1. Matar as células na fase log meados adicionando Na Sódica a 0,1%.

Na,
adicionando-o congelado 0,2 M Na EDTA. (40 ml de EDTA/200 ml de cultura)
como você faria para um martini para relaxar as células. Spin 6K x 5 min to
pellet cells. Spin 6K x 5 minutos para sedimentar as células.
2. . Lave as células em água gelada. . Células-Transferência para um fundo cônico
de 50 ml tubo Falcon 2098. (Neste momento você pode congelar as células
como uma pelota "seca" a -20 ° C.)
3. Re-suspenda as células em 1,5 a 2 x 10 9 / ml no gelado Nuclear Isolation Buffer
(NIB = 17% de glicerol, tampão MOPS 50 mM, 150 mM acetato de potássio,
cloreto de magnésio 2 mM, 0,5 mM de espermidina, espermina e 0,15 mM; pH é
ajustado para 7,2 depois de todos os ingredientes são dissolvidos).
4. Mix suspensão de células com igual volume de ácido esferas de vidro lavada
(0,45-0,52 mm de diâmetro). Keep on ice. Manter em gelo.
5. Vortex na velocidade máxima em um vortexer saudável para períodos de 30
segundos.. Chill no gelo durante pelo menos 30 segundos entre os episódios de
vórtice. Repita o vórtice 10 a 15 vezes ou até mais de 90% das células foram
quebrados (monitor de controlo para a fração de fantasmas no âmbito de
contraste de fase).. A ruptura é mais eficiente quando todo o conteúdo do tubo é
levantado pela ação de roda. Também acho que errar no lado de ter SIDA muitas
contas na ruptura.
6. Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro ou uma ponta
pipeteman azul - furar a ponta através das contas para o fundo do tubo e sugar o
líquido.. Não importa se algumas contas são transferidas. Lavar as contas duas
vezes com 1,5 volumes de NIB fresco. Piscina e giram em 8 K em um rotor
SS34 por 20 min.
7. of 2 x 10 9 cell equivalents/ml in 50 mM Tris, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH
8., fantasmas e as células intactas em uma concentração final de equivalentes de
2 x 10 9 células / ml em 50 mM Tris, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH
8. . Adicionar Sarkosyl para atingir uma concentração final de 1,5%.. Misture
delicadamente.
9. Adicionar sólidos proteinase K para uma concentração final de 300 mg / ml..
Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
10. . Centrifugar (frio) a 5 K por 5 minutos para sedimentar as células e
fantasmas.. O sobrenadante deve ter apenas pequenas turbidez.
11. . Para cada ml de soution sobrenadante, adicionar 1,05 g de CsCl. (I aim
for a supernatant volume of 4.0 ml (or 4.08 g) plus 4.2 g of CsCl. (I apontar para
um volume de sobrenadante de 4,0 ml (ou 4,08 g), mais 4,2 g de CsCl. Esse
volume irá preencher um selo VTi65 tubo de calor.) Incentivar o CsCl para
dissolver a mistura suave.. Não misture vigorosamente ou espuma irá resultar.
12. After the CsCl has dissolved, measure the volume and add 0.025 volumes
of a 5 mg/ml stock solution in water of Hoechst 33258 dye. Após o CsCl se
 dissolveu, medir o volume e adicionar 0,025 volumes de 5 mg / ml de solução
em água de Hoechst 33258 dye. Mix. Mix.
13. Transferência para 5 mL de tubos de selo. Encha o tubo até o topo com
dummy "adicional" de solução. ("dummy" is the same solution--NaCl, Tris,
EDTA, CsCl, Sarkosyl, Hoechst--minus the yeast DNA). ( "dummy" é a mesma
solução - NaCl, Tris, EDTA, CsCl, Sarkosyl, Hoechst - menos o DNA de
levedura).
14. Spin in a VTi65 or VTi65.2 rotor at 55K and 20°C for 18-24 hr. Spin em
um VTi65 ou rotor VTi65.2 em 55K e 20 ° C por 18-24 horas.
15. . Visualize as bandas de DNA sob luz UV de ondas longas.
Teoricamente, existem três faixas.. A parte superior, faixa difusa DNA
mitocondrial é. A banda de destaque é o DNA cromossômico ea banda fraca
imediatamente abaixo é a banda rDNA. (Hoechst separa DNA com base no
conteúdo GC.) Você pode observar um grupo de partículas entre as bandas de
lixo nuclear e mitocondrial. Retire o ADN através de punção lateral, usando uma
agulha de calibre 16. Medir o volume da seringa antes de dispensar-lo em um
tubo Corex 15 ml (Eu costumo retirar a agulha antes de dispensar-lo para reduzir
a possibilidade de adição de cisalhamento).
16. 16:H2O solution. Adicionar um volume igual de 5:1 de isopropanol:
solução de H2O.). Agitar o tubo para misturar o conteúdo (Eu não uso o
vortexer por causa de se preocupar com tesoura).. Após a separação das fases,
remover a fase de álcool com uma pipeta Pasteur. Eu deixo as fases resolver na
tirada da ponta da pipeta e usá-lo como um funil de separação para minimizar a
perda de qualquer fase aquosa.. Repita a etapa isopropanol mais duas vezes.
17. 17. Adicionar 3 volumes de etanol 70% frio lentamente, ao lado do tubo.
Com o etanol flutuando sobre a camada de CsCl começar a misturar as fases
com um movimento rápido única roda.. O DNA deve começar a sair da solução
na interface como uma rede fibrosa.. Continuar os redemoinhos única até as
fases são misturadas e DNA caiu fora de solução. O DNA pode ser removido
por tocar o coágulo de DNA com o fim de uma pipeta de Pasteur, que foi
fechado pelo derretimento-lo em uma chama.. O DNA vai ficar com o vidro e
pode ser submerso em 70% de etanol fresca para lavar o coágulo e, em seguida,
provocou a partir do final da ponta do vidro para o lado de um tubo de
microcentrífuga. Não deixe que o coágulo secar completamente antes de
adicionar a ET redisolve o DNA.. Se você está olhando para os intermediários
de replicação do plasmídeo, girar o etanol CsCl solução de 20 min a 8 K. Lavar
o tubo com 70% de etanol fresco, o ar seco do tubo e ressuspender qualquer
DNA em TE.. As duas soluções de DNA podem então ser combinadas.. Para
uma cultura de 500 ml eu ressuspender o DNA em um final de cerca de 400
microlitros. Pode levar o coágulo de vários dias para ir para a solução. Se você
está preocupado em perder pequenas bolhas que você pode querer adicionar
NaCl a 50 mM após o DNA começou a entrar em solução.
 18. 18. Para olhar sequências de cópia única Eu costumo cortar cerca de 1
micrograma de DNA nuclear em 0,12-0,15 ml de solução tampão com 4-5
microlitros de enzima por 5 horas.. Digestão seja completa, com menos enzima
ou com incubação mais curto, mas uma vez que é susceptível de variar com a
enzima não se desviaram muito com este plano.. O DNA é precipitado pela
adição de 2 volumes de etanol absoluto contendo 0,5 M K-acetato, refrigeração
por 15 minutos a -70 ° C, e girando 15 min em uma microcentrífuga.. Depois da
lavagem o sedimento em 70% de etanol e secagem do tubo eu ressuspender o
sedimento diretamente no carregamento de buffer.

Preparação do DNA de levedura incorporado em Agarose

1. Inocular 5 ml de uma cultura com uma única colônia de um YAC contendo cepa de
levedura e crescer até que saturado. Determinar o número de células de levedura por
mililitro. A contagem de células deve ser de aproximadamente 1 x 10 8 células / ml
de uma cultura saturada.. A 5 ml da cultura saturada vai render um encaixe de
aproximadamente 5 x 10 8 células por ficha. (Cada ficha contém ligeiramente menos
do que 0,5 ml).
2. . Colheita de células por centrifugação a 1300 x g por 5 min.. Lave o pellet de
2. células duas vezes com 50 mM EDTA, spinning 5 min at 1300 x g como acima.
3. Re-suspenda as células em 50 mM de EDTA a uma concentração final de 2 x 10 9
3. células / ml e aquecer a suspensão de células a 45 ° C por 5 min. . Adicionar um
volume igual a 1% de baixa fusão INCERT (ou SeaPlaque) agarose em 50 mM
EDTA, também aquecida a 45 ° C. (Esse procedimento fará com plugs 0,5%, o que
é bastante frágil, mas são melhores se manipulações mais gosto no gelo digerir são
obrigatórios. Se não, use agarose 2% para fazer velas 1%, que são menos frágeis)..
Misture a suspensão completamente em vortex e pipetar 500 alíquotas μl em cada
molde plug para endurecer. Uma cultura de 100 ml deve render cerca de 20 fichas. .
Plugues podem ser autorizados a estabelecer a temperatura ambiente ou colocadas a
4 ° C (15 minutos).

4. Extrude cada plugue da tomada do molde em um prazo de seis prato bem, até 3
4. tomadas por poço. Para cada poço adicionar 6 ml de solução recentemente
preparada spheroplasting.. Incubar a 37 ° C durante 2-4 h, agitando suavemente..
Longos períodos de tempo de incubação são preferidos.
5. Aspirar a solução de esferoplasto de cada poço e adicionar 6 ml de solução LDS..
5. Incubar agitando suavemente a 37 ° C durante pelo menos 15 min.. Remover e
adicionar solução LDS fresco. Incubar agitando suavemente a 37 ° C durante a
noite.
6. . Lavar as velas de 3 x 30 min com 6 ml de solução 0.2x NDS, agitando suavemente
6. em temperatura ambiente.
7. . Lavar as fichas 5 x 30 min com 6 ml de TE, pH 8,0, agitando suavemente em
7. temperatura ambiente. Plugues podem ser armazenadas a 4 ° C em seis pratos com o
bem-TE, pH 8,0, coberta com envoltório de Saran para evitar a evaporação
excessiva. DNA de alta massa molecular geralmente permanecem degradada pelo
menos seis meses.

. Consulte o manual do aparelho CHEF gel para os parâmetros sugeridos., 200V, 24.
 Para visualizar todos os cromossomos de levedura, nós usamos um interruptor
horário ramped de 60-120S, 200V, 24 horas. Para obter uma melhor separação dos
cromossomos menores, usamos um de 35-70s, 200V, 22 hrs.

Spheroplasting Solution Spheroplasting Solution

40 ml de Sorbitol 1M (aprox. 1M conc final.)

1,6 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20mM final)
0,4 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5 (10mM final)
40 l 2-mercaptoetanol (14mm final)
20-T 0,5 mg / Zymolyase ml 20-T

NDS Solution Solução NDS

0,5 M EDTA
10 mM Tris base
1% Sarkosyl
(pH 9,5)

Para 350 ml de H 2 O adicionar 93 g de Na 2 EDTA

• 2H 2 O e 0,6 g Tris base

Ajustar o pH para valores superiores a 8,0 com 100 a 200 pellets de NaOH sólido
Adicionar 50 ml de 10% do N-lauril sarcosina
Ajustar o pH para 9,5 com NaOH concentrado
Levar o volume final de 500 ml com H 2 O
. Filtro-esterilizar e armazenar em temperatura ambiente.

LDS Solution Solução LDS

1% dodecil sulfato de lítio

100 mM EDTA
10 mM Tris-HCl, pH 8,0

Por 1 litro:

10 g de dodecil sulfato de lítio (Sigma Chemical Cat # L-4632)

200 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0
10 ml de 1M Tris-HCl, pH 8,0
O volume de 1 litro com H 2 O, filtro de esterilizar e armazenar em temperatura
ambiente