PRINCIPAIS MÉTODOS DE

COLORAÇÃO
• Bactérias
afinidade por um grande no de corantes
• pp/ derivados básicos da anilina

(azul de metileno, violeta de genciana, tionina, fucsina
básica, etc.)
 coloração com apenas 1 corante
coloração simples.
 diferenciais
auxiliam na taxonomia bacteriana:

Método de Gram

Ziehl Neelsen,

Albert-Laybourn
• Outros métodos também podem auxiliar na
visualização:

Fontana Tribondeau
 Coloração de Gram

Bactérias
coram-se por derivados da rosanilina
(violeta genciana, cristal-violeta, metil-violeta, etc.)

e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-iodetada - Lugol)

composto iodopararosanilina

retido pelas bactérias G+
não pode ser facilmente
removível pelo tratamento subsequente com o álcool

Gram -
composto é facilmente descorado pelo álcool.

Após ação do álcool
coloração de fundo pela fucsina ou safranina
 Gram negativas
vermelhas (corante de fundo)
 Gram positivas
roxas (cor do corante inicial)
 Diferenciação
importante na sistemática bacteriana
 Diferenças na parede celular das bactérias

Podemos formular 2 regras gerais simples:

1-Cocos geralmente são Gram +
exceção do

gênero Neisseria (gonococo e meningococo)
2-Bastonetes geralmente são Gram -
exceção
das Corinebactérias, Listérias*, Bacillus e os
Clostridios.
Método de Gram:

área de segurança do bico de bunsen
esfregaço fino do
material numa lâmina
limpa e desengordurada.

Deixar secar na área de segurança

Fixar o esfregaço
face posterior da lâmina 3 x na chama

Corar 1 minuto com solução de cristal violeta fenicada

Escorrer o corante e cobrir durante 1’ c/ solução de Lugol
Iodo – 1g, iodeto de potássio - 2g, água destilada – 300ml

Lavar em água corrente

Diferenciar com álcool a 95°
tempo delicado

Lavar em água corrente

Corar o fundo ≅30s com fucsina
ou safranina diluída

Lavar e secar
Coloração de Ziehl Neelseen

Baseada na propriedade das micobactérias de

resistirem ao descoramento com uma solução de álcool-
ácido após tratamento pela fucsina fenicada à quente.
 Micobacterium leprae e Micobacterium tuberculosis

permanecem coradas de vermelho

outras
não possuem esta propriedade
 tomam a cor do corante de fundo.

álcool-ácido-resistência
lipídeos
fortemente ligados

parede celular da micobactéria
Método de Ziehl Neelsen

Proceder a técnica do esfregaço (como na coloração anterior)

Corar a lâmina c/ fucsina de Ziehl concentrada
 aquecer a lâmina até a emissão de vapores durante 5 minutos
(evitando a ebulição do corante)

Escorrer o corante e diferenciar com álcool-ácido
clorídrico a 1% (álcool 95° - 100ml, ácido clorídrico, dens. 1,19 – 1ml)

Lavar em água corrente

Corar o fundo (≅30 seg.) com solução diluída de azul de
metileno (azul fenicado de Kühne ou azul alcalino de Loeffler a 1:10)

Lavar e secar

Bacilos álcool-acido resistentes vermelhos

outros mos e núcleos celulares
azuis.
Coloração de Albert-Layborn

Algumas bactérias
corpúsculos citoplasmáticos
localizados nas regiões polares da célula bacilar
 (corpúsculos metacromáticos ou corpúsculos de Babes Ernst)

coram-se pelo Lugol forte
cor marrom

evidenciando-se em contraste com o corpo bacilar
 verde-azulado pela solução de Laybourn.
 característico das Corinebactérias e Difteróides

Possibilitam diagnóstico presuntivo
pela microscopia
ótica.
Método de Albert-Laybourn

(Esfregaço homogêneo, delgado e fixado)

Cobrir o esfregaço ± 5 min c/ a solução de Albert-Layborn.

Escorrer (sem lavar).

Cobrir com solução Lugol forte por ± 2 minutos.

Lavar e secar.

Observar em objetiva de imersão (100 x).

Obs-Solução de Albert:
Azul de toluidina (0,15g),
Verde de malaquita (0,2g),
Ác.Acético glacial (1ml),
Álcool 95o (2ml),
Água destilada (100ml)
 e

(a) cocos G+ em cadeias (estreptococos) (d) cocos G - (Neisseria)

(b) bastonetes G+ (Listeria) (e) BAAR
(c) bastonetes G - (E.coli)
 Método de Fontana-Tribondeau

CORANTES: Ácido acético glacial……………..….1ml

Formalina (40% v/v de H.CHO)…….2ml
Água destilada…………………….100ml
1. Líquido de Ruge (fixador)
Ácido tânico…………………………..5g
1. Mordente Ácido fênico (fundido)………………1ml
Água destilada…………………….100ml
• Dissolver o ácido fênico na água.
• Colocar o ácido tânico em um balão e adicionar cerca de 10ml da
água fenicada e misturar bem para dissolver o máximo possível.
• Acrescentar o restante da água fenicada para completa dissolução.
• No dia seguinte, filtrar, se necessário.
3. Nitrato de Prata Amoniacal (solução impregnadora)
Nitrato de prata………………………..5g
• Reservar 5 ml da solução acima. Água destilada…………………….100ml

• Aos 95 ml restantes, adicionar amônia, gota a gota (misturando sempre)

até que o precipitado de cor castanho-acinzentada se dissipe.
• Adicionar, então, gotas da solução de nitrato de prata reservada, até
desenvolver uma leve opalescência que persiste após agitação.
• Armazenar em frasco escuro.
TÉCNICA:

• Secar o esfregaço ao ar;

• Colocar algumas gotas da solução fixadora (renova-la 3x
durante 30 segundos a fim de "desemoglobinizar" o esfregaço)
• Cobrir c/ mordente, aquecendo até emitir vapores

aguardar 30seg.
• Lavar em água corrente
• Tratar c/ solução impregnadora de nitrato de prata
amoniacal, aquecendo ligeiramente (emissão de vapores)
por 30 segundos (a preparação deve tomar a cor marrom) Lavar
bem em água corrente
• Secar com papel de filtro
• Examinar com objetiva
de imersão
FIM