Protocolo Histoquímicas LAMEB 2018 5

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB

LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA
REVISADO EM 15/08/2018
PROTOCOLO PARA HISTOQUÍMICAS
O termo histoquímica é utilizado para descrever métodos que identificam e localizam

substâncias químicas em cortes histológicos.
01) Azul de Toluidina (ATO) – Para Carboidratos Ácidos
Aplicação: Reação com grupos ácidos de componentes teciduais (radicais carboxílicos,

sulfatos e fosfatos).
Significado químico do corante → altera-se em função do pH.
 pH neutro a 4,0 → 3 radicais mostram-se corados.
 pH 3,5 → apenas os grupamentos sulfato e fosfatos.
 pH 1,0 → somente os sulfatos.
Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

parafina).
Resultado: o azul de toluidina é um corante metacromático, que exibe coloração diferente de

acordo com o substrato que reage. Pectinas coram de roxo e paredes lignificadas e fenólicos
não estruturais coram de verde ou azul esverdeado.
Reagentes:
Solução de Azul de Toluidina:
0,5g de Azul de Toluidina ..........................100 ml de água destilada (pode ser também tampão
fosfato de sódio 0,1M - pH 6,5). - Diluir o corante na água e depois filtrar com papel filtro.
- pH 3 ou 4: Colocar HCl (1N) até adquirir o pH desejado.
Ácido Clorídrico 1N: 8ml de Ácido Clorídrico P.A. .......... 92ml de água destilada.
OBS: Coloca-se sempre o ácido na água e nunca o contrário.
Protocolo para Secções em Historesina:

- Colocar as secções por aproximadamente 30 segundos na solução;
- Lavar com água corrente para retirar resíduos;
- Secar as lâminas ao ar livre ou em estufa a aproximadamente 45ºC;
- Montar as lâminas com uma gota de água e lamínula. Resinas (ex: Bálsamo do Canadá)
podem ser utilizadas para aumentar a durabilidade das lâminas. Neste caso, para melhor
deslizamento da resina e maior durabilidade da coloração, recomenda-se colocar as lâminas
antes em acetato de butila ou xilol, por volta de 5 minutos.
Protocolo para Secções em Parafina:
- Colocar as lâminas com as secções por aproximadamente 30 minutos (no mínimo) em estufa
a aproximadamente 45ºC;
- Passo a Passo da Coloração:

 1º - Xilol Puro I (desparafinização) __________________________ 10 minutos
 2º - Xilol Puro II (desparafinização) __________________________ 10 minutos
 3º - Álcool 100 % I (hidratação) _____________________________ 5 minutos
 4º - Álcool 100% II (hidratação) _____________________________ 5 minutos
 5º - Álcool 90% (hidratação) ________________________________ 5 minutos
 9º - Água (hidratação) _____________________________________ 10 minutos
 10º - ATO (coloração) _____________________________________ 30 segundos*
 11º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ até 5 minutos
 12º - Secagem em estufa a 45ºC______________________________ 1 hora
 16º - Xilol Puro Pós (Fixação do corante e conservação do material) __ 10 minutos
* O tempo de coloração pode variar de acordo com o tipo de material, geralmente entre 30
segundos a 2 minutos.
Observação:
 Na última etapa (Xilol Puro Pós) pode ficar mais que 10 minutos.
Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Sistema
de Coloração de Lâminas Leica AutoStainer XL.
Montagem da Lâmina com Lamínula

 1º - Pingar 2 gotas de resina líquida (Entelan, Permount, Bálsamo do Canadá...);
 2º - Colocar a lamínula sobre a lâmina;
 3º - Pressionar levemente para tirar as bolhas;
 4º - Levar as lâminas até a estufa para secagem ou deixar secando ao ar livre;
 5º - Etiquetar as lâminas.
Contra-coloração com Lugol
OBS: O reagente de Lugol também pode ser utilizado apos coloração com azul de toluidina.
Neste caso, o reagente de Lugol deve ser diluído em agua (1:4), e os cortes corados por
aproximadamente 30 segundos.
Reagente de Lugol
Iodo............................................................................................................ 0,3 g
Iodeto de potassio.......................................................................................1,5 g
Agua destilada........................................................................................... 100 mL
02) Coloração com Azul de Astra e fucsina básica – Para Celulose e Lignina
Artigo: KRAUS, J.E.; SOUSA, H.C.; REZENDE, M.H.; CASTRO, N.M.; VECCHI, C. & LUQUE. 1998. Astra
Blue and Basic Fuchsin Double Staining of Plant Materials. Biotechnic & Histochemistry: 235-243
Aplicação: Coloração de parede primária (celulose) com o Azul de Astra e parede secundária
(Lignina e suberina) com Fucsina Básica.

parafina).
Resultado: Parede primária cora em azul e paredes secundárias em rosa avermelhado.
Reagentes:
Azul de Astra a 3%
Azul de Astra........................................... 3,0g
Água destilada, completar até ................... 100,0 ml
Fucsina básica 0,06%

fucsina básica ............................................... 0,06g
água destilada, completar até ......................... 100,0 ml ou álcool etílico 50%

1º Corar com Azul de Astra a 3% em estufa entre 40 a 45 °C (overnight)
Caso ocorra dobras nas secções, estas deverão ser expandidas novamente: secar as lâminas em
uma placa aquecida a aproximadamente 45ºC por 15 a 30 min.
2º Lavar em água destilada até remoção do corante em excesso.
3º Secar na estufa a aproximadamente 45ºC (overnight).
4º Corar com fucsina básica aquosa a 0,06% por alguns segundos.
5º Lavar em água destilada até remoção do corante em excesso.
6º Secar na estufa a aproximadamente 45ºC (overnight).
6º Montar as lâminas com uma gota de água e lamínula. Resinas (ex: Bálsamo do Canadá)

a aproximadamente 45ºC.

 10º - Azul de Astra (coloração) ______________________________ 1 hora
 11º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 3 minutos
 12º - Fucsina Básica (coloração) _____________________________ 3 minutos
 14º - Álcool 70% (desidratação) _____________________________ 3 minutos
 15º - Álcool absoluto I (desidratação) _________________________ 3 minutos
 16º - Álcool Absoluto II (desidratação) ________________________ 5 minutos
 17º - Xilol I (50% de Álcool 100% e 50% de Xilol) ______________ 5 minutos
 18º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) __ 10 minutos
Observação:
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos.
Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Sistema
de Coloração de Lâminas Leica AutoStainer XL.

03) Cloreto Férrico - Compostos fenólicos não estruturais

(Metodo original: Johansen, 1940)
Aplicação: Reação com compostos fenólicos não estruturais.

parafina).
Resultado: os compostos fenólicos totais coram de marrom a negro.
Reagentes:
Solução Aquosa de Cloreto Férrico a 10%:
Cloreto férrico III..................................10 g
Agua destilada.......................................100 mL

• Coloque os cortes em solução aquosa de cloreto ferrico III por 1 hora;
• Lave rapidamente em água;
• Monte em meio hidratado (agua, glicerina ou gelatina glicerinada).

entre 45ºC e 50ºC;
 10º - Cloreto férrico 10% ___________________________________ 15 minutos*
 11º - Água Destilada (lavagem) ______________________________ passagem rápida

04) Sudan – Lipídios
Aplicação: Reação com Lipídios, principalmente os estruturais (cutina e ceras).
Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído metacrilato ou

parafina).
Resultado: os lipídios coram de alaranjado com Sudan III (Figura 1), de vermelho com Sudan
IV e de azul a negro com Sudan black B.
Reagente:
Sudan III, IV ou Black B a 3% em Etanol 70%:
Sudan (III, IV ou black B)...............................3g
Etanol 70% ...................................................100mL
 Aqueça até a solução entrar em ebulição. Deixe esfriar.
 Utilize o sobrenadante da solução.

(Método original: O’Brien e McCully, 1981)
• Coloque a lâmina com os cortes em placa de petri, forrada com papel filtro saturado
com água;
• Pingue algumas gotas de Sudan recém-filtrado sobre os cortes;
• Tampe a placa de petri (evitar a evaporação do solvente e a formação de precipitados)
• Aguarde de 30 a 60 minutos;
• Lave delicadamente em uma placa de petri com agua (o metacrilato “enruga” em contato
com a solução alcoólica e os cortes podem descolar nesse momento);
• Seque em temperatura ambiente;
OBS: A inclusão em metacrilato ou parafina pode extrair parcialmente lipídios de reserva

(triacilgliceróis), mas preserva lipídios estruturais (cutina e ceras).

Passo a Passo da Coloração:

 5º - Sudan (coloração) _____________________________________ 1 hora
 6º - Álcool 70% (lavagem) _________________________________ passagem rápida
 7º - Água Destilada (lavagem) ______________________________ passagem rápida

05) Azul Brilhante de Coomassie (CBB):
Aplicação: Reação com proteínas.

parafina).
Resultado: os corpos proteicos coram de azul claro.
Reagentes:
Solucao de Azul Brilhante de Coomassie
0,400g .................................................100ml de Solução Clarck
- Diluir o Azul na solução de Clarck.
Solução Clarck:
25 ml de ácido acético P.A. ..........................75ml de Álcool Etílico Absoluto P.A.

- Colocar as lâminas em placas de petri;
- Cobrir as lâminas com cuidado com a solução de Azul Brilhante de Coomassie;
- Deixar por 30 minutos;
- Lavar em solução de Clarck por aproximadamente 5 min;
- Lavar em água destilada rapidamente;


 3º - Álcool 100 % ________________________________________ 5 minutos
 4º - Solução de Azul Brilhante de Coomassie___________________ 15 minutos*
 5º - Solução de Clarck (lavagem) ____________________________ 5 minutos
 6º - Água Corrente (lavagem) _______________________________ rapidamente
 7º - Secar em estufa a aproximadamente 45ºC __________________ 1 hora
 8º - Xilol Puro (Fixação do corante e conservação do material) _____ 10 minutos
minutos a 1 hora.
Observação:
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos.

06) Ácido Periódico de Schiff ( PAS)
Aplicação: Reage com Polissacarídeos Neutros.

O ácido periódico oxida os grupos 1,2 glicerol dos polissacarídeos neutros, assim expõe
grupos aldeídos. Estes grupos reagem com a fucsina e geram a cor rósea.

parafina).
Resultados: polissacarídeos neutros coram de rosa magenta.
Controle: aplique o método sem a oxidação em acido periódico.
Reagentes:
Ácido Periódico 1%
1g de ácido periódico ...................................... 100ml de água destilada
-Armazenar na geladeira.
Reativo de Schiff
Reagentes: 200ml de água destilada, 1,5g de fucsina básica, 9g de bissulfito de sódio, 10ml de
ácido clorídrico P.A. e 2 colheres de carvão ativado.
- Colocar a água destilada no erlemeyer grande (de 1L) e colocar para ferver;
- Quando a água estiver fervendo colocar a fucsina básica. Após retira-se e agita-se;
- Deixar esfriar até 60°C e então acrescentar o bissulfito de sódio (na capela);
- Mexer bem e aos poucos colocar o ácido clorídrico (na Capela);
- Agitar bem e enrolar o frasco em papel alumínio;
- Deixar overnight no escuro;
- Depois deste tempo, colocar papel filtro com carvão ativo e filtrar. Deve ficar transparente;
- Armazenar na geladeira.

- 30 min de ácido periódico – no claro;
- 20 min lavagem com água corrente;
- 30 min reativo de schiff - no escuro;
- 20 min de lavagem com água corrente;
OBS: Antes de secar as lâminas pode-se contra corar com hematoxilina (para destacar os
núcleos).


 10º - Ácido periódico _____________________________________ 30 minutos
 11º - Água Corrente (lavagem) _______________________________ 20 minutos
 12 - Reativo de Schiff (no escuro) ____________________________ 30 minutos*
 14º - Secar em estufa a aproximadamente 45ºC___________________ 1 hora
minutos a 1 hora.
Observações:
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos;
 Antes de secar as lâminas pode-se contra corar com hematoxilina (para destacar os
núcleos).
Sequência:
07) Alcian Blue + Ácido Periódico de Schiff ( PAS)
Aplicação: O Ácido Periódico de Schiff reage com polissacarídeos neutros e o Alcian Blue
com polissacarídeos ácidos.
Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (de preferência
parafina).
Resultados: polissacarídeos neutros coram de rosa magenta e polissacarídeos ácidos de azul.
Reagentes:
Ácido Periódico 1%
 Ver item 06
Reativo de Schiff
 Ver Item 06
Ácido Acético 3%
Ácido acético glacial...................................3mL
Água Destilada............................................97mL
Alcian Blue 1% (pH 2,5)

Alcian Blue 8GN.........................................1g
Ácido acético glacial...................................3mL
Água Destilada............................................97mL
 Agitar bem e filtrar com papel filtro.

 10º - Ácido Ácético 3% ____________________________________ 3 minutos
 11° - Alcian Blue 1% ______________________________________ 30 minutos
 12º - Ácido periódico _____________________________________ 30 minutos
 14 - Reativo de Schiff (no escuro) ____________________________ 30 minutos*
 16º - Secar em estufa a aproximadamente 45ºC___________________ 1 hora
minutos a 1 hora.
Observações:
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos;
 Antes de secar as lâminas pode-se contra corar com hematoxilina (para destacar os
núcleos).


Protocolo Histoquímicas LAMEB 2018 5

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Protocolo Histoquímicas LAMEB 2018 5

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB

PROTOCOLO PARA HISTOQUÍMICAS

O termo histoquímica é utilizado para descrever métodos que identificam e localizam

01) Azul de Toluidina (ATO) – Para Carboidratos Ácidos

Aplicação: Reação com grupos ácidos de componentes teciduais (radicais carboxílicos,

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

Resultado: o azul de toluidina é um corante metacromático, que exibe coloração diferente de

Protocolo para Secções em Historesina:

- Passo a Passo da Coloração:

Montagem da Lâmina com Lamínula

Contra-coloração com Lugol

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

Resultado: Parede primária cora em azul e paredes secundárias em rosa avermelhado.

Fucsina básica 0,06%

Protocolo para Secções em Historesina:

Protocolo para Secções em Parafina:

- Passo a Passo da Coloração:

Montagem da Lâmina com Lamínula

03) Cloreto Férrico - Compostos fenólicos não estruturais

Aplicação: Reação com compostos fenólicos não estruturais.

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

Resultado: os compostos fenólicos totais coram de marrom a negro.

Protocolo para Secções em Historesina:

Protocolo para Secções em Parafina:

• Monte em meio hidratado (agua, glicerina ou gelatina glicerinada).

Aplicação: Reação com Lipídios, principalmente os estruturais (cutina e ceras).

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído metacrilato ou

Protocolo para Secções em Historesina:

OBS: A inclusão em metacrilato ou parafina pode extrair parcialmente lipídios de reserva

Protocolo para Secções em Parafina:

Passo a Passo da Coloração:

• Monte em meio hidratado (agua, glicerina ou gelatina glicerinada).

Aplicação: Reação com proteínas.

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

Resultado: os corpos proteicos coram de azul claro.

Protocolo para Secções em Historesina:

Protocolo para Secções em Parafina:

Passo a Passo da Coloração:

Montagem da Lâmina com Lamínula

Aplicação: Reage com Polissacarídeos Neutros.

Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou

Resultados: polissacarídeos neutros coram de rosa magenta.

Controle: aplique o método sem a oxidação em acido periódico.

Protocolo para Secções em Historesina:

Protocolo para Secções em Parafina:

Passo a Passo da Coloração:

Montagem da Lâmina com Lamínula

07) Alcian Blue + Ácido Periódico de Schiff ( PAS)

Resultados: polissacarídeos neutros coram de rosa magenta e polissacarídeos ácidos de azul.

Alcian Blue 1% (pH 2,5)

Passo a Passo da Coloração:

Montagem da Lâmina com Lamínula

Você também pode gostar