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PROTOCOLOS

FIXADORES

- Methacarn (imuno): p/ 100 mL

Fixao de 4 a 8 horas para peas


maiores, e de 3 horas para peas muito
pequenas. Depois, deixar em lcool 70%.

60 mL metanol
30 mL clorofrmio
10 mL cido actico glacial

- Glutaraldedo 4% (luz / eletrnica): p/ 100 mL


8 mL glutaraldedo 50%
92 mL tampo fosfato 4% (0,05M)

* Tampo fosfato 0,05M (p/ 100 mL)

[guardar na geladeira]

Soluo A: Fosfato de sdio monobsico [NaH2PO4 - H2O (mono-hidratado) 0,2M]


0,552 g

20 mL gua destilada
PM = 138 g - 1 L 1M
x g - 1L 0,05 M

separar 19 mL desta soluo

Soluo B: Fosfato de sdio dibsico [Na2HPO4 (anidro) 0,2M]


2,555 g

90 mL gua destilada

x = 6,9 g - 1 L
(1%) *4
x = 27,6 g - 1L
PM = 141,96 g - 1 L 1M
x g - 1L
- 0,05 M

separar 81 mL desta soluo

Tampo = Soluo A + Soluo B (pH 7,2 ou 7,4)

x = 7,098 g - 1 L
(1%) *4
x = 28,392 g - 1L

- Bouin (imuno): p/ 1 L
714,3 mL cido pcrico saturado
238,1 mL formal 40%
47,6 mL cido actico glacial

Fixao de 24 horas. Depois, deixar em


lcool 70%.

- Karnovsky [glutaraldedo 2% + paraformaldedo 4% + tampo de Sorensen (0,1M)] (luz / eletrnica): p/


400 mL
34 mL glutaraldedo 25%
200 mL paraformaldedo 8%
186 mL tampo de Sorensen (0,1M)

* Soluo de paraformaldedo 8% (p/ 200 mL)


Aquecer 180 mL de gua destilada a 60C.
Acrescentar 16g de paraformaldedo e agitar at dissolver, mantendo a temperatura 60C.
Adicionar 5 gotas da soluo de hidrxido de sdio, mantendo a agitao e a temperatura
at que a soluo fique transparente.

* Tampo de Sorensen 0,1M (p/ 200 mL)


Soluo A: Fosfato de sdio monobsico [NaH2PO4 - H2O (mono-hidratado) 0,2M]
1,668 g

60 mL gua destilada

separar 56 mL desta soluo

Soluo B: Fosfato de sdio dibsico [Na2HPO4 (anidro) 0,2M]


4,248 g

150 mL gua destilada

separar 144 mL desta soluo

Tampo = Soluo A + Soluo B (pH 7,2)

- Soluo de paraformaldedo 4% (imuno): p/ 200 mL


Aquecer 100 mL de gua destilada a 60C.
Acrescentar 8 g de paraformaldedo e agitar at dissolver, mantendo a temperatura 60C.
Adicionar 5 gotas da soluo de hidrxido de sdio, mantendo a agitao e a temperatura at que a
soluo fique transparente.
Acrescentar a mesma proporo de tampo fosfato 0,05M pH 7,4.

* Tampo fosfatado 0,1M (p/ 100 mL)

[guardar na geladeira]

Soluo A: Fosfato de sdio monobsico [NaH2PO4 - H2O (mono-hidratado) 0,2M]


0,523 g

19 mL gua destilada

Soluo B: Fosfato de sdio dibsico [Na2HPO4 (anidro) 0,2M]


2,294 g

81 mL gua destilada

Tampo = Soluo A + Soluo B (pH 7,4)

PROCESSAMENTO

- Incluso em historesina (luz)


1) lcool 70% por 2 horas (esta etapa desnecessria caso o material esteja fixado em Karnovsky)
2) lcool 95% por 2 horas
3) lcool absoluto por 1 hora
4) lcool absoluto + resina (1:1) por 1 hora
5) Resina overnight por 3 ou 4 dias (na geladeira)
6) Resina incluso (cuidar do posicionamento dos tecidos / deixar endurecer na capela)

* Preparao da resina
50 ml resina = 1 g ativador (p/ infiltrao)
15 ml resina de infiltrao = 1,2 ml endurecedor (p/ incluso)
obs: para incluso deve-se trabalhar em capela, pois o endurecedor cancergeno

- Incluso em parafina (luz)


1) lcool 95% por 1 hora
2) lcool absoluto 1 por 1 hora
3) lcool absoluto 2 por 1 hora
4) Xilol 1 por 1 hora
5) Xilol 2 por 1 hora
6) Parafina (banho 1) por 2 horas
7) Parafina (banho 2) por 2 horas
8) Parafina (banho 3) overnight
9) Parafina incluso (colocar nas caixinhas e cuidar do posicionamento dos tecidos / tomar cuidado
para no formar bolhas)

COLORAO

- Azul de toluidina-Borax
1g azul de toluidina dissolvido em 4 ml lcool absoluto
4g borato de sdio dissolvido em 400 ml gua destilada
Juntar as solues

* Procedimento
Pingar o corante sobre todos os cortes e flambar em bico de bulsen.
Em seguida lavar os cortes em gua e fazer a bateria de desidratao para montagem de
lminas (3 minutos em cada banho para material processado em parafina e 30 segundos para os
processados em resina).

- Hematoxilina-Eosina

* Hematoxilina de Harris
5g hematoxilina cristalizada
100 mL lcool 95%
20g sulfato de alumnio
1000 mL gua destilada
2-4 mL cido actico
3g xido de mercrio amarelo

1) Dissolver a hematoxilina no lcool


2) Dissolver o sulfato de alumnio em gua quente (50C)
3) Juntar as duas solues, ferver rapidamente levando a ebulio
4) Baixar a fervura e, com cuidado para no aspirar a soluo,
juntar o xido de mercrio
5) Levar a soluo novamente fervura at tornar-se vermelho
escuro
6) Retirar do fogo e deixar esfriar, depois armazenar em vidro
escuro
7) Adicionar o cido actico (opcional)

Obs: o cido actico aumenta a especificidade do corante em corar o ncleo; esse corante estvel (filtrar
antes de usar por causa do xido de mercrio.

* Eosina de Putt
1g eosina
0,5g bicromato de potssio
10 mL cido pcrico saturado
10 mL lcool absoluto
80 mL gua destilada
1 gota de cido actico

1) Dissolver a eosina no lcool absoluto


2) Dissolver o bicromato de potssio em gua destilada
3) Juntar as duas solues e mexer com basto de vidro
4) Acrescentar a soluo de cido pcrico saturado e uma gota de
cido actico
5) Armazenar em vidro claro

* Procedimento
Desparafinizar e hidratar as lminas em: xilol 1, xilol 2, lcool absoluto, lcool 95%, lcool
70% (banhos de 3 minutos, sendo que o material includo em resina no passa pelas etapas de xilol)
Lavar em gua corrente de torneira por 5 minutos
Corar com hematoxilina por 2-5 minutos (parafina) / 15-20 minutos (resina)
Lavar em gua corrente de torneira por 5 minutos
Contracorar com eosina por 1-2 minutos (parafina) / 8-10 minutos (resina)
Desidratar na bateria de: lcool 95%, lcool absoluto, xilol+lcool (1:1), xilol 1, xilol 2, xilol
final para montagem (banhos de 3 minutos para material includo em parafina, e de 30 segundos para os
includos em resina)
Na montagem, limpar as lminas com cuidado em volta do corte, deixando o tecido mido
para uma melhor aderncia da goma na lamnula e no corte
Colocar a Goma de Damar, montar e deixar secar temperatura ambiente ou na estufa
37C

- PAS+Hematoxilina frrica+Metanil Yellow

* cido peridico 1%
1g cido peridico dissolvido em 100 mL gua destilada

* Reativo de Schiff
1,5g fucsina bsica
9g metabissulfito de sdio
3 mL cido clordrico
200 mL gua destilada

1) Dissolver a fucsina bsica em gua destilada e ferver por 5


minutos (no momento da fervura abaixar o fogo)
2) Retirar do fogo e acrescentar o metabissulfito de sdio
3) Agitar a soluo por 1h30 e, depois, deixar por 2h em repouso
4) Filtrar e colocar o cido clordrico
5) Armazenar em frasco escuro, em ambiente escuro por 24h para
a descolorao da soluo ( cor de palha)
6) Acrescentar 0,25g de carvo ativado para cada 100 mL de
soluo, agitar e deixar descansando
7) Filtrar e armazenar na geladeira para uso

* Hematoxilina frrica de Weigert


SOLUO A: 1g hematoxilina dissolvido em 100 mL lcool 95% (amadurecer por cerca de 1 ms
em luz ambiente)
SOLUO B: 1,2g de cloreto de ferro dissolvidos em 4 mL gua destilada, acrescentar mais 95 mL
gua destilada e 1 mL cido clordrico concentrado

SOLUO FINAL = 50% soluo A + 50% soluo B


Obs: preparar apenas o que ser usado na hora - NO ESTOCAR!

* Metanil Yellow
SOLUO A: 0,01g metanil yellow dissolvido em 10 mL gua destilada
Separar 10 mL desta soluo
SOLUO B: 0,25 mL cido actico global diludo em 50 mL gua destilada
Separar 25 mL desta soluo

SOLUO FINAL = soluo A + soluo B + 15 mL gua destilada


Obs: a soluo fica vermelho bem forte e no recomendado utilizar este corante quando est velho,
assim quando o mesmo estiver alaranjado dever ser descartado; uma outra razo para que a substncia
mude de colorao a volatilizao do cido actico, de forma que o recipiente de armazenamento do
corante deve ser bem vedado.
Obs2: verificar nas lminas se o corante est deixando precipitados, caso isso ocorra recomenda-se filtrar
o mesmo; no ocorrendo, a filtragem dispensada.

* Procedimento (para material includo em resina)


Desidratar os cortes em estufa 60C overnight
Hidratar em gua destilada (s uma passada)
Deixar em cido peridico 1% por 10 minutos
Lavar em 3 trocas de gua destilada (ou gua corrente por 10 minutos)
Deixar no Reativo de Schiff durante 1h
Lavar em gua corrente por 10 minutos
Corar com hematoxilina frrica por 5-6 minutos (o tempo varia de acordo com o animal e
com a espessura dos cortes, preciso fazer um teste com cada material a ser trabalhado a fim de se
padronizar o tempo)
Lavar em gua corrente por 10 minutos
Contracorar com Metanil yellow por 2 minutos (se for corar o material no mesmo dia em que
foi feita a soluo tem que deixar menos tempo, se no fica muito amarelo)
Tirar o excesso de Metanil yellow com uma passada rpida em gua e, em seguida, agitar
lmina por lmina como se agitasse um termmetro
Colocar na estufa overnight para desidratar
No dia seguinte, passar o material 30 segundos em xilol para montagem e montar as
lminas com Goma de Damar

Obs: no desidratar o material corado com lcool, pois o Metanil yellow solvel no mesmo e pode sair da
lmina

PROCESSAMENTO

- Imuno por peroxidase (protocolo bsico)


1) Desparafinizar e hidratar as lminas em: xilol 1, xilol 2, xilol 3, xilol+lcool, lcool absoluto, lcool
95%, lcool 70% (banhos de 10 minutos)
2) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
3) Recuperao antignica com tampo citrato de sdio 0,01M - 15 minutos a 90 C
(Pode-se utilizar o kit Antigen Unmaskin Solution Vector - 94 L para 100 mL gua destilada)
4)Esfriar os cortes na mesma soluo em temperatura ambiente por 20 minutos
5) Lavar em gua corrente por 10 minutos
6) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
7) Bloqueio da peroxidase endgena com perxido de hidrognio 3% por 30 minutos a temperatura
ambiente (5 mL de H2O2 + 45 mL de PBS)
8) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
9) Bloqueio dos stios inespecficos com leite Molico 5% por 30 minutos a temperatura ambiente
10) Incubar com anticorpo primrio a 4o C por 18h
11) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
12) Incubar com bloqueio ps-primrio Leica por 30 minutos a temperatura ambiente
13) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
14) Incubar com anticorpo secundrio com polmero Leica por 30 minutos a temperatura ambiente
15) Lavar em PBS - 2x 5 minutos
16) Revelao com DAB (STOP em gua destilada)
17) Contracorar com Hematoxilina de Mayer por 5 minutos
18) Lavar em gua corrente por 1 minuto
19) Diferenciar em carbonato de ltio 3x
20) Lavar em gua corrente por 1 minuto
21) Desidratar na bateria de: lcool 70%, lcool 95%, lcool absoluto, xilol+lcool (1:1), xilol 1, xilol
2, xilol final para montagem (banhos de 3 minutos)
(Os banhos com xilol podem ser mais longos, em torno de 5 minutos cada)
22) Montar as lminas com Goma de Damar

* PBS (p/ 10 L de soluo)


87,9g NaCl
2,74g KH2PO4 (fosfato de sdio monobsico)
11,35g Na2HPO4 (fosfato de sdio dibsico)
10 L gua destilada

Diluir todos os sais em gua destilada e acertar o pH 7,2-7,4