Métodos de Preparo de Material

e a Confecção de Lâminas
Fixação
Os agentes fixadores devem preservar a célula o mais parecido
possível com a célula viva.

• Fixadores físicos: congelamento; calor.

• Fixadores químicos:

- Formalina 10% = 10 ml formol comercial (40%) + 90ml água

- Formol neutro a 10% = 10ml formol comercial (40%) + 90 ml de
um tampão a pH 7. Pode ser tampão fosfato.
Utilizando paraformol em pó, colocar 4g para 100ml tampão.
(Tampão = solução aquosa que evita grandes mudanças de pH.)
- Glutaraldeído a 3% em tampão. Mais usado para microscopia eletrônica.
- Bouin = Ácido pícrico 75ml; formol 25ml; ácido acético 5ml.
- Carnoy = Etanol absoluto 60ml; clorofórmio 30ml; ácido acético glacial 1ml.
Ação fixadora
Fixador aditivo: se liga aos componentes, principalmente proteínas.
Ex. Formol.
Fixador coagulante: deslocamento dos elementos celulares.
Ex. Álcoois.
Fixador extrativo: Ex. Ácido acético - remove proteínas.

Cuidados com a fixação química

1. Rapidez; fixação dentro de alguns minutos após a morte.
2. Tamanho da amostra – quanto menor, melhor.
3. Temperatura de geladeira (+ 4°C).
3. Volume do fixador – dez ou mais vezes o volume da amostra.
4. Agitação periódica.
5. Tempo. Depende do fixador, do material e do tamanho da
amostra. Formol e Bouin = 12-24-48h. Carnoy ½ a 2h.

Lavagem – em água corrente, “overnight” ou por mais tempo.

 Preparo para o corte
Rigidez permite o corte fino. Obtido com congelamento ou inclusão
num meio de dureza adequada. Ex. Parafina ou historesina.

Exigências para a inclusão :

1) Desidratação para permitir a embebição num meio compatível.

Série alcoólica crescente passando o material por álcool 30%, 50%,
70%, 80%, 95% e álcool absoluto.

2) Clareamento Torna mais transparente o tecido de aspecto leitoso.

Realizado em xilol, que também é solvente de parafina,
misturando-se com este meio.
3) Inclusão

Três banhos de parafina líquida, mantidos em estufa a 56-60°C,

para a substituição do solvente. Resfriamento na forma de
um bloco.

4) Corte
O bloco é montado sobre um suporte de madeira e cortado no
micrótomo com espessuras entre 5 a 7 µm.
Material congelado em criótomo produz cortes mais espessos,
p/ex. 10-20 µm.
Os cortes são depositados sobre lâminas.

5) Desparafinização
Cortes já montados são levados à estufa para derreter a parafina e
também podem ser tratados com xilol que dissolve a parafina.
6) Rehidratação
Se pretende usar um corante hidrosolúvel, as lâminas passam por uma
série decrescente de álcool, começando com banhos de álcool absoluto
e terminando em água.

7) Coloração
As lâminas passas por banhos em um ou mais corantes, dependendo
dos resultados desejados. Tempo a ser ajustado para cada material.

8) Desidratação
Para obter lâminas permanentes, usa-se meios hidrofóbicos para a
montagem das lamínulas sobre o corte, e portanto o corte deve passar
por uma série alcoólica crescente ou, em alguns casos, a secagem
ao ar ou em estufa.

9) Montagem da lâmina.
A lamínula é montada usando bálsamo do Canadá ou resinas sintéticas
para preencher o espaço entre lâmina e lamínula.
Esfregaços
Usado para células em suspensão como sangue, espermatozóides.
 Esmagamentos
Usado para tecidos que se desassociam com facilidade, como medula
espinhal, raiz de cebola hidrolisada. Pode ser usado para material a
fresco e depois descartado, ou ser fixado, corado, desidratado e montado
para obter uma preparação permanente.

Cortes a fresco
Cortes realizados à mão livre, com gilete, com ou sem apoio de um
Material duro em volta do objeto de estudo. Muito usado para vegetais.
 Decalque (também “imprint”)

Usado para tecidos que separam seus componentes ao tocar em uma

superfície seca. Por exemplo, é usado para fígado e resulta na quebra
das células e deposição dos núcleos íntegros e, eventualmente,
alguns restos de citoplasma que são geralmente lavados
e removidos durante o preparo da lâmina.
 Corantes Vitais

Corantes usados para uma observação rápida, sem fixação prévia. Não
são preparações permanentes. Serve para uma primeira investigação,
por exemplo no campo, ou numa escola com poucos recursos.
Exemplos: Orceína lacto-acética, Violeta genciana.

Corantes Usualmente Empregados para

Lâminas Permanentes

1) Hematoxilina-Eosina. Dois corantes usualmente empregados uma

seguida da outra para evidenciar núcleo (corado pela hematoxilina)
e citoplasma (eosina). São corantes tradicionais cujo mecanismo
de coloração não é bem conhecido.

2) Giemsa – Mistura de corantes incluindo eosina, azul de metileno e outros,

geralmente preparado com a mistura comercial e variações do meio em
que é dissolvido. Preferido para sangue e preparações de cromossomos.