ENSAIO DO COMETA

PROTOCOLO
Obs. Para preparação de soluções estoque observar a quantidade a ser
utilizada, pois na técnica se usa uma fração desta, evitando o desperdício.

SOLUÇÃO DE LISE
ESTOQUE

NaCl (Cloreto de sódio) 146,1g

EDTA 37,2g
Tris 1,2g
Lauril 10g
NAOH Aproxima. 8g (ver abaixo)

 Pesar todos os reagentes

 Adicionar os reagentes em um Becker com 850ml de água destilada
 Depois de colocar os reagentes, iniciar a medida do pH
 Adicionar aproximadamente 8g de NAOH em flocos até o pH ficar próximo
de 9,8.
 Complete com o restante da água para 1000ml sem interromper a medida
do pH
 Depois de completar a água, terminar de acertar o pH para 10 com o
mesmo NAOH
VALIDADE DE 6 MESES

SOLUÇÃO DE USO

Triton X-100 1ml

DMSO (Dimetil sulfóxido) 10ml
Solução de lise (ESTOQUE) 89ml

 Para cada berço cabem 18 lâminas e são necessários 100ml para

preenchê-la
 Em uma proveta adicionar o Triton, seguido pelo DMSO e por fim a
solução de lise (ESTOQUE)
TAMPÃO DE ELETROFORESE

ESTOQUES DE NAOH E EDTA

NAOH 100g
Água destilada 250ml

 Em um Becker pesar 100g de NAOH, adicionar cerca de 250ml de água.

ATENÇÃO: Solução fica muito quente devido à natureza exotérmica da reação.
VALIDADE DE 15 DIAS

EDTA 7,445g
Água destilada 100ml

 Em um Becker, pesar o EDTA, e colocar aproximadamente 50ml de água.

 Acertar o pH para próximo de 9,5 com NAOH
 Completar os 100ml de água
 Conferir o pH e ajustá-lo para 10 com NAOH
SOLUÇÃO NÃO TEM VALIDADE

SOLUÇÃO DE USO

EDTA 10ml
NAOH 60ml
Água destilada 2000ml

 Verificar se o pH desta solução está superior a 13

 Esta solução deve ser prepara do DIA DE USO, e colocada na geladeira
para que esteja em aproximadamente 4°C na hora do uso
 Deve-se trocar esta solução à cada corrida de eletroforese.
 TAMPÃO DE NEUTRALIZAÇÃO

Tris 24,25g
Água destilada 500ml

 Em um Becker pesar o Tris e adicionar cerca de 400ml de água,

 Acertar o pH para 7,7 usando HCL concentrado (60%), aproximadamente
45ml,
 Após essa etapa, completar com o restante da água e checar o pH, se
necessário ajustar o pH até que este fique em 7,5.

VALIDADE DE 6 MESES

PBS

KCL (Cloreto de potássio) 0,2g

KH2PO4 (Fosfato de potássio) 0,2g
NaCl (Cloreto de sódio) 8,0g
Na2HPO4 (Fosfato de sódio) 1,15g
Água destilada 1000ml

 Pesar os sais e adicioná-los em um Becker com aproximadamente 900ml

de água
 Em seguida acertar o pH para 7,4 e completar com água, se necessário
após completar a água ajustar o pH com HCL.
 PREPARAÇÃO AGAROSE LOW MELTING (BAIXA PONTO FUSÃO)

Agarose 0,1g
PBS 20ml

 Depois de pesar a agarose, adicionar o PBS e por fim fundi-la na placa

aquecedora. (Depois de pronta colocar em banho maria 37°C para não
endurecer)

PREPARAÇÃO DA AGAROSE PARA LÂMINAS

Agarose 0,3g
PBS 20ml

 Pesar a agarose e fundi-la com PBS na placa aquecedora

 Em seguida fervê-la por aproximadamente 1 minuto
 Deixar a agarose esfriar e solidificar
 Refundi-la em seguida fervê-la por 1 minuto (repetir 2 vezes)
 Após a terceira fervida a agarose já pode ser usada para preparar as
lâminas
 Mergulha-se a lâmina na agarose, em seguida limpa-se a superfície
inferior da lâmina (lado fosco pra baixo) retirando o excesso de agarose;
 Deixar lâminas secando e depois guarda-las na geladeira (se necessário
pode-se deixá-las secando “overnight”)

IMPORTANTE: enumerar as lâminas, marcar e separar as duplicatas na etapa

da eletroforese de modo que cada lâmina corra em uma cuba.
 SOLUÇÃO DE COLORAÇÃO (BROMETO DE ETÍDEO)

SOLUÇÃO ESTOQUE (Atenção: Produto cancerígeno)

Brometo de etídeo 10mg

Água ultrapura 50ml

SOLUÇÃO DE USO

Brometo de etídeo (ESTOQUE) 1ml

Água ultrapura 9ml

PROCEDIMENTO

Obs: É importante que do início do procedimento até o final da etapa de

eletroforese, manter as células sem contato direto com a luz, para evitar que
novos danos no DNA sejam gerados. As etapas de preparo de lâminas, lise e
eletroforese devem ser realizadas em uma sala escura.

COLETA DE SANGUE

 Retirar sangue com seringa heparinizadas

 Adicionar 10ul de sangue em 1000ul de solução salina
 Acondicionar em microtubo e colocar em um suporte em gelo (não colocar
em contato direto com gelo)

PREPARO LÂMINAS

 Adicionar em um microtubo 10ul de solução (salina/sangue) e 120ul de

agarose low melting (acondicionada em banho Maria 37°C)
 Homogeneizar SUAVEMENTE com o auxílio de um micropipetador e
depois colocar 3 gotas sobre uma lâmina previamente preparada com
agarose normal. Em seguida cobrir a lâmina com uma lamínula
 Levar as lâminas para geladeira por cerca de 30 minutos para solidificar
a agarose low melting
 Em seguida, retirar as lamínulas e acondicionar as lâminas em um berço
para etapa de lise
ETAPA DE LISE

 Depois de acondicionar as lâminas no berço, adicionar a solução de lise

(SOLUÇÃO DE USO) gelada até encher o berço.
 Cobrir o berço com papel alumínio e acondicionar em geladeira por no
mínimo 1 hora

ELETROFORESE

 Retirar as lâminas da solução de lise e acondicioná-las em uma cuba para

eletroforese. Esta cuba deve estar acondicionada em um recipiente com
gelo, uma vez que esta etapa deve ocorrer em baixas temperaturas.
 É IMPORTANTE anotar respectivamente as lâminas que foram
acondicionadas nas cubas enumeradas (1, 2 e 3), com seus respetivos
cabos e fonte
 Adicionar as lâminas lado a lado de forma que não haja espaços entre as
lâminas, se nas laterais das cubas sobrarem espaços preencher com
lâminas esmerilhadas
 Adicionar o tampão de eletroforese (TAMPÃO DE USO) até cobrir as
lâminas
 Ajustar a fonte para eletroforese a 25V e 300mA, se necessário ajustar
estas condições tirando ou colocando tampão

mA Abaixar Retirar
Aumentar Colocar
V Abaixar Colocar
Aumentar Retirar
 Antes de iniciar a eletroforese, deixar as lâminas nesta solução por 30
minutos
 Transcorrido o tempo, realizar a eletroforese por 20 minutos

NEUTRALIZAÇÃO

 Após a eletroforese, colocar as lâminas sobre uma bandeja ou grelha e

adicionar cerca de 4 ml de solução de neutralização, deixar agir por cerca
de 5 minutos e repetir a etapa 3 vezes.
FIXAÇÃO

 Depois de neutralizar as lâminas, deixa-las secar e em seguida

acondicioná-las novamente no berço
 Completar o berço com etanol 100% e deixar por 10 minutos
 Transcorrido o tempo, retirar as lâminas do etanol e deixa-las secar
 Depois de secas, guardá-las na geladeira

COLORAÇÃO

 Adicionar sobre cada lâmina 100ul de solução de coloração (SOLUÇÃO

DE USO) e cobrir com lamínula, após 5 minutos já podem ser analisadas

ANÁLISE DE DADOS

 Analisar em microscópio de fluorescência, contando 100 células, as

células serão classificadas em uma classe de dano que é determinada de
acordo com a intensidade e tamanho de cada cauda

CLASSE DANO
0 Não danificada
1 Pouco dano
2 Dano médio
3 Dano grande

 Deve ser feito em escore da seguinte maneira por indivíduo

 Número de células classe 0 x 0
 Número de células classe 1 x 1
 Número de células classe 2 x 2
 Número de células classe 3 x 3
 Depois disso soma-se os escores de todos os indivíduos de um
determinado grupo e divide-se pelo número de indivíduos obtendo-se
assim o ESCORE MÉDIO.