Biologia Molecular, LB 2023/2024

Exercícios Bloco 4
Replicação do DNA e PCR

1. Qual das alternativas a seguir não é necessária para a replicação do DNA?

a) ribossomas

b) DNA

c) nucleótidos

d) enzimas

e) Todos os itens acima são necessários

2. Porque se diz que a replicação é semiconservativa?

3. Faça a legenda da seguinte figura:

1________

2 _______

3 _______

4 ________

5 ________

a) Assinale a polaridade das cadeias de DNA

b) Assinale a direção do movimento do garfo de replicação

c) É possível distinguir se este garfo de replicação é de um organismo procariota

ou eucatiota?

4. É essencial que os primers de RNA dos fragmentos de Okazaki sejam removidos e

substituídos por DNA, porque caso contrário qual das seguintes hipóteses se poderia
verificar?

a) O RNA interferiria na função da helicase

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b) O RNA teria maior probabilidade de conter erros porque a primase não tem
actividade “proofreading”

c) O β-clamp da DNA pol II dissociaria-se do DNA e a replicação seria interrompida

d) Os primers de RNA formariam pontes de hidrogénio entre eles, dando origem a

estruturas complexas que poderiam interferir com a formação correcta da dupla hélice

5. Em cada origem de replicação, a síntese de DNA prossegue bidireccionalmente a partir

de dois garfos de replicação. Qual das seguintes hipóteses ocorreria se surgisse um
mutante eucariota que tivesse apenas um garfo de replicação funcional por bolha de
replicação?

a) Nenhuma alteração na replicação

b) A replicação ocorreria apenas em metade do cromossoma

c) A replicação só seria completada na cadeia líder

d) A replicação levaria o dobro do tempo

6. Uma molécula com a seguinte composição

5′-AAAAAAAAAAA-3′

3′-TTTTTTTTTTTTT-5′

é replicada in vitro numa solução contend dGTP, dCTP, e dTTP não marcados (não
radioactivos) e desoxiadenosina 5’-trifosfato com todos os seus átomos de fósforo na
forma de isótopo radioactivo 32P.

a) Ambas as moléculas filhas serão radioactivas?

b) E se a molécula tivesse a seguinte composição:

5′-ATATATATATATAT-3′

3′-TATATATATATATA-5′

7. Arthur Kornberg e os seus colegas no seguimento da experiência do exercício anterior,

incubaram um extrato de E. coli com uma mistura de dATP, dTTP, dGTP e dCTP. Apenas
o dTTP foi marcado com 32P no grupo alfa-fosfato (1º grupo fosfato). Após a incubação,
a mistura foi tratada com ácido tricloroacético para precipitar o DNA, mas não os
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restantes dNTPs. O precipitado foi recolhido e a extensão de [32P]dTMP incorporada no

DNA foi determinada.

a) Se algum dos dNTPs fosse omitido na mistura de incubação, seria detetada

radioatividade no precipitado? Explique.
32
b) Seria detetada radioatividade no precipitado se P marcasse o fosfato gama?
Explique.

8. As DNA polimerases estão posicionadas no seguinte segmento de DNA (que faz parte
de uma molécula muito mais longa) e movem-se da direita para a esquerda. Se
assumirmos que um fragmento de Okazaki é formado a partir deste segmento, qual será
a sua sequência? Assinale as extremidades 5’ e 3’

9. Na cadeia de DNA em baixo está a ocorrer a síntese da cadeia atrasada. Assumindo

que os dois segmentos representados são fragmentos de Okazaki, selecione a letra (a-
d) que indica o local onde a primase irá sintetizar o próximo primer de RNA. Justifique.

Considerando o vídeo sobre a acção da telomerase (ppt Bloco 4):

10. Descreva os componentes da enzima telomerase.

11. Qual é a fonte de RNA usada na síntese dos telómeros, onde se localiza, e como
é que os nucleótidos de RNA são utilizados para a síntese de DNA?

12. Se uma mutação que inactivasse a telomerase ocorresse numa célula (actividade da
telomerase=0), qual seria o resultado para os dois cromossomas filhos replicados?

A. Um dos cromossomas seria mais curto numa extremidade; o outro seria normal nas
duas extremidades

B. Um dos cromossomas seria mais curto nas duas extremidades; o outro seria normal
nas duas extremidades
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C. Um cromossoma seria mais curto nas duas extremidades; o outro cromossoma seria
mais curto apenas numa extremidade

D. Ambos os cromossomas seriam mais curtos numa das extremidades (a mesma

extremidade nos dois)

E. Ambos os cromossomas seriam mais curtos numa das extremidades (extremidades

opostas nos dois)

F. Ambos os cromossomas seriam mais curtos nas duas extremidades

13. Desenhe um par de primers com 10 nucleótidos para amplificar o seguinte fragmento
de DNA (nota: os primers são sempre apresentados na direcção 5’-3’):

5’ATATCGTTGCCTA........GTGGTATCGTAAT3’

14. Pretende amplificar por PCR um fragmento de um gene da b-tubulina de

Colletotrichum kawahae, com a sequência abaixo indicada:

5’ ACTGATGCTAGTGACACCCAG … (250 pb) … ACTTACATTAGGAAATTCAAA 3’

a) De entre as opções apresentadas, que primers permitem amplificar a referida

região?

i) 5’ ACTGATGCTAGTGAC 3’ e 5’ ATTAGGAAATTCAAA 3’

ii) 5’ TGACTACGATCACTG 3’ e 5’ TAATCCTTTAAGTTT 3’

iii) 5’ ACTGATGCTAGTGAC 3’ e 5’ TTTGAATTTCCTAAT 3’

iv) 5’ GTCACTAGCATCAGT 3’ e 5’ TAATCCTTTAAGTTT 3’

v) 5’ GTCACTAGCATCAGT 3’ e 5’ ATTAGGAAATTCAAA 3’

b) Que dimensão teria o produto de PCR (amplicão)?

i. 250 pb;

ii. 280 pb;

iii. 292 pb;

iv. 250 pb e 30 pb;

v. 15 pb e 250 pb.

c) Descreva as etapas principais da amplificação génica por PCR.

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15. Considerando as 3 etapas que constituem um ciclo de amplificação, faça

corresponder os termos em baixo a cada caixa respectiva:

A: 72ºC; B: Emparelhamento; C: Desnaturação; D: TaqPolimerase; E: Síntese de DNA; F:

94ºC; G: Extensão; H: Primers; I: Quebra das pontes de hidrogénio entre as bases da
dupla cadeia de DNA; J: Hibridação; L: 55ºC

16. Considere que, durante uma reacção de PCR a decorrer num termociclador, cada ciclo
tem a duração de 5 min. Que magnitude de amplificação do DNA se obteria ao fim de
1h?

17. Considere a figura a seguir representada que contém a região A de um DNA

genómico:

a) Que primers (1, 2, 3, 4) utilizaria para amplificar a região A? Assuma que a sequência
dos primers é complementar à cadeia de DNA onde estão assentes. Em que
cadeia I e II emparelham os primers escolhidos e qual o sentido da extensão de cada
um dos primers?

b) Se escolhesse os primers 1 e 4 o que aconteceria?

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Soluções:
1. a)
2. Na replicação é conservada uma das cadeias de DNA parental em cada molécula de
DNA filha, ou seja, esta contém uma cadeia parental e uma cadeia recém-sintetizada
3. 1. DNA parental; 2. Síntese contínua; 3. Primer de RNA; 4. Fragmento de Okazaki; 5.
Síntese descontínua. (a) Síntese contínua: cadeia molde 5´-3’; Síntese descontínua: cadeia
molde 3’-5’. (b) Move-se da direita para a esquerda. (c) Não
4. b)
5. d)
6. (a) Não. Apenas a que usou a cadeia 3’-5’ como molde; (b) Neste caso, sim, ambas as
cadeias recém-sintetizadas seriam radioactivas.
7. (a) Não. Na ausência de um dNTP, a polimerase deixaria de incorporar os outros três
dNTPs assim que encontrasse um resíduo de modelo que deveria emparelhar com o
dNTP em falta, e a incorporação de 32P não seria detectável. (b) Não. A síntese de DNA
liberta a os grupos beta (b) e gama (g) dos dNTPs como pirofosfatos.
8. A cadeia 3’-5’ vai servir de molde para a síntese do fragmento de Okazaki, pelo que a
sua sequência será igual a da cadeia 5’-3’.
9. d. O garfo de replicação está a abrir à direita (na extremidade 3’).
10. A telomerase é uma ribonucleoproteína, com uma componente de RNA (TER) e uma
componente proteica com actividade de transcriptase reversa (TERT).
11. A componente de RNA da telomerase é uma molécula de RNA (de cadeia simples)
de sequência complementar à do DNA telomérico. Assim, a telomerase através da sua
atividade de transcritase reversa, utiliza a molécula de RNA como molde para estender a
extremidade 3’ projectada da extremidade da molécula de DNA cromossómico. O molde
de RNA é utilizado repetidamente, sendo assim adicionados unicamente à extremidade
3’ da dupla cadeia, múltiplos de 6 nucleótidos que se repetem e geram uma cadeia
simples de DNA estendida.
12. E.
13. Primer F: 5’ATATCGTTGC3´; Primer R: 5’ATTACGATAC3’
14. (a) iii; (b) iii. 292 pb; (c) Desnaturação, emparelhamento, extensão
15. (1) Desnaturação, 94ºC, Quebra das pontes de hidrogénio entre as bases da dupla
cadeia de DNA; (2) Emparelhamento, Hibridação, 55ºC, Primers; (3) Extensão, Taq
Polimerase, 72ºC, Síntese de DNA
16. 4096x
17. (a) 2 (cadeia I) e 3 (cadeia II); (b) Não ocorreria amplificação