Protocolos Histológicos

1º Coleta e Dissecação

§ Se o órgão for muito grande deve-se fazer a macrotomia deste antes;

§ Colocar as secções em cassetes e identifica-los a lápis.

2º Fixação

§ Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular,

estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo
assim a arquitetura normal do tecido.
§ Os fixadores também fornecem maior resistência ao tecido para suportar as demais etapas;
§ Dependendo do tipo de análise deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, para
análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído tamponado.
Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência.
§ Para microscopia de luz branca o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode-se utilizar
também o paraformaldeído.
§ O volume do fixador deve ser em torno de 10 a 20x o volume das amostras.
§ 12 a 48 horas de duração

FIXADORES:
PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO – pH 7,2
PFA (Paraformaldeído) ............................................... 12 g
PBS 0,2M .................................................................... 150 mL
PBS (1 litro) – acertar pH para 7,4/7
NaCl ............................................................................. 8 g
Na2HPO4 (fosfato de sódio dibásico) .......................... 1,15 g
KH2PO4 (fosfato de potássio monobásico) ................. 0,2 g
KCl ................................................................................ 0,2 g
Água Destilada ............................................................. 1000 mL

Preparo e observações:
§ Misturar a solução com o imã (peixinho) e com a temperatura ligada até 70°C,
acrescentando aos poucos o PFA;
§ A solução demora para homogeneizar;
§ O material deve permanecer no fixador de 12-24h.
3º Processamento
§ Esta etapa consiste na impregnação do tecido por uma substância de consistência firme que
permita, posteriormente, a realização de secções finas (5 a 10 µm);
§ Devido ao preço, fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste
procedimento;
§ Como a parafina não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a
desidratação das amostras, quando ocorre então a retirada da água dos tecidos através da
substituição por álcool etílico;
§ A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos,
por xilol, solvente que é ao mesmo tempo miscível em álcool e parafina;
§ Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60°.

1. DESIDRATAÇÃO

Álcool etílico 30 % .................................................................. 1 hora

Álcool etílico 50 % .................................................................. 1 hora
Álcool etílico 70 % .................................................................. 1 hora
Álcool etílico 80 % .................................................................. 1 hora
Álcool etílico 90 % .................................................................. 1 hora
Álcool etílico 100 % I .............................................................. 1 hora
Álcool etílico 100 % II ............................................................. 1 hora
Observação: A amostra pode ser conservada no álcool 70% por alguns dias.

2. DIAFANIZAÇÃO
§ O tecido torna-se transparente e retira gordura dos tecidos

Xilol I ....................................................................................... 1 hora

Xilol II ...................................................................................... 1 hora
Observações:
§ A ausência de turvação indica boa desidratação.
§ Os tecidos não podem ficar muito tempo no Xilol.
§ O Xilol é hidrofóbico, por isso os órgãos inicialmente ficam mergulhados no álcool.
§ Usa-se o Xilol para retirar o álcool, pois este não é miscível em parafina.
 3. IMPREGNAÇÃO
§ A impregnação consiste na infiltração da parafina líquida no material biológico para que
o tecido adquira rigidez suficiente e seja possível a realização de cortes finos.
§ O objetivo desta etapa é eliminar completamente o xilol contido na peça e a total
penetração da parafina nos espaços deixados pela água e pela gordura, antes existentes
no tecido.
§ Neste procedimento, também é recomendável passar o material mais de uma vez na
parafina líquida, visando garantir uma impregnação eficiente.
§ Esta etapa deve ser realizada em estufa regulada a 60˚ C.
§ Lembrar que a parafina deve ser colocada na estufa, anteriormente à realização desta
etapa, para que ela possa derreter.

Parafina I ............................................................... 1 hora

Parafina II .............................................................. 1 hora
Parafina III ............................................................. 1 hora

Observações:

§ Alguns fatores que podem influenciar no processamento histológico são a temperatura

(temperatura não controlada pode acelerar ou retardar a ação dos reagentes), o vácuo
(aumento de ar no tecido interfere na velocidade de penetração dos reagentes) e a agitação
(agitação não eficiente).
Dicas: Para a realização do procedimento histológico manual:
Na desidratação do tecido realize, várias trocas de álcool, pois a água será eliminada com o
álcool desprezado. Na clarificação, não deixe o material por muito tempo em xilol, pois ele
resseca muito o material, interferindo na sua qualidade. Enquanto na impregnação, nunca
deixe o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a parafina somente é
líquida em temperatura alta, o calor em um longo período de tempo poderá causar grande
dano ao tecido.

4. INCLUSÃO EM PARAFINA

§ Objetivo da inclusão é envolver o exterior do material biológico com a parafina líquida para
formar blocos que serão submetidos posteriormente à microtomia.
§ Nesta etapa o material é colocado com a superfície (clivada) a ser cortada para baixo em um
molde para inclusão, que será preenchido com a parafina líquida, e em seguida coberto com
o cassete.
§ Após o resfriamento, os blocos de parafina com o material incluído são obtidos. É
importante estar atento à posição em que as peças serão colocadas no molde, visto que
isso determinará a incidência de corte que será realizada.

Dicas: Nunca coloque o material biológico em contato direto com o molde, sempre coloque um
pouco de parafina antes de inserir o seu fragmento e depois, termine de preencher o molde
com a parafina. Desta forma, evita-se a aderência do material no metal do molde e a
subsequente formação de buracos no bloco de parafina.

3º Embocamento
§ Colocar a parafina no molde de metal e então posicionar a amostra de acordo com o corte
que se pretende realizar (longitudinal, transversal...).
§ Após os blocos estarem duros, esperar pelo menos 24 horas para iniciar o seccionamento. O
ideal é colocar os blocos na geladeira antes de utilizá-los no micrótomo.

4º Microtomia
§ Fazer os cortes de 5 a 10 micrômetros utilizando um micrótomo rotativo
5º Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)

§ Hematoxilina: cor roxa/azul para o núcleo

§ Eosina: cor rosa para o citoplasma
§ Hematoxilina de Harris

Desparafinização:
1) Estufa 50ºC ————————————————————————————————— 1 hora
2) Xilol Puro I ————————————————————————————————— 15 min
3) Xilol Puro II ————————————————————————————————— 15 min

Hidratação:
4) Álcool ABS I —————————————————————————— 1 min (6 merg)
5) Álcool ABS II ——————————————————————————1 min (6 merg)
6) Álcool 50% —————————————————————————— 1 min (6 merg)
7) Água corrente ————————————————————————— 1 min (6 merg)

Coloração:
8) Hematoxilina ————————————————————————————4 a 6 min
9) Água corrente (lavagem) ———————————————————— 1 min (6 merg)
10) Diferenciação com álcool 70% HCl ————————————— rápido (1 passagem)
11) Água corrente ———————————————————————————— 10 min
12) Álcool 80% ——————————————————————————1 min (6 merg)
13) Eosina (coloração) ——————————————————————————— 2 min

Desidratação:
14) Álcool 95% ou ABS I —————————————————————— 1 min (6 merg)
15) Álcool ABS I ou ABS II —————————————————————— 1 min (6 merg)
16) Álcool ABS II ou ABS III ————————————————————— 1 min (6 merg)
17) Xilol I —————————————-——————————————— 1 min (6 merg)
18) Xilol II ———————————————————————————— 1 min (6 merg)
19) Xilol III ——————————————————————————— 1 min (6 merg)