Aula Prtica Saponinas Esteroidais e triterpenicas

Assunto: Identificao de Saponinas e das geninas.

Objetivos:
1 Identificar a presena de saponinas em droga vegetal
2 Identificar o tipo de saponinas (esteroidais ou triterpnicas) atravs da
reao de Liebermann:Burchard.
Introduo:
Saponinas so glicosdeos de esteroides ou de terpenos policclicos. As
saponinas em soluo aquosa formam espuma persistente e abundante. Essa
atividade provm do fato de apresentarem na sua estrutura, uma parte lipoflica e
uma parte hidroflica.
So compostos no nitrogenados que se dissolvem em gua originando
solues afrgenas (espumantes), por diminuio da tenso superficial do lquido.
Apresentam ainda as propriedades de emulsionar leos e de produzir hemlise.
Esta ltima deve-se capacidade do glicosdeo de se combinar com as molculas
de colesterol presentes na membrana dos eritrcitos, perturbando o equilbrio
interno-externo e promovendo a ruptura da clula com consequente liberao da
hemoglobina.

Materiais e reagentes:
1. Saponina padro
2. cido sulfrico P.A.
3.Clorofrmio P.A.
4. Salsaparrilha
5. Ginseng
6. Soluo clorofrmica
salsaparrilha
7. Sulfato de sdio anidro
8. gua destilada
9. Anidrido actico
10. Esptulas Plsticas (2)
11. Balana eletrnica
12. luvas de procedimento (1)
13. Funil (1)
14. Becker de 50 mL (2)
15. Basto de vidro
16. Pipeta de 1 mL
de 17. Pipeta de 2 mL (3)
18. Tubos de ensaio (4)
19. Pera ou pipett
20. Esptulas (2)
21. Suporte universal e aro de funil
22. Grade para tudo de ensaio
PROCEDIMENTO:

Teste para saponinas

1. Identifique dois tubos de ensaio (1: saponina padro; 2:

salsaparrilha).
2. No tubo 1 adicione 0,5g de saponina padro e 2 mL de
gua destilada. Agite fortemente o tubo e observe.
3. No tubo 2 adicione uma pequena quantidade de
salsaparrilha e 2 mL de gua destilada. Agite fortemente
o tubo e observe.

REAO POSITIVA: Formao de espuma persistente

Teste de Liebermann-Burchard

1. E um bquer adicione 1,0 g de saponina/padro e 4

mL de clorofrmio. Filtre em algodo coberto com
pequena quantidade de sulfato de sdio anidro.
2. Identifique dois tubos de ensaio (1: saponina padro;
2: salsaparrilha).
3. No tubo 1 adicione o filtrado da saponina padro + 1
mL de anidrido actico + 3 gts de cido sulfrico.
4. No tubo 2 adicione 2 mL do extrato clorofrmico de
salsaparrilha (preparado no dia anterior) + 1 mL de
anidrido actico + 3 gts de cido sulfrico. Cuidado:
pode ocorrer projeo do lquido, portanto, realizar
procedimento na capela.

Resultados
1. Esteroides livres: Colorao azul transitria, seguida
de verde permanente
2. Triterpenoides pentacclicos: Colorao parda a
vermelha

Liebermann-Burchard
cido sulfrico conc. ....................................... 0,1mL
Anidrido actico ................................................ 5,0 mL

Reagente Liebermann-Burchard
Para a preparao do reagente Liebermann-Burchard, foram transferidos
50,0 mL de anidrido actico para um frasco mbar e mantido em banho de gelo.
Aps 30 minutos em repouso, foram adicionados 5,0 mL de cido sulfrico
concentrado. (KENNY, 1952).

KENNY, A.P. The Determination of Cholesterol by the Liebermann-Burchard.

Reaction Clinical Laboratorie v.52, p.611-619, 1952.
Livro: SAPONINS

Teste de Liebermann-Burchard.
Triterpenos no saturados e hidroxilados e esterides do uma colorao
vermelha, azul ou verde com anidrido actico e cido sulfrico (Abisch e Reichstein,
1960).
Uma vez que as saponinas terpenoides tendem a produzir uma sombra rosa
ou roxa e saponinas esterides uma colorao azul-verde, a diferenciao das duas
classes possvel.

Reagente Liebermann-Burchard. O cido sulfrico concentrado (1 ml)

misturado com anidrido actico (20 ml) e clorofrmio (50 ml). O aquecimento a 85-
90 C d a colorao necessria na placa CCD.
.

Princpios ativos:
Saponinas esteroidais: sarsaponina, esmilasaponina (esmilacina);
Sarsaparilosideo; Agliconas: sarsasa-ponina (parilina), sarsasapogenina
(parigenina), e esmilagenina.
Outras saponinas; diosgenina, tigoge-nina, e asperagenina;
Fitosterois: sitosterol, estigmas-terol, e polinastanol;
Amido; Resina; lcool cetlico; leo voltil; cidos cafeoilshikimico, shikimico,
ferlico, sarspico; Kaempferol, e quercetina; Minerais: alumnio, cromo, ferro,
magnsio, selnio, clcio, zinco e outros; Algumas espcies tm os flavonoides:
isoastilbina, isoengetitina, e astilbina.

Para esteries

Teste 4 (Reao de Lieberman-Buchard) (Relatrio de pratica EBAH - Relatrio IV

Prospeco fitoqumica qualitativa)
 As amostras foram solubilizadas em 5 mL de clorofrmio, mexendo com
basto por 1 minuto. Foi montado o esquema de filtrao usando funil, algodo e
nele pulverizou-se alguns decigramas de NA2SO4 anidro. Em seguida, ocorreu a
filtrao para tubos de ensaio previamente identificados. Em cada tubo adicionou-
se 1 mL de anidrido actico e agitou-se levemente, depois foram juntadas
cuidadosamente 4 gotas de H2SO4 concentrado, agitando suavemente. Observou-
se o desenvolvimento de cores
- Colorao azul evanescente seguida de ver permanente indicativa da
presena de esteroides livres;
- Colorao parda at vermelha indica triterpenoides pentacclicos livres .

1 - Reao de Liebermann-Buchard (reao do ncleo

ciclopentanoperhidrofenantreno):
Objetivo: Identificao do fenantreno.
Procedimento:
Adicionar a 1 cpsula (soluo clorofrmica), 1 mL de anidrido actico.
Passar para 1 tubo de ensaio, e em seguida, adicionar 1 mL de ac. sulfrico
conc. pelas paredes do tubo, sem agitar.
Observar o aparecimento de colorao na zona do contato entre o anidrido
actico e o ac. sulfrico. (NO MOVIMENTAR O TUBO).
Cor azul ou verde provavelmente ncleo esteroidal
Cor vermelha, rosa, prpura ou violeta provavelmente ncleo terpnico

Fonte: http://www.sbfgnosia.org.br/Ensino/drogas_cardioativas.html

2- Reao de Liebermann Burchard

Em tubo de ensaio foram evaporados 2 mL do extrato. Ao resduo foi
adicionado 1 mL de anidrido actico e 10 gotas de cido sulfrico concentrado.
Colorao castanha indica resultado positivo.

2-1. Triterpenides e esterides

Na cromatografia de deteco de triterpenides e esterides em
cromatoplacas MERCK de slica gel F 250, 20 cm por 20 cm, amostras foram
aplicadas no volume de 10 l, intercalando-os com as referncias -amirina e -
sitosterol solubilizadas com metanol. Utilizou-se a fase mvel acetato de etila:
tolueno na proporo (20 : 80 v/v), e revelou-se por nebulizao atravs do
reagente Liebermann Buchard (100 C,durante 5 minutos). Utilizou-se uma
visualizao no visvel e em cmara de UV (365 nm), sendo caracterizada a
presena de triterpenides e esterides atravs do surgimento de manchas com
colorao levemente rsea a avermelhada (SHARMA e BAKHASHI, 1991).

(O reagente de Liebermann-Burchard foi preparado misturando 10 mL de

cido sulfrico concentrado e 10 mL de anidrido actico, posteriormente essa
mistura foi cuidadosamente adicionada a 50 mL de etanol resfriado em banho de
gelo. Este reagente foi utilizado borrifando-se as placas e posteriormente aquecido-
as em placa de aquecimento at 100 C.) DE OUTRO AUTOR
Fonte: SOFIATI, Filipe Toni. ESTUDO FITOQUMICO E ATIVIDADES BIOLGICAS
PRELIMINARES DE EXTRATOS DE POLYGONUM ACRE H.B.K. (POLYGONACEAE) E
SYNADENIUM CARINATUM BOISS (EUPHORBIACEAE). Dissertao, 2009

(Glicosdeos cardiotnicos Extrao: A 2,0 mL de soluo do extrato foram

adicionados 3,0 mL de soluo de acetato de chumbo a 10% e 2,0 mL de gua
destilada. Aqueceu a mistura em banho-maria durante 10 minutos. Em seguida, o
extrato foi filtrado e agitado com 10,0 mL de clorofrmio, separando a fase
clorofrmica em quatro tubos de ensaio. Aps a evaporao do clorofrmio, obteve-
se a formao de resduos nos tubos, os quais foram acrescidos dos seguintes
reagentes:

3- Reao de Liebermann Burchard

Em 1,0 mL da amostra foram acrescentadas gotas de cido actico

acrescida de 3,0 mL anidrido actico/cido sulfrico (50:1, v/v). Resultado positivo:
colorao verde, azul esverdeado, roxo a azul.

Triterpenos
Neste ensaio, com 2,0 mL da soluo etanlica, foi adicionado 5,0 mL de
clorofrmio. Aps filtrao, o extrato foi dividido em duas pores. Em cada um dos
tubos realizaram-se as reaes de Liebermann-Burchard e Salkowski. Os triterpenos
desenvolvem colorao estvel e os esteroides desenvolvem colorao mutvel
com o tempo.

Quanto identificao das classes de triterpenos ou esteroides utilizando o

reagente Lierbermann-Buchard verificou-se a ausncia deste, porm utilizando o
reagente de Salkowski o resultado foi positivo

3.1 Reao de Salkowski para a determinao de ncleo esteroidal. A mudana da

colorao amarela para roxo indica resultado positivo.

Fonte: SILVA, A. C. O da; LIMA, R. A.. Identificao das classes de metablitos

secundrios no extrato etanlico dos frutos e folhas de Eugenia uniflora L..

Esterides /triterpenides
Os testes para Esterides/triterpenides foram realizados pela reao de
Lieberman-Burchard (anidrido actico + cido sulfrico concentrado), tomando 2 ml
do extrato e misturando-o a 2 ml de clorofrmio, em seguida a soluo clorofrmica
foi filtrada gota a gota em um funil com algodo coberto com alguns decigramas de
Na2SO4 anidro. Em tubo de ensaio, adicionou-se 1 ml de anidrido actico, agitando
suavemente, e acrescentou-se cuidadosamente trs gotas de H 2SO4 concentrado,
agitando suavemente e observando, se haveria desenvolvimento de cores.
Colorao azul evanescente seguida de verde, indicou a presena de
esterides/triterpenides respectivamente?

Fonte: N. L. A. da Silva; F. A. A. Miranda & G. M. da Conceio, Scientia Plena 6,

025402 (2010)
Prueba de Liebermann-Burchard: Lprueba es para triterpenos y compuestos
esteroidales. Se disuelven 1.5 mg de muestra en cloroformo y luego se le aaden
unas gotas del reactivo, observndose cambios de coloracin; el reactivo se prepara
agregando una gota de cido sulfrico a una mezcla de 1 mL de anhdrido actico y
1 mL de cloroformo (11).

Prueba de Salkowski: Similar a la de Liebermann-Purachard, la muestra(l-2mg) en

1 mL de cloroformo se pone en contacto con 1 mL de cido sulfrico, desarrolla
colores amarillo o rojo, para esterles y metilesteroles.( 10,11)

As saponinas so glicosdeos de esterides ou de terpenos policclicos. Uma

caracterstica marcante deste grupo de metablitos a sua capacidade em produzir
espuma persistente aps agitao e que no se desfaz pela adio de cidos
diludos. Esta caracterstica se deve ao fato de a molcula possuir uma regio
apolar (ncleo esteroidal ou terpnico aglicona ou sapogenina) e uma polar
(acar), funcionando como um agente emulsificante e detergente (SCHENKEL et
al., 2003).

Fig. Ncleo esteroidal (I) e triterpnico (II) de saponinas

As reaes de identificao das saponinas relacionadas com os ncleos
esteroidal e triterpnico so as reaes de Liebermann-Burchard e de Salkowski
(FALKENBERG et al.,2003).
Na reao de Liebermann-Burchard a cor azul ou verde provavelmente
indica a presena de ncleo esteroidal; e a cor vermelha, rosa, prpura ou violeta a
presena de ncleo triterpnico. Esta reao particular dos compostos esteroidais e
triterpnicos, explicasse pelo fato o reagente de Liebermann-Burchard promover
desidratao e desidrogenao no ncleo fundamental, resultando derivados
corados com duplas conjugadas. Mas este mecanismo ainda no foi totalmente
comprovado. Nos ncleos esterides duas ligas duplas conjugadas no anel B ou
uma liga dupla e um grupo metileno desimpedido no C7 (podendo sofrer oxidao e
desidratao) seriam essenciais para a reao. Nos ncleos triterpenoides parece
que o responsvel pela reao o grupo metileno do C11 (anel C). De acordo com
Roth et al. (1990) para que a reao de Liebermann-Burchard ocorra, necessrio
que haja duplas ligaes nos carbonos 3 e 5, para que o cido sulfrico exera a
influncia sobre o anel e forme o tetraeno dimerizado, que por sua vez atravs de
oxidao leve a formao do ction colorido.
 A Reao de Salkowski empregada para a deteco de esterides
insaturados, atravs da reao com cido sulfrico concentrado. Para realizao
deste teste necessrio retirar o etanol da amostra (FALKENBERG et al., 2003).

Identificao de saponinas
Para a realizao das reaes de identificao de saponinas, a amostra foi
preparada da seguinte forma: 5 g da droga seca e pulverizada foram fervidas sob
refluxo durante 10 min em 30 mL de etanol 50% (v/v). O decocto foi filtrado e o
procedimento repetido mais duas vezes. Foram adicionados 30 mL de acetato de
chumbo neutro a 10% (p/v) aos filtrados e aps esfriar, foram filtrados novamente e
transferidos para uma ampola de separao com adio de 20 mL de gua
destilada. Em seguida a fase aquosa foi extrada com trs pores de clorofrmio
sob agitao leve. Aps a completa separao das fases a poro clorofrmica foi
dividida em duas cpsulas de porcelana e levada a secura em banho-maria.
Para a reao de Liebermann-Burchard a primeira cpsula foi lavada com 1
mL de anidrido actico e a soluo transferida para um tubo de ensaio, onde foi
adicionado 1 mL de cido sulfrico concentrado pelas paredes do tubo sem
agitao. Observou-se ento o aparecimento de colorao na zona de contato
entre o anidrido actico e o cido sulfrico.
Foi evitada a movimentao do tubo para a colorao interfacial no se
desfazer. Se a colorao for azul ou verde, h indicao de saponinas de ncleo
esteroidal; se for vermelha, rosa, prpura ou violeta, provavelmente ncleo
terpnico.
Para a reao de Salkowski foi adicionado 1 mL de cido sulfrico
concentrado pelas paredes da segunda cpsula e o aparecimento de colorao
castanho-escuro avermelhado indica ncleo esteroidal.

ndice de espuma:
Outra tcnica que tambm pode ser utilizada a determinao do ndice de
espuma. (SCHENKEL et al., 2003).
Para a preparao da soluo extrativa utilizada nesta anlise 1,0 g da
droga vegetal pulverizada foi adicionada a um balo de 250 mL com 50 mL de gua
destilada e mantida sob fervura moderada em refluxo, durante 30 min. A soluo foi
resfriada e filtrada para um balo volumtrico de 100 mL. A extrao do mesmo
material foi repetida utilizando-se mais duas pores de 25 mL de gua fervente e
os volumes finais reunidos. O decocto foi ento distribudo em 10 tubos de ensaio
com tampa, em uma srie sucessiva de 1 a 10 mL, e o volume do lquido foi
completado em cada tubo para 10 mL com gua destilada exceto no ltimo tubo,
onde o volume j de 10 mL. Os tubos foram fechados e agitados com movimentos
verticais por 15 s a duas agitaes/s. Depois a soluo foi deixada em repouso por
15 min, e a altura da espuma foi medida. Em seguida foi verificado em qual tubo se
formou um anel de espuma persistente, de aproximadamente 1 cm de altura e que
no desaparece pela adio de 1 ml de HCl 2N (~20%) (HARBORNE, 1998)

Fonte: WOLF, L. G.. Avaliao da qualidade fsico-quimica de drogas vegetais.

Dissertao, 2008.

TCNICAS DE PROSPECO FITOQUMICA E SUA IMPORTNCIA PARA O

ESTUDO DE BIOMOLCULAS DERIVADAS DE PLANTAS

caracterstica de ncleo esteroidal que pde ser melhor evidenciado a

partir do teste de Lieberman-Buchard, obtendo-se a cor azul-esverdeada ao final do
experimento(indicativo de ncleo esteroidal).

I. DETALLES EXPERIMENTALES

Materiales
5 tubos de ensayo
Mortero
Goteros (pasteur)
Quinua
Peseta

Reactivos

cido actico
Anhidrido actico
H2SO4 concentrado
Cloroformo

La muestra de quinua se moli en un mortero hasta polvo, para una

mejor apreciacin de las reacciones de identificacin.
1. Prueba de la espuma
A una solucin acuosa de la muestra se sometio a una agitacin
vigorosa durante 30 segundos, la cual se pudo apreciar la presencia
de saponinas por la formacin de espuma persistente durante unos
minutos.

2. Reactivo de Salkowski
A 2 mg de la muestra en polvo se le aadi aproximadamente 1 mL
de H2SO4 concentrado y luego de 5 gotas de anhidrido actico.

El reactivo de Salkowsky, indica la presencia de saponinas; que

pueden ser triterpenicas o esteroidales.

3. Primera variante de la reaccin de Salkowski

Se disolvi la muestra en polvo con 1mL de cloroformo y se le
agreg unas 10 gotas de anhdrido actico refrigerado, luego unas
gotas de cido sulfrico concentrado, por las paredes.

La coloracin verdosa indica la presencia de saponinas esteroidales

y la coloracin rojiza indica la presencia de saponinas triterpenicas.

4. Segunda variante de la reaccin de Salkowski

Se disolvi la muestra en polvo con 1mL de cloroformo y se le
agrego 1 mL de cido sulfrico concentrado.

Si la coloracin es rojo azulado hasta purpura se le considera

saponina esteroidal, si es rojo colesterol.

5. Reaccin de Liebermann Burchard

Finalmente a una pequea cantidad de muestra en polvo se le
aadi unas 5 gotas de cido actico ms 3mL de AC2O/H2SO4
(50:1).

Si la reaccin da coloracin rosado a purpura se le considera como

saponina triterpenoidales mientras las saponinas esteroidales dan
coloracin verdosa.

Ensayo Coloracin o Resultado

apariencia

Prueba de la espuma Espuma de perduro

por minutos.
Reactivo de Rojo sangre Presencia de
Salkowski Saponinas, pueden
ser triterpenicas o
esteroidales.
Variante A de Rojizo Presencia de
reaccin de saponinas
Salkowski triterpenicas

Variante B de Rojo Presencia de

reaccin de Colesterol
Salkoswki
Reactivo de naranja Presencia de
Liebermann Saponinas
Burchard triterpenicas.

1. Prueba de espuma
2. Reactivo de Salkowski
3. Variante A
4. Variante B
5. Reactivo de Liebermann

En la prueba de la espuma, el resultado perduro por ms de 3 minutos,

lo cual confirma la presencia de saponinas.

En las reacciones de identificacin de Salkowski y Libermann

Burchard, dieron positivas para la presencia de saponinas triterpenicas
ya que estasestubieron en el rango de coloracin que corresponde. En
la reaccin de Salkowski con variante B se pudo comprobar que la
quinua presentaba colesterol (debido a la coloracin roja), este esterol
es el precursor de los esteroides o esteroles, lo cual ya habamos
confirmado su presencia.
O principal teste analtico para deteco de esterides em plantas a prova de
Liebermann-Burchard, que consiste no tratamento da amostra com anidrido
actico em presena de cido actico e algumas gotas de cido sulfrico
ocorrendo a desidratao seguida de oxidao do sistema de anis do
ciclopentanoperidrofenantreno formando um esteride aromtico que
evidenciada pelo aparecimento de uma colorao azul-esverdeada (Burke,
1974; Xiong, 2007).

Reao de liebermann-burchar (esteroides