Curso: Enfermagem Veterinária

Disciplina: Biologia e Histologia

Protocolo 4 – Preparações histológicas.

1 - Objectivos:
1 – Preparar material biológico para cortes histológicos.
2 – Proceder aos cortes, coloração e observação dos cortes.
2 – Introdução:
Com o aperfeiçoamento da microscopia óptica durante todo o século XIX (os melhores
microscópios ópticos foram justamente feitos na última década desse século), tornou-
se necessário criar novas receitas que permitissem o estudo dos tecidos e órgãos de
todo o tipo de seres vivos, com todo o detalhe que a microscopia vinha possibilitar. A
histologia – ciência que estuda os tecidos – desenvolve-se apoiada sobre estes
métodos, hoje verdadeiros clássicos. Também a microscopia electrónica teve de
esperar o aparecimento de novas
receitas para processamento dos
tecidos para, a partir dos anos
cinquenta, tirar todo o partido de
uma invenção bem anterior.
Vamos aqui introduzir os principais
passos de um protocolo padrão de
preparação de tecidos para
observação histológica, que serão
executados ao longo das aulas
desta cadeira.

1 – Colheita do material
A escolha do material para observação depende obviamente do interesse particular do
investigador ou clínico; poderá ser uma biópsia ou necrópsia de um tecido animal ou
vegetal para diagnóstico. Nesse caso o tecido será enviado em frasco devidamente
etiquetado e referenciado para um laboratório de patologia.
2 – O material é seguidamente FIXADO. O objectivo da fixação é a preservação da
estrutura interna dos tecidos e das células, para que os passos que se seguem no
processamento dos tecidos, necessariamente brutais, não alterem essa estrutura. Os
fixadores de um modo geral actuam desnaturando as proteínas, criando ligações entre
elas e “congelando” as estruturas citoplasmáticas. Um tratamento drástico como um
choque térmico pode ser uma fixação suficiente, tal como o ácido acético puro, ou
etanol absoluto, ou mesmo misturas dos dois, como nos fixadores de Carnoy, mas o
uso de aldeídos é hoje certamente mais frequente. Importa chamar a atenção para
dois pontos: 1 – não há fixadores universais, cada um é adequado a seu objectivo. Para
visualizar cromossomas, os aldeídos são de desaconselhar, porque “endurecem”
demasiado as células; uma fixação em Carnoy, ou mesmo em álcool metílico, será
preferível; mas estes são de todo banidos se quiser observar o citoesqueleto. 2 – Os
fixadores também provocam o aparecimento de artefactos, fazem surgir por vezes
estruturas magníficas que não estavam nas células vivas! Quanto mais potentes os
fixadores maior o risco de produzirem artefactos… Em microscopia electrónica, em que
o detalhe é mais fino, esse é um problema bem real…

O fixador mais comum para microscopia óptica é a formalina ou formol (aldeído

fórmico a 4%). Geralmente a solução é preparada a partir de uma solução comercial a
cerca de 40% de aldeído fórmico1; esta solução diluída a 10% é então a formalina. Para
análises de rotina chega; para um trabalho de investigação que requeira uma fixação
melhor, a formalina é preparada diáriamente a partir de paraformaldeído.
Para facilitar a penetração – bastante lenta - destes fixadores nos tecidos, estes devem
ser cortados o mais finamente possível, com espessuras da ordem de alguns mm.
3 - DESIDRATAÇÃO

O passo seguinte é retirar a água dos tecidos (células e matriz extracelular),

substituindo por solventes da parafina, material que irá endurecer a nossa amostra de
forma a permitir o seu corte fino. Vamos então progressivamente substituindo a água
por etanol, imergindo as amostras em soluções de etanol cada vez mais concentradas:

Um esquema possível poderia ser: 30% - 50% - 75% - 90% - 100% Etanol – 100% Etanol,
dez minutos pelo menos em cada solução. Hoje em dia todo este protocolo pode ser
feito em robots de bancada, que tratam de fazer as substituições de forma contínua.
É natural que seja necessário cortar as amostras, já fixadas, em porções mais pequenas
ou em secções mais úteis para a análise; esta é uma boa altura para o fazer, nas
primeiras diluições de etanol (30 ou 50%), depois torna-se mais difícil pois o etanol
tem tendência a evaporar, deixando a amostra seca.
4 – DIAFANIZAÇÃO
Se a parafina não é solúvel em água, ela também o não é em etanol; há que substituir
o etanol por um solvente capaz de levar a parafina para dentro dos tecidos e das
células. Esse solvente é o XILOL ou o benzeno. A esta etapa chama-se diafanização
porque os tecidos ganham um aspecto translúcido, “diáfano”, resultante da
penetração do solvente nas células. Transferem-se os tecidos (ou parte, se não
quisermos processar logo todo o material de cada amostra) do etanol absoluto para
uma mistura 1:1 de Etanol:Xilol e depois 1:3 Etanol:Xilol e finalmente 100% Xilol, duas

1 Como o aldeído fórmico é um gás, é vendido em solução aquosa que satura a 37%
vezes. As amostras devem ficar mergulhadas em cada mistura pelo menos trinta
minutos, à temperatura ambiente. Pode começar agora a
5 – INCLUSÃO
Substitui-se o xilol por uma mistura de 1:1 Xilol:Parafina a 60 graus. A partir daqui
todos os passos da inclusão serão feitos com as misturas quentes, pois a parafina
solidifica à temperatura ambiente. Deixa-se overnight na estufa a 60 graus, e depois
substitui-se por 1:3 Xilol:Parafina; novamente overnight na estufa, depois substitui-se
por 100% Parafina, mais uma vez overnight na estufa, e finalmente uma última dose
de Parafina pura, dentro da estufa. Deixando os tubos abertos, o xilol vai também
evaporando para fora da solução, o que ajudará a chegar aos 100% parafina dentro
dos tecidos.
6 – Preparação dos blocos.
Deita-se a parafina em moldes próprios e deixa-se arrefecer solidificando. Retira-se do
molde o bloco, inclui-se nele o material a observar, tendo o cuidado de orientar a
amostra de forma a ser cortada no melhor ângulo. Depois de bem solidificado, dá-se
ao bloco uma forma de pirâmide truncada, com o material no topo. Deve dar-se uma
forma trapezoidal à superfície de corte, tendo o cuidado de manter as duas linhas
horizontais bem paralelas (figura abaixo, reproduzida de https://mmegias.webs.uvigo.es/02-
english/6-tecnicas/4-mparafina.php). Os blocos estão agora prontos para serem cortados no
micrótomo.
Note-se que este é o
procedimento sugerido, um
entre muitos possíveis; à medida
que os sistemas automáticos se
aperfeiçoam, também as etapas
vão sendo simplificadas.
Resumo:

1 – Fixação em formalina a 10% - 1 semana

2 – Lavagem em água 10’
3 – Desidratação 30 – 50 – 75 – 90 – 100 – 100% etanol, 10’ cada
4 – Diafanização: 1:1 Etanol:Xilol – 1:3 Etanol:Xilol – 100% Xilol – 100% Xilol 30’ cada
5 – Inclusão: 1:1 Xilol:Parafina - 1:3 Xilol:Parafina – Parafina overnight a 60C cada

– Bibliografia e fonte das imagens

Atlas of Plant and Animal Histology, Universidade de Vigo, acedido em
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/4-mparafina.php)