRNA sintetizado no ncleo ainda vai sofrer extensas modificaes at poder ser utilizado no processo de traduo. O processamento de mRNA de eucariotas ocorre no ncleo e inclui: Capping em 5 adio ao terminal 5 de um nucletido com uma base modificada, m7G 7-metilguanina. neste terminal que se vo ligar os ribossomas para que se d a traduo completa do mRNA; Poliadenilao adio de nucletidos de adenina ao terminal 3 e formao de uma cauda poli-A de comprimento varivel (pode atingir as 300 bases). Para alm de regular mecanismos de traduo e estabilidade, esta cauda tem ainda um papel protector na medida em que atrasa a digesto do RNA pela RNase, permitindo assim que a sua sequncia codificante se mantenha ntegra durante um perodo de tempo maior.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Nota: a poliadenilao no um processo exclusivo dos eucariotas, tendo-se vindo a verificar que tambm ocorre em alguns mRNAs de procariotas; Splicing remoo de intres e colagem de exes intres so sequncias que no codificam para o mRNA final, em oposio ao exes, que codificam informao para o mRNA maduro. Ocorre em grandes complexos, os spliceossomas, formados por protenas e pequenos RNAs nucleares (snRNA). Os snRNAs reconhecem sequncias nos locais de splicing do pr-mRNA e catalisam a reaco de splicing. A maioria dos genes de eucariotas contm mltiplos intres pelo que possvel juntar exes em diferentes combinaes atravs de mecanismos de splicing alternativo. Estes mecanismos, muito importantes na regulao da expresso gentica, permitem ainda que intres passem a ser considerados exes, no sendo removidos e permitindo novas combinaes.

Ilustrao 151 - Processamento do mRNA.

Ilustrao 152 - Splicing alternativo.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

XIV.

Traduo de RNA

Traduo o processo que, ao nvel dos ribossomas, permite a sntese de protenas a partir de mRNA. Os mecanismos de sntese so semelhantes nos procariotas e eucariotas, embora existam algumas diferenas, nomeadamente na iniciao da traduo e no nmero de protenas traduzidas a partir do mesmo mRNA. O mRNA de eucariotas monocistrnico, ou seja, apenas contm informao para a sntese de uma protena. J o mRNA de procariotas pode ser policistrnico, o que significa que pode albergar informao para a sntese de vrias protenas. sequncia de genes contemplados no mesmo RNA, do qual resulta um mRNA policistrnico, d-se o nome de opero. Nos terminais do mRNA, tanto de procariotas como de eucariotas, existem regies no traduzidas (UTR unstranslated regions) que podem conter informao necessria iniciao e terminao da traduo.

Ilustrao 153 - mRNA monocistrnico e policistrnico.

O processo de traduo pode ser divido em 3 fases iniciao, elongao e terminao:

Ilustrao 154 - Processo de traduo.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Iniciao as subunidades pequenas dos ribossomas ligam-se aos locais de iniciao do mRNA e quando encontrado o codo de iniciao (metionina AUG) liga-se a subunidade grande e forma-se um complexo funcional. A iniciao depende de diversos factores de iniciao, tanto nos eucariotas como nos procariotas, embora os locais de iniciao sejam diferentes para cada um dos casos. Nos eucariotas, os ribossomas ligam-se ao terminal 5 do mRNA, que reconhecido por ter a base modificada 7-metilguanina, e migram at encontrarem o codo de iniciao. A eficincia da iniciao afectada pela sequncia que rodeia o codo de iniciao que, em certos casos, pode no ser reconhecido. Nos procariotas, como no existe cap em 5, os locais de iniciao so sequncias especficas que precedem o codo de iniciao, as chamadas sequncias Shine-Dalgarno (SD) ou ribossome binding-site (RBS). Estas sequncias esto presentes antes da informao para a traduo de qualquer protena, mesmo nos mRNAs poliscistrnicos, e so complementares de uma regio do rRNA 16S que constitui a subunidade pequena dos ribossomas procariotas. A maior ou menor afinidade do rRNA com as sequncias SD traduz-se numa maior ou menor traduo, respectivamente, da protena em questo. Deste modo possvel que num mRNA poliscistrnico o balano final das vrias protenas produzidas possa no ser o mesmo. De um modo semelhante, as protenas mais longe do terminal 3 (por onde comea a degradao por parte das RNases) tm maior probabilidade de serem traduzidas;

Ilustrao 155 - Iniciao do processo de traduo.

Elongao a cadeia polipeptdica cresce pela sucessiva adio de aminocidos. A traduo inicia-se pelo terminal N (amina) da protena e segue at ao seu terminal C (carboxilo). O mecanismo de elongao muito semelhante em procariotas e eucariotas. subunidade pequena dos ribossomas encontra-se ligado o mRNA (a ligao corresponde a 9 nucletidos, 3 codes) e a subunidade grande tem 3 locais de ligao para tRNA activado, os locais APE: Local A aminoacyl onde se liga o aminoacil-tRNA que contm o aminocido a ser adicionado ao pptido em crescimento; Local P peptidyl local onde se encontra ligado o peptidil-tRNA, isto , o tRNA cujo aminocido j se encontra ligado ao pptido em formao; Local E exit local de sada.
Ilustrao 156 - Locais APE do ribossoma.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Quando o ribossoma atinge o codo de iniciao liga-se um tRNA de metionina ao codo iniciador e recrutada a subunidade grande do ribossoma. Formado o complexo, o tRNA de metionina encontra-se no local P e o local A fica vazio. O tRNA complementar do prximo codo ocupa ento o local A, forma-se uma ligao peptdica entre os aminocidos adjacentes e o tRNA iniciador muda-se para o local E, sendo depois expulso. No ribossoma, o mRNA desloca-se 3 nucletidos no sentido 5-3, ou seja, desloca-se um codo, levando a que o segundo tRNA passe para o local P e que o local A fique livre para a ligao de outro tRNA. Este processo repete-se at que seja encontrado um codo stop e a sntese da protena termine.

Ilustrao 157 - Processo de traduo.

Os ribossomas podem existir livres ou associados ao retculo endoplasmtico rugoso. Muitas vezes uma protena traduzida longe do local onde actua pelo que se torna necessrio proceder ao seu transporte. Nalguns casos, o mRNA codifica uma sequncia sinal no terminal amina (N) que no tem actividade cataltica e que participa no transporte da protena, sendo libertada assim que esta atinge o seu destino final.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 158 - Sequncia sinal no terminal amina que libertada quando a protena chega ao destino.

Assim que um ribossoma se afasta do local de iniciao um outro ribossoma pode ligar-se e dar incio traduo de mais uma protena. assim possvel que um mesmo mRNA seja traduzido em simultneo por vrios ribossomas, que esto usualmente espaados de cerca de 100 a 200 nucletidos, e a cujo grupo se d o nome de polissomas. Durante a traduo, a cadeia polipeptdica que vai sendo sintetizada fica sujeita a interaces entre os seus aminocidos constituintes. Como a configurao final de uma protena funcional influenciada pela sua sequncia total de aminocidos e pelo meio em que se encontra, para prevenir a formao de estruturas tridimensionais antes de ser terminada a traduo e antes de a protena ter sido transportada para o seu local de aco, um conjunto de protenas estabilizam a sequncia linear de aminocidos. Quando a cadeia polipeptdica j foi toda sintetizada e j se encontra no local em que necessria, essas protenas, os chaperes, dissociam-se da cadeia e permitem ento que a protena adquira a configurao tridimensional que a torna funcional.

Ilustrao 159 - Chaperes.

Terminao encontrado um codo stop e a sntese termina. A protena libertada e o ribossoma dissocia-se. No existem tRNAs com anti-codes complementares aos codes stop. Quando se atinge um codo stop este reconhecido por factores de terminao, que so protenas que se ligam ao

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular local A e estimulam a hidrlise da ligao peptdica entre o pptido at a sintetizado e o tRNA no local P. A protena ento libertada, assim como as subunidades do ribossoma e o tRNA.

Ilustrao 160 - Terminao.

A informao para a ordenao dos aminocidos est contida nos genes, existindo um cdigo de correspondncia cdigo gentico entre as 4 letras do RNA e os 20 aminocidos conhecidos. Ao conjunto de 3 nucletidos, tripleto, necessrios para a sntese de um aminocido, chama-se codogene (DNA), codo (mRNA) e anti-codo (tRNA). O cdigo gentico apresenta diversas caractersticas: Universal comum a quase todas as clulas; No ambguo a um tripleto de nucletidos corresponde apenas um aminocido; Redundante/degenerado vrios codes podem sintetizar um mesmo aminocido. A degenerescncia do cdigo gentico vai de 1 a 6 (aminocido arginina est associado a 6 codes diferentes); O terceiro nucletido no to especfico. A degenerescncia d-se muitas vezes na terceira base; O tripleto AUG tem uma dupla funo codifica o aminocido metionina e ao mesmo tempo um codo de iniciao. Podem existir outros codes de iniciao mas a metionina o mais comum; Os tripletos UAA, UGA e UAG so codes de finalizao ou codes stop no codificam qualquer aminocido e sinalizam o fim da sntese proteica. Aminocidos cido Asprtico cido Glutmico Codificao GAT, GAC Aminocidos Glicina Codificao GGG, GGA, GGC, GGT Aminocidos Prolina Codificao CCT, CCC, CCA, CCG AGT, AGC, TCT, TCC, TCA, TCG TAT, TAC

GAA, GAG

Glutamina

CAA, CAG

Serina

Alanina

GCT, GCC, GCG, GCA AGG, AGA, CGT, CGC, CGA, CGG

Histidina

CAT, CAC

Tirosina

Arginina

Isoleucina

ATT, ATC, ATA TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG

Treonina

ACT, ACC, ACA, ACG

Asparagina

AAT, AAC

Leucina

Triptofano

TGG

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular GTT, GTC, GTA, GTG TAA, TAG, TGA

Cistena

TGT, TGC

Lisina

AAG, AAA

Valina

Fenilalanina

TTT, TTC

Metionina

ATG

Stop

Ilustrao 161 - O processo de expresso gentica: Transcrio, Processamento e Traduo.

XV.

Ciclo Celular

O conjunto de transformaes sofridas por uma clula desde a sua formao at sua diviso conhecido como ciclo celular. Este processo, comum a todos os organismos vivos, inclui perodos de desenvolvimento (interfase) e perodos de diviso (fase mittica). Durante a diviso celular uma clula-me origina duas clulas-filhas geneticamente iguais a si. O seu DNA duplicado e os organelos, enzimas e outros constituintes da clula so repartidos pelas duas clulas-filhas. Interfase perodo compreendido entre o final da diviso celular e o incio da diviso seguinte. Corresponde a 90% da vida da clula e um perodo de intensa actividade biossinttica, verificando-se o crescimento e duplicao do contedo celular, incluindo o seu DNA. Nesta fase os cromossomas no so visveis ao microscpio ptico. A interfase engloba ainda 3 perodos diferentes:

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Intervalo G1 ou ps-mittico caracterizado por uma intensa actividade biossinttica havendo a formao tanto de protenas, enzimas e RNA, como de organitos celulares. Est compreendido entre o fim da mitose e o incio da replicao do DNA. A clula passa a maior parte do seu tempo de vida neste estado; Perodo S ou perodo de sntese de DNA d-se a replicao do DNA e cada cromossoma passa a ser constitudo por dois cromatdeos ligados por um centrmero; Intervalo G2 ou pr-mittico d-se essencialmente a sntese de biomolculas necessrias diviso celular, como fibras e o fuso acromtico. Este perodo, compreendido entre o final da replicao do DNA e o incio da diviso celular, corresponde a um grande crescimento celular. Fase mittica fase em que se d a diviso celular, engloba duas etapas mitose e citocinese: Mitose tambm chamada de cariocinese; perodo correspondente diviso do ncleo. Est dividido em 4 subfases: Profase Nesta etapa, a mais longa da fase mittica, a cromatina condensa-se gradualmente em cromossomas (DNA associado a protenas, diferentes entre eucariotas e procariotas) bem definidos. Cada cromossoma agora composto por dois cromatdeos unidos pelo centrmero, uma sequncia especfica de DNA qual se liga um disco proteico, o cinetocoro. Os dois centrolos (nas clulas animais) ou o citoesqueleto (nas clulas vegetais) presentes na clula comeam a afastar-se em sentidos opostos e do origem ao fuso acromtico ou mittico, constitudo por um sistema de microtbulos proteicos que se agregam para formar fibrilhas. Os centrolos dirigem-se para os plos e o invlucro nuclear e os nuclelos desagregam-se; Metafase fase mais curta em que os cromossomas atingem a condensao mxima e os pares de centrolos esto nos plos da clula. Algumas fibrilhas do fuso acromtico ligam-se aos cromossomas e estes dispem-se com os centrmeros no plano equatorial e os braos para fora, formando a chamada placa equatorial; Anafase os dois cromatdeos separam-se e passam a constituir dois cromossomas independentes que migram para cada um dos plos da clula, processo chamado ascenso polar. No final desta fase, os dois plos da clula contm molculas de DNA equivalentes e a clula comea a alongar-se; Telofase a separao dos dois conjuntos de cromossomas finalizada pela formao da membrana nuclear. O fuso acromtico desaparece e os cromossomas relaxam novamente, tornando-se indistintos. O nuclolo reconstitudo e cada ncleo entra na interfase. Citocinese perodo correspondente diviso do citoplama e individualizao das duas clulas-filhas. Nas clulas animais a separao das clulas ocorre por estrangulamento da membrana. No entanto, nas clulas vegetais, devido existncia de parede celular, isso no possvel. O complexo de Golgi liberta lamelas/vesculas que se alinham na regio equatorial e se fundem formando a membrana plasmtica. Posteriormente, vo depositar-se, nessa mesma membrana, fibras de celulose que vo dar origem parede celular. Durante o ciclo celular pode no ocorrer citocinese e as clulas passam a ser polinucleadas, dizendo-se que tm uma estrutura cenoctica ou que formam sacos de ncleos. Alguns tipos de glbulos brancos e clulas do msculo cardaco podem apresentar estas estruturas e durante o desenvolvimento embrionrio comum a citocinese no conseguir acompanhar a diviso nuclear. Nota: nos procariotas a diviso celular uma fisso binria.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 162 - Fases da mitose.

Ilustrao 163 - Citocinese vegetal.

A quantidade de DNA existente na clula vai variando ao longo do ciclo celular. Durante a Interfase, no perodo S, a replicao do DNA faz com que a sua quantidade aumente de Q para 2Q. Quando se d a Anafase essa quantidade volta a ser reduzida de 2Q para Q. Um ser humano possui 23 pares de cromossomas, que constituem o seu caritipo.
Ilustrao 164 - Quantidade de DNA ao longo das vrias fases do ciclo celular.

Um cromossoma caracteriza-se pelo seu comprimento, padro de bandas e posio do centrmero.

Meiose o processo de diviso nuclear atravs do qual se formam 4 ncleos haplides (n) a partir de uma clula diplide (2n). O nmero de cromossomas da clula reduzido para metade pelo que a meiose tambm pode ser chamada de reduo cromossmica. A meiose, tal como a mitose, precedida pela replicao do DNA dos cromossomas. A esta replicao seguem-se duas divises consecutivas. A primeira diviso chama-se diviso reducional, ou diviso I, e a segunda diviso tem por nome diviso equacional, ou diviso II. Estas divises do origem a 4 clulas diferentes entre si, cada uma das quais com metade do nmero de cromossomas da clula inicial. Interfase semelhante interfase descrita para a mitose. Precede a diviso I e, durante o perodo S, d-se a replicao do DNA. No final desta fase cada cromossoma constitudo por dois cromatdeos. 2 Diviso I nesta diviso, um ncleo diplide (2n) origina dois ncleos haplides (n). Como ocorre uma reduo no nmero de cromossomas, esta diviso tambm designada diviso reducional. Profase I a etapa mais longa e complexa. Os cromossomas condensam e os cromossomas homlogos emparelham, juntando-se gene a gene. Ao par de homlogos tambm se chama bivalentes ou ttradas cromatdicas. Durante o emparelhamento surgem pontos de cruzamento entre dois cromatdeos irmos, os chamados pontos de quiasma ou sinapses. Pode ocorrer rotura de

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular cromatdeos e trocas recprocas de segmentos de DNA, fenmeno que se designa crossing-over. Os centrolos migram para os plos da clula e o invlucro nuclear desintegra-se; Metafase I os bivalentes ligam-se a microtbulos do fuso acromtico pelos Ilustrao 165 - Ponto de quiasma. centrmeros e os pontos de quiasma localizam-se no plano equatorial do fuso acromtico. A orientao de cada par d-se ao acaso; Anafase I os dois cromossomas homlogos de cada bivalente separam-se e migram aleatoriamente para plos opostos da clula; Telofase I Em cada plo da clula constitui-se um ncleo haplide (n) cujos cromossomas apresentam dois cromatdeos. Os cromossomas descondensam, tornando-se mais finos e mais longos. O fuso acromtico desaparece e o invlucro nuclear reorganiza-se. Em alguns casos, segue-se a citocinese e formam-se duas clulas haplides. Pode ou no existir uma Interfase entre a diviso reducional e a diviso equacional mas, em qualquer dos casos, no se verifica a replicao do material gentico. Diviso II nesta diviso ocorre a separao de cromatdeos, obtendo-se assim, quatro ncleos haplides (n), cujos cromossomas so constitudos por um nico cromatdeo. Pelo facto de se manter o nmero de cromossomas, esta diviso tambm designada de diviso equacional. Esta diviso da meiose em tudo muito semelhante diviso celular por mitose: Profase II Os cromossomas constitudos por dois cromatdeos tornam-se mais grossos e curtos. Organiza-se o fuso acromtico e o invlucro nuclear desaparece; Metafase II Os cromossomas no seu mximo encurtamento dispem-se com os centrmeros na zona equatorial do fuso acromtico; Anafase II Os dois cromatdeos de cada cromossoma separam-se pelo centrmero, passando a constituir cromossomas independentes, e migram para plos opostos da clula; Telofase II Os cromossomas descondensam, tornando-se mais finos e longos. Organiza-se o invlucro nuclear e formam-se ncleos haplides. D-se a individualizao das clulas e a partir de uma clula diplide formam-se quatro clulas haplides.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 166 - Diviso I da meiose.

Ilustrao 167 - Diviso II da meiose.

A quantidade de DNA das clulas varia ao longo da meiose. Durante a interfase que precede a diviso I d-se a replicao do DNA, passando a sua quantidade para o dobro 2Q para 4Q. Na Anafase I, devido separao dos cromossomas homlogos, a quantidade de DNA diminui para 2Q. Na Anafase II, devido separao dos cromatdeos, o DNA volta a diminuir para metade, passando agora de 2Q para Q. As mutaes cromossmicas do-se precisamente durante a meiose, podendo
Ilustrao 168 - Quantidade de DNA ao longo da meiose.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular acontecer em diversas etapas: Durante a diviso I, pela no disjuno dos cromossomas homlogos; Durante a diviso II, pela no separao dos cromatdeos; Quando ocorre crossing-over. Mitose 1 2 No ocorre Igual No ocorre Igual Anafase Crescimento e reparao de estruturas do organismo; reproduo assexuada com criao de clones em seres unicelulares Meiose 2 4 Ocorre Metade Ocorre Diferente Anafase II Produo de gmetas ou esporos para a reproduo sexuada

N de divises N de ncleos formados Emparelhamento de cromossomas homlogos N de cromossomas das clulas filhas em relao s clulas me Crossing-over Informao gentica das clulas filhas em relao s clulas me Diviso do centrmero Funo

A durao do ciclo celular varia com o tipo de clula: Clula embrionria ciclo com durao inferior a 20 minutos; Clula da pele estas clulas dividem-se regularmente ao longo da vida; ciclo com durao de 12 a 24 horas; Clula do fgado apesar de ter capacidade para se dividir, reserva essa capacidade; divide-se 1 a 2 vezes por ano; Neurnios e clulas musculares depois de maduras no se dividem mais; esto permanentemente em fase G0. A progresso do ciclo celular regulada por factores externos e internos, como o tamanho da clula, a quantidade de nutrientes disponvel, a presena de factores de crescimento, etc. Por exemplo, para que uma clula se divida necessrio haver um suporte (a clula possui touch sensors) e necessria uma densidade celular baixa pois, perante uma sobrelotao celular, no ocorrero divises.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 169 - Factores de crescimento.

Um dos mecanismos de regulao est associado acumulao e degradao cclica de ciclinas durante o ciclo celular. Existem vrios tipos destas protenas, designadas ciclina A a ciclina H, cada uma dedicada a uma etapa do ciclo celular, que so sintetizadas e degradadas por protelise ao longo do ciclo.

Ilustrao 170 - Variao da quantidade e tipo de ciclinas ao longo do ciclo celular.

As ciclinas podem associar-se a enzimas com actividade fosforilativa, as cinases Cdk (cyclindependent kinases), de modo a formarem o complexo MPF maturation promoting factor, que promove a entrada da clula na fase mittica. Quando se associam s Cdks, as ciclinas ajudam a direccion-las para as protenas alvo. A associao de uma ciclina B, sintetizada durante a fase G2, a uma cinase Cdk1 (inactiva) leva formao de um complexo Cdk1/ciclina B (MPF) e fosforilao de determinados resduos de treonina (14 e 161) e de tirosina (15). A fosforilao de tri-14 e tir-15 provoca uma inibio da enzima e impede que esta entre prematuramente em mitose. Segue-se a desfosforilao desses resduos, ficando apenas fosforilado o resduo de tri-161. Esta uma fosforilao activadora, verificando-se que activa o complexo MPF e despoleta a desagregao da membrana nuclear, a reorganizao do citoesqueleto e a condensao dos cromossomas, permitindo assim a entrada da clula na fase mittica. Terminada essa fase, a ciclina dissociase da Cdk1 e destruda por protelise. A cinase desfosforilada e a clula inicia a citosinese e a interfase. Diferentes ciclinas podem associar-se mesma Cdk, consoante a fase do ciclo celular em que a clula se encontra.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 171 - Complexo Cdk1/ciclina B que induz a entrada da clula na fase mittica.

Durante o ciclo celular existem pontos de controlo durante os quais a clula verifica o seu estado e coordena os eventos que ocorrem em cada fase, prevenindo que a clula passe para uma fase se os eventos da fase anterior ainda no terminaram ou no ocorreram de forma correcta. Alguns mecanismos de regulao actuam nos perodos G1, S e G2 e na fase mittica: No final do perodo G1 diversos mecanismos verificam se existe DNA danificado e, em caso afirmativo, procedem sua reparao para que a clula possa entrar no perodo S e iniciar a replicao do seu DNA. Mesmo que o DNA no se encontre danificado algumas clulas podem no iniciar o perodo S, permanecendo num estado de latncia designado estado G0. O tempo de permanncia nesse estado muito varivel e, em alguns casos, como nos neurnios e fibras musculares de um indivduo adulto, podem mesmo no reiniciar o ciclo celular; Durante o perodo S h monitorizao contnua do DNA replicado de modo a que qualquer mutao, base incorrecta ou replicao incompleta seja reparada antes da diviso celular; No final do perodo G2 h outro momento de controlo em que se verifica a integridade do DNA replicado. Se a replicao do DNA foi completa e bem sucedida prossegue-se para a mitose; Na fase mittica verifica-se se o fuso acromtico est correctamente formado e se os cromossomas esto alinhados na placa equatorial, podendo ser divididos igualmente entre as duas clulas filhas.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 172 - Pontos de controlo do ciclo celular.

Em resposta s deficincias encontradas durante os pontos de controlo, o ciclo celular e a replicao do DNA de uma clula podem ser inibidos. Por exemplo, quando o DNA se encontra danificado verifica-se o aumento de um factor de transcrio, o p53, que induz a transcrio do gene p21. Este gene, por sua vez, permite a sntese de protenas que se ligam s cinases e ao complexo MPF, inibindo o ciclo celular e a replicao de DNA.

Ilustrao 173 - Aco do factor de transcrio p53 na inibio do ciclo celular e da replicao do DNA.

As mutaes em alguns genes podem conduzir ao aparecimento de cancro: Os proto-oncogenes so genes normais que, atravs de mutaes, passam a ter a capacidade de promover o aparecimento de cancro. Um exemplo o gene RAS, que activa as ciclinas e que, quando se encontra desregulado, estimula o crescimento celular excessivo.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular Existem genes supressores de tumores que inibem a diviso celular. Quando so desligados podem levar ao aparecimento de cancro pois as clulas danificadas no deixam de sofrer diviso, acumulando mais erros e originando clulas cancergenas. Um exemplo de um gene supressor de tumores o p53 (responsvel pela estimulao de enzimas reparadoras do DNA, pela entrada das clulas na fase G0, pela permanncia das clulas na fase G1 e pela apoptose de clulas danificadas). Todos os cancros apresentam o gene p53 desligado

Ilustrao 174 - Actividade normal e anormal da p53.

O cancro aparece apenas ao fim de cerca de 6 mutaes chave acumuladas por uma clula: Crescimento ilimitado ligando os genes que promovem o crescimento; Pontos de controlo ignorados desligando os genes supressores de tumores; Ausncia de apoptose desligando os genes responsveis pela apoptose; Imortalidade nmero ilimitado de divises conseguido pelos genes responsveis pela manuteno dos cromossomas (por exemplo, manuteno dos telmeros); Crescimento de vasos sanguneos ligando os genes responsveis pelo crescimento de vasos sanguneos; Ausncia de dependncia de densidade e de suporte desligando os genes de touch sensor. Uma clula danificada deve ser destruda, quer por aco de macrfagos quer por apoptose morte celular programada que passa pelos seguintes passos: A clula diminui de tamanho; Os cromossomas condensam-se e fragmentam-se; A membrana nuclear rompe-se; Formam-se corpos apoptticos.

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular

Ilustrao 175 - Apoptose.

A activao intrnseca da apoptose est dependente das mitocndrias: num dos transportadores electrnicos destes organelos d-se a produo de citocromo-c, uma protena que activa as caspases, uma classe de proteases que degradam o DNA no ncleo da clula. Este processo regulado por dois genes, Bcl2 e BAX, que bloqueiam e promovem a apoptose, respectivamente. Algumas clulas tumorais produzem demasiado Bcl2 dando origem a cancros resistentes quimio e radioterapia.

XVI.

Laboratrio Restrio de Plasmdeos

O material gentico dos procariontes consiste, na maioria dos casos, numa molcula circular de DNA que se encontra numa regio do citoplasma da clula designada por nucleide. Os plasmdeos so molculas circulares de DNA existentes normalmente no interior de bactrias e cuja replicao independente da do DNA cromossmico. Os plasmdeos podem ser modificados geneticamente mediante a sua recombinao com genes exgenos, que so introduzidos numa regio do plasmdeo designada por regio de mltipla clonagem (multiple cloning site MCS). Este processo inicia-se pela aco de enzimas de restrio endonucleases, que, ao reconhecerem determinadas sequncias especficas, cortam a molcula de DNA nessa regio. De referir que no caso de um vector de clonagem iremos obter um nico fragmento de restrio enquanto no DNA cromossmico se obtm vrios fragmentos, pois podem existir vrias regies reconhecidas pelas endonucleases de restrio. O gene a ser introduzido, previamente cortado pelas mesmas enzimas de restrio, ser fixado no plasmdeo mediante a aco de DNA ligases, voltando este a adquirir a forma circular. Outras regies igualmente importantes nos plasmdeos so as marcas de seleco (selectable marker) e a origem de replicao (origin of replication Ori). As primeiras permitem isolar os plasmdeos recombinados mediante a introduo de genes que conferem, por exemplo, resistncia a um antibitico. Deste modo, na presena do mesmo, as bactrias que sobrevivem sero as que possuem o plasmdeo recombinado. A segunda regio (Ori), contm uma

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Apontamentos de Bioqumica e Biologia Molecular sequncia de nucletidos responsvel pela activao do processo de replicao do DNA plasmdico.

Ilustrao 176 - Introduo de DNA exgeno num plasmdeo.

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