FACULDADE MAURCIO DE NASSAU DISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR Profa.

Patrcia Haver PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

PREPARAO DO GEL DE AGAROSE GEL DE AGAROSE A 0,8% Agarose 0,4 g TBE 1X q.s.p. 50ml Aquecer a mistura, sob agitao, at a completa fervura. Deixar esfriar at a temperatura de 45C (a temperatura tolerada pela nossa mo sem o auxlio de proteo!) e acrescentar 2,5l de brometo de etdio. Homogeneizar a soluo e vert-la na placa onde o gel ir polimerizar. Observao: 1. O brometo de tidio uma substncia cancergena e como tal deve ser cuidadosamente manipulado. 2. Para que ocorra a formao dos poos no gel de agarose, o pente deve ser colocado imediatamente aps o derramamento do gel na placa, evitando a formao de bolhas, pois estas podem interferir na corrida eletrofortica. 3. Caso ocorra a formao de bolhas no gel, estas devem ser retiradas com o auxlio de uma ponteira descartvel. 4. Todo o material plstico utilizado na confeco do gel contendo o brometo de etdio deve ser descartado em local adequado. 5. As demais vidrarias devem ser descontaminadas, conforme as normas de biossegurana. PREPARAO DO GEL DE AGAROSE PARA A APLICAO DAS AMOSTRAS 1. Aps a preparao do gel, coloc-lo em uma cuba e adicionar o tampo TBE at cobrir totalmente o gel e os eletrodos. 2. Retirar o pente do gel (isto s deve ser feito quando o gel est submerso no tampo) 3. Proceder preparao das amostras para a aplicao no gel: a. Adicionar 10l de DNA obtido na extrao. b. Adicionar 5l de tampo para DNA c. Homogenizar com a pipeta. 4. Aplicar 1l de Peso molecular. 5. Aplicar todo o volume de DNA preparado (15l) dentro do poo formado no gel. 6. Proceder a aplicao das demais amostras. 7. Ao trmino, fechar a cuba e conect-la na fonte. 8. Ajustar a voltagem para 100V, por 20 minutos. 9. Observar o DNA na luz ultravioleta.
SOLUES NECESSRIAS TBE 1X TBE 10X 100ml H2Od q.s.p 1 litro BROMETO DE ETDIO(Esta soluo j foi comprada pronta para uso) Brometo de etdio 1g H2O q.s.p. 100ml Estocar em frasco escuro a 4C. TBE 10X Tris base - 107,8g EDTA (Na2EDTA*2H2O) 7,44g cido brico pa 55g H2Od q.s.p. 1 litro TAMPO PARA DNA Azul de Bromofenol Tris EDTA (TE) 10:1 14ml Glicerol 6ml Autoclavar, aliquotar e congelar.