Coloração bacteriana

A coloração bacteriana é feita para distinguir espécies bacterianas e suas carac-

terísticas, é visualizada através de microscópio e necessita de contraste da amostra com
o meio
Os corantes utilizados são sais compostos por um íon positivo e um íon negativo
 Corante Básico = Íon + (cora a bactéria)
 Corante Ácido = íon - (cora o fundo) - coloração negativa

Corantes
Corantes Básicos: Corantes Ácidos
Þ Cristal Violeta Þ Eosina
Þ Azul de metileno Þ Fucsina ácida
Þ Verde de Malaquita Þ Nigrosina
Þ Safranina

Mordente: Substância química adicionada para intensificar a coloração

A preparação de amostras para a microscopia óptica segue: Esfregaço + Fixação (na

chama) + coloração

Coloração de Gram
Esse método de coloração existe há mais de um século, foi desenvolvida em 1884
por Hans Gram.
Essa coloração diferencia bactérias gram-positivas e gram-negativas devido as
propriedades químicas e físicas das paredes celulares.
As bactérias gram-positivas se coram de roxo e as gram-negativas se coram de
rosa devido a quantidade de peptídeoglicano na parede celular.

ETAPAS DA COLORAÇÃO:
1. Pingar gotas do corante violeta de metila (Cristal violeta/ Básico Púrpura) sobre o es-
fregaço seco na lâmina e deixar agir por 60 segundos, nessa fase tanto as bactérias
gram negativas quanto gram positivas são coradas de roxo
2. Despejar o corante e adicionar o iodo (mordente) e deixar agir por 60 segundos, as-
sim são formados cristais com o corante, chamado de complexo violeta-iodo
3. Remover o lugol da lâmina
4. Lavar com água destilada, sem que caia diretamente no esfregaço
5. Gotejar sobre a lâmina a solução descorante de 15 a 30 segundos, o álcool , que de-
sidrata a camada peptídeoglicana das bactérias gram-positivas, tornando-as mais
impermeáveis ainda a saída do cristal violeta-iodo, porém, nas gram negativas, o ál-
cool dissolve a membrana externa de LPS causando pequenos buracos nessa mem-
brana por onde o complexo violeta-iodo escapa, deixando as bactérias gram negati-
vas descoradas.
6. Lavar o esfregaço em água destilada
7. Cobrir a lâmina com a solução de fucsina , deixando atuar de 30 a 60 segundos, e
com esse corante contrastante as bactérias gram negativas tornam-se de cor rosa e
 as bactérias gram positivas continuam coradas de roxo
8. Lavar com água destilada
9. Deixar secar na posição vertical
10. Visualização microscópica
Reagentes usados:
Corante Básico Pur-
pura (Cristal violeta)
Mordente (Solução
de Iodo LUGOL)
Agente descoloran-
te (Álcool 95%)
Corante básico ver-
melho (Fucsina / Sa-
franina)
Água destilada

Coloração Álcool Ácido Resistente

Essa técnica de coloração é chamada de técnica de Ziehl-Neelsen, de 1882 e é
uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo
usada em bactérias que não são bem coradas com a técnica de Gram, como os baci-
los da tuberculose que possuem grande quantidade de ácido micólico na parede celu-
lar o que causa a impermeabilidade á coloração de Gram
Ex: Bactérias do gênero Mycobacterium e espécies patogênicas de Nocardia

ETAPAS DA COLORAÇÃO:
1. Aplicar sobre a lâmina o corante Carbolfucsina (fucsina fenicada)
2. Aquecer a lâmina até a emissão de vapores (não deixar ferver ou secar), nessa etapa o co-
rante adere o interior das células, pois quando a fuscina fenicada é aquecida, o calor faz
com que os lipídios da membrana derretam, deixando-a permeável ao corante.
3. Deixar o corante aquecido por 5 minutos
4. Lavar a lâmina em água corrente/destilada
5. Adicionar álcool ácido de 2 a 5 minutos, solução descorante com 95% de álcool etílico com
2,5% de ácido nítrico e HNO3, que irá descorar células eucariontes e bactérias não álcool re-
sistentes, mantendo as bactérias álcool ácido resistentes coradas de vermelho da carbolfucsi-
na devido a resistência dessas bactérias á este devido a camada lipidíca rica em ácido mic-
ólico
6. Lavar a lâmina em água corrente/destilada
7. Corar a lâmina com solução azul de metileno durante 1 a 2 minutos, que irá corar as outras
bactérias ou células presentes na lâmina
8. Lavar a lâmina em água corrente/destilada
9. Esperar secar
10. Observar no microscópio Reagentes usados:
Corante carbolfucsina (Ver-
melho) Fucsina básica +
Etanol + Fenol
Agente descolorante
(Álcool Ácido)
Contracorante (Azul de Me-
tileno)
Água destilada