ANÁ LISE DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES POR TUBOS MÚ LTIPLOS- testagem

quantitativa- INDICADOR TUBO INVERTIDO DE DURHAN E NÃ O AZUL DE BROMOCRESOL- O

método de contagem NMP é meonos sensível que UFC em 10%
ANÁ LISE DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES POR MEMBRANA FILTRANTE- testagem
quantitativa- (mais sensível)- MEIO COM INDICADOR DE AZUL DE BROMOCRESOL COMO
INDICADOR- Contagem com fó rmula UFC
DOIS TESTAGEM QUALIFICATIVAS:
Métodos rápidos Colilert e Colitag
MEIOS DE CULTURAS E SOLUÇÕES

A seguir sã o descritas as fó rmulas dos meios de cultura e soluçõ es, bem como os modos de preparo,
formas de armazenamento e prazos de validade. Para o preparo dos meios de cultura e soluçõ es
devem ser usados meios desidratados e reagentes de qualidade comprovada. Deve-se evitar o
aquecimento excessivo durante a dissoluçã o e a esterilizaçã o. O tempo transcorrido entre seu
preparo e a esterilizaçã o nã o deve exceder duas horas.

I. Caldo lauril triptose com púrpura de bromocresol - CLT (concentraçã o dupla)

 Fó rmula:
Triptose ............................................................................................................ 40,0 g
Lactose ............................................................................................................ 10,0 g Fosfato dipotá ssico
(K2HPO4)............................................................................. 5,5 g
Fosfato monopotá ssico (KH2PO4). ..................................................................... 5,5 g
Cloreto de só dio (NaCl) .................................................................................... 10,0 g
Lauril sulfato de só dio ........................................................................................ 0,2 g
Pú rpura de bromocresol ................................................................................... 0,02 g
Á gua purificada ........................................................................................... 1000 mL
pH final apó s esterilizaçã o: 6,8 ± 0,2

a) Preparo:

Pesar 0,02 g de pú rpura de bromocresol e acrescentar 20 mL de á gua purificada. Aquecer,

agitando até a completa dissoluçã o e reservar essa soluçã o. Pesar o meio desidratado Caldo
lauril triptose no dobro da quantidade especificada no frasco e acrescentar 980 mL de á gua
purificada. Aquecer, agitando frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando
cuidado para que nã o seja atingida a temperatura de ebuliçã o. Adicionar a soluçã o de pú rpura
de bromocresol preparada e misturar por agitaçã o. Distribuir em tubos de ensaio de tampa
frouxa ou de rosca de 18 mm x 180 mm, contendo em seu interior um tubo de fermentaçã o
invertido de 7 mm x 45 mm, volumes adequados para que o volume final, apó s esterilizaçã o,
seja de 10 mL. Fechar os tubos e esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

b) Armazenamento:

O meio preparado poderá ser estocado à temperatura inferior a 30°C, em local limpo e ao
abrigo da luz, durante, no má ximo duas semanas para os tubos com tampa frouxa e três meses
para os tubos com tampa de rosca.

II. Caldo lauril triptose com púrpura de bromocresol - CLT (concentraçã o simples)

 Fó rmula:
Triptose ............................................................................................................ 20,0 g
Lactose ............................................................................................................ 5,00 g
Fosfato dipotá ssico (K2HPO4)........................................................................... 2,75 g
Fosfato monopotá ssico (KH2PO4) .................................................................... 2,75 g
Cloreto de só dio (NaCl). ................................................................................... 5,00 g
Lauril-sulfato de só dio ...................................................................................... 0,10 g
Pú rpura de bromocresol ................................................................................... 0,01 g
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL
pH final apó s esterilizaçã o: 6,8 ± 0,2

a) Preparo:

Pesar 0,01 g de pú rpura de bromocresol e acrescentar 10 mL de á gua purificada. Aquecer, agitando

até a completa dissoluçã o e reservar essa soluçã o. Pesar o meio desidratado Caldo lauril triptose na
quantidade especificada no frasco e acrescentar 990 mL de á gua purificada. Aquecer, agitando
frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando cuidado para que nã o seja atingida a
temperatura de ebuliçã o. Adicionar a soluçã o de pú rpura de bromocresol preparada e misturar por
agitaçã o. Distribuir em tubos de ensaio de tampa frouxa de 16 mm x 150 mm ou de rosca de 15 mm
x 150 mm, contendo em seu interior um tubo de fermentaçã o invertido de 7 mm x 45 mm, volumes
adequados para que o volume final, apó s esterilizaçã o, seja de 10 mL. Fechar os tubos e esterilizar
em autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

b) Armazenamento

O meio preparado poderá ser estocado à temperatura inferior a 30°C, em local limpo e ao abrigo da
luz, durante, no má ximo, duas semanas para os tubos com tampa frouxa e três meses para os tubos
com tampa de rosca.

III. Caldo Lactosado com verde brilhante e bile a 2% (CLVBB)

 Fó rmula:
Peptona ............................................................................................................ 10,0 g
Lactose ............................................................................................................ 10,0 g
Bile de boi desidratada ..................................................................................... 20,0 g
Verde brilhante. ............................................................................................ 0,0133 g
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL

a) Preparo:

Pesar o meio desidratado Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% na quantidade
especificada no frasco e acrescentar 1000 mL de á gua purificada. Aquecer, agitando
frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando cuidado para que nã o seja atingida a
temperatura de ebuliçã o. Distribuir em tubos de ensaio de tampa frouxa de 16 mm x 150 mm ou de
rosca de 15 mm x 150 mm, contendo em seu interior um tubo de fermentaçã o invertido de 7 mm x
45 mm, volumes adequados para que o volume final, apó s esterilizaçã o, seja de 10 mL. Fechar os
tubos e esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

b) Armazenamento:

O meio preparado poderá ser estocado à temperatura inferior a 30°C, em local limpo e ao abrigo da
luz, durante, no má ximo, duas semanas para os tubos com tampa frouxa e três meses para os tubos
com tampa de rosca.

IV. Caldo EC

 Fórmula:
Triptose ou tripticase ........................................................................................ 20,0 g
Lactose .............................................................................................................. 5,0 g
Mistura de sais biliares ....................................................................................... 1,5 g
Fosfato dipotá ssico (K2HPO4)............................................................................. 4,0 g
Fosfato monopotá ssico (KH2PO4). ..................................................................... 1,5 g
Cloreto de Só dio (NaCl) ..................................................................................... 5,0 g
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL
pH final apó s esterilizaçã o: 6,9 ± 0,2

a) Preparo:

Pesar o meio EC desidratado na quantidade especificada no frasco e acrescentar 1000 mL de á gua

purificada. Aquecer, agitando frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando cuidado
para que nã o seja atingida a temperatura de ebuliçã o. Distribuir volumes de 5 mL em tubos de
ensaio tampa frouxa de 12 mm x 120 mm, contendo em seu interior um tubo de fermentaçã o
invertido de 5 mm x 40 mm. Fechar os tubos e esterilizar em autoclave a 121ºC, durante 15
minutos.

b) Armazenamento:

O meio preparado poderá ser estocado à temperatura inferior a 30°C, em local limpo e ao abrigo da
luz, durante, no má ximo, duas semanas.

V. Caldo EC com MUG

 Fó rmula:
Triptose ou tripticase ........................................................................................ 20,0 g
Lactose .............................................................................................................. 5,0 g
CETESB / L5.202 (janeiro/2018) 10 Mistura de sais
biliares ....................................................................................... 1,5 g
Fosfato dipotá ssico (K2HPO4)............................................................................. 4,0 g
Fosfato monopotá ssico (KH2PO4). ..................................................................... 1,5 g
Cloreto de Só dio (NaCl) ..................................................................................... 5,0 g
4-Metilumbeliferil-β-D-glicuronideo (MUG) ....................................................... 0,05 g
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL
pH final apó s esterilizaçã o: 6,9 ± 0,2

a) Preparo:

Pesar o meio EC MUG desidratado na quantidade especificada no frasco e acrescentar 1000 mL de

á gua purificada. Aquecer, agitando frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando
cuidado para que nã o seja atingida a temperatura de ebuliçã o. Distribuir volumes de 10 mL em
tubos de ensaio tampa frouxa de 16 mm x 150 mm ou de rosca de 15 mm x 150 mm. Fechar os
tubos e esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos. Importante: - Os tubos utilizados para
distribuiçã o nã o devem ser autofluorescentes sob luz ultravioleta de 365 -366 nm. - Nã o é
necessá rio colocar o tubo de fermentaçã o invertido.

b) Armazenamento:

O meio preparado poderá ser estocado à temperatura inferior a 30°C, em local limpo e ao abrigo da
luz, durante, no má ximo, duas semanas para os tubos com tampa frouxa e três meses para os tubos
com tampa de rosca.

VI. Ágar m-Endo LES

 Fó rmula:
Extrato de levedura ............................................................................................ 1,2 g
Casitona ou Tripticase ........................................................................................ 3,7 g
Tiopeptona ou tiotona ......................................................................................... 3,7 g
Triptose .............................................................................................................. 7,5 g
Lactose .............................................................................................................. 9,4 g
Fosfato dipotá ssico (K2HPO4)............................................................................. 3,3 g
Fosfato monopotá ssico (KH2PO4). ..................................................................... 1,0 g
Cloreto de Só dio (NaCl) ..................................................................................... 3,7 g
Desoxicolato de só dio ........................................................................................ 0,1 g
Lauril sulfato de só dio ...................................................................................... 0,05 g
Sulfito de só dio (Na2SO3) ................................................................................... 1,6 g
Fucsina bá sica ................................................................................................... 0,8 g
Á gar .................................................................................................................... 15 g
Á gua purificada (contendo 20 mL de á lcool etílico 95%) .............................. 1000 mL
pH final apó s esterilizaçã o: 7,2 ± 0,2

a) Preparo:

Pesar o meio desidratado Á gar m-Endo LES na quantidade especificada no frasco e acrescentar
1000 mL de á gua purificada contendo 20 mL de á lcool etílico 95%. Aquecer, agitando
frequentemente, até a completa dissoluçã o do meio, tomando cuidado para que CETESB / L5.202
(janeiro/2018) 11 nã o seja atingida a temperatura de ebuliçã o. Esfriar até uma temperatura entre
45 e 50°C. Nã o esterilizar em autoclave. Distribuir volumes de aproximadamente 12 mL em placas
de Petri de 15 mm x 100 mm ou 15 mm x 90 mm.

b) Armazenamento:

O meio preparado deverá ser armazenado em refrigerador (2 a 8°C), ao abrigo da luz, durante, no
má ximo, duas semanas.

VII. Água de diluição

 Fó rmula:
Solução-estoque A ........................................................................................ 1,25 mL
Solução-estoque B ........................................................................................ 5,00 mL
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL

a) Preparo

Adicionar 1,25 mL da soluçã o-estoque A e 5 mL da soluçã o-estoque B a 1000 mL de á gua purificada.

Distribuir, em frascos de diluiçã o com tampa de rosca, quantidades adequadas para que o volume
final, apó s esterilizaçã o, seja de 90 ± 2 mL. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos. pH
final apó s esterilizaçã o: 7,2 ± 0,1.

b) Armazenamento

A á gua de diluiçã o preparada poderá ser estocada à temperatura inferior a 30°C, em local limpo,
durante, no má ximo, duas semanas.

A. Preparo Solução A

- Fosfato monopotá ssico (KH2PO4) .................................................................... 34,0 g

- Á gua purificada. ........................................................................................... 1000 mL
CETESB / L5.202
 a) Procedimento Solução A

Pesar o fosfato monopotá ssico e colocar em um balã o volumétrico. Acrescentar 500 mL de á gua
purificada e homogeneizar até a completa dissoluçã o do sal, ajustar o pH para 7,2 ± 0,5 com soluçã o
de hidró xido de só dio 1N e completar o volume para um 1000 mL com á gua purificada. Colocar em
frasco com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos. Armazenar em
geladeira (2 a 8°C). Importante: Descartar a soluçã o se ocorrer desenvolvimento de turbidez.

B. Preparo Solução B

- Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) .................................................................. 81,1 g

- Á gua purificada. ........................................................................................... 1000 mL

a) Procedimento Solução B

Pesar o cloreto de magnésio e colocar em um balã o volumétrico. Acrescentar 500 mL de á gua

purificada e homogeneizar até a completa dissoluçã o do sal. Completar o volume para 1000 mL com
á gua purificada. Colocar em frasco com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante
15 minutos. Armazenar em geladeira (2 a 8°C). Importante: Descartar a soluçã o se ocorrer
desenvolvimento de turbidez. - Preparar a soluçã o de uso: Preparo: Adicionar 1,25 mL da soluçã o-
estoque A e 5 mL da soluçã o-estoque B a 1000 mL de á gua purificada. Distribuir, em frascos de
diluiçã o com tampa de rosca, quantidades adequadas para que o volume final, apó s esterilizaçã o,
seja de 90 ± 2 mL. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos. pH final apó s esterilizaçã o:
7,2 ± 0,1 c) armazenamento: A á gua de diluiçã o preparada poderá ser estocada à temperatura
inferior a 30°C, em local limpo, durante, no má ximo, duas semanas.

VIII. Solução de hidróxido de sódio 1N

 Fó rmula:
Hidró xido de só dio (NaOH). ............................................................................. 40,0 g
Á gua purificada ............................................................................................ 1000 mL

a) Preparo:

Pesar 40,0 g de hidró xido de só dio (NaOH) e dissolver em 1000 mL de á gua purificada. Armazenar
em frasco com tampa de rosca.

b) Armazenamento:

Armazenar a temperatura ambiente por um período de 6 meses.

COLORAÇÃO DE GRAM

a) Solução de Cristal Violeta

Preparo: Dissolver 2,0 g de cristal violeta em 20 mL de á lcool etílico 95%. Dissolver 0,8 g de oxalato
de amô nio em 80 mL de á gua purificada. Misturar estas soluçõ es e deixar em repouso por 24 horas
antes do uso. Filtrar através de papel de filtro em um frasco â mbar ou protegido da luz com tampa
rosqueada.

b) Solução de Lugol
Preparo: Colocar 2,0 g de iodeto de potá ssio (KI) e 1,0 g de cristais de iodo em um almofariz e
acrescentar aos poucos cerca de 5 mL de á gua purificada, triturando até a completa dissoluçã o dos
cristais. Enxaguar e transferir para um frasco â mbar ou protegido da luz com tampa de rosca,
adicionando á gua purificada até completar o volume de 300 mL.
 c) Solução de Safranina (pode ser Fucsina)
Preparo: Dissolver 2,5 g de safranina em 100 mL de á lcool etílico 95%, preparando-se, assim, a
soluçã o-estoque de safranina. No momento do uso, diluir 10 mL dessa soluçã o-estoque em 100 mL
de á gua purificada.
d) Solução de álcool-acetona
Preparo: Misturar volumes iguais de á lcool etílico 95% e acetona.

OBS: Coloraçã o diferencial, através da qual as bactérias sã o classificadas em Gram-positivas ou

Gramnegativas, dependendo da retençã o ou nã o do corante cristal-violeta. As bactérias, nas quais o
cristal-violeta é retido, apresentam coloraçã o roxa (Gram-positivas), e aquelas nas quais o cristal-
violeta é removido pela açã o do á lcool-acetona, coram-se posteriormente pela safranina,
apresentando coloraçã o rosa (Gram-negativas).

LEITURA

A aná lise de coliformes termotolerantes foi realizada pela técnica de membrana filtrante, utilizando-
se o á gar mFC (Difco), e a diferenciaçã o para E. coli foi feita com o uso do meio ECMUG (Difco)
conforme descrito no “Standard Methods” (APHA 2005b). Foram filtrados volumes variáveis, de
acordo com grau de contaminaçã o da amostra, de forma que fossem obtidas contagens de 20 a 60
colô nias por placa. A incubaçã o foi realizada a 44,5°± 0,2°C durante 24 horas. Apó s esse período, foi
realizada a contagem das colô nias típicas de coliformes termotolerantes, de coloraçã o azul. Para a
diferenciaçã o da E. coli, pelo menos 10 colô nias da placa utilizada para contagem foram transferidas
para o meio EC-MUG, que foi incubado a 44,5°± 0,2°C durante 24 horas. Culturas que apresentaram
fluorescência sob luz UV de comprimento de onda de 365nm foram consideradas provenientes de
colô nias positivas para E. coli. Simultaneamente, as colô nias submetidas à diferenciaçã o com EC-
MUG foram inoculadas em á gar eosina-azul de metileno para isolamento, e as colô nias típicas para
coliforme nesse meio, que eram provenientes de colô nias negativas no meio EC-MUG, foram
submetidas à identificaçã o com uma galeria de testes bioquímicos disponível comercialmente (API
20E, Biomérieux). As amostras coletadas durante o ano de 2005 também foram analisadas pela
técnica de membrana filtrante utilizando-se o á gar m-TEC modificado que contém o substrato
cromogênico 5-bromo-6- cloro-3-indolil ß-D-glicuronídeo para a enzima ß-D-glicuronidase,
presente em 95% das linhagens de E. coli. Apó s filtraçã o e transferência das membranas para esse
meio, as placas foram incubadas a 44,5°± 0,2°C, durante 22 horas, apó s uma pré-incubaçã o de 2
horas a 35± 0,5°C. As colô nias de coloraçã o vermelho-escura (magenta) nesse meio foram contadas
como E. coli sem outras etapas de confirmaçã o (USEPA 2002).