AVALIAO DA CINTICA DE CRESCIMENTO NOS MEIOS (2XTY E TB) PARA

A PRODUO DE ANTGENO KMP-11 DE LEISHMANIA CHAGASI.

1

Sirtys S. L de Andrade, 2 Roberta V. A. Chaves,

1
2
3

Mrcia R. S. Pedrini,

Gorete R. de Macedo

Bolsista de iniciao Cientfica PIBIC/CNPq/UFRN, discente do curso de Engenharia Qumica.

Aluno da Ps-Graduao do Programa de Ps Graduao em Engenharia Qumica da UFRN/RN
Professor do Departamento de Engenharia Qumica UFRN/RN

1,2

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Engenharia Qumica, Centro de Tecnologia.
Av Sem. Salgado Filho, 3000, Campus Universitrio, Natal RN, CEP: 59.072-970, Natal
e-mail: gomacedo@eq.ufrn.br
RESUMO - As Leishmanioses so enfermidades que produzem manifestaes cutneas,
mucocutneas e viscerais. No Brasil cerca de duas mil pessoas so infectadas, sendo
que 92% dos casos acorrem no Nordeste. Neste contexto, o presente trabalho tem como
objetivo avaliar a cintica de crescimento de Escherichia coli recombinante nos meios
2xTy e TB para produzir o antgeno KMP-11 de Leishmania chagasi. Na primeira etapa
foram realizados ensaios sem induo em incubador rotativo a 37C, 200rpm e pH inicial
7,0 para avaliar o crescimento microbiano nos meios. Avaliou-se a mxima velocidade
especfica de crescimento (xmx) que para ambos os meios foi 0,1h-1. O fator de
converso de substrato em clula (YX/S), para o meio 2xTy e TB foi 0,8 e 0,83
respectivamente. Na segunda etapa, foram realizados ensaios nas mesmas condies
de cultivo, nos quais, se realizou a induo por IPTG. A verificao da expresso do
antgeno foi feita por eletroforese SDS-PAGE. Nas cinticas com induo foram
analisados: fator de converso de substrato em produto (YP/S), e a mxima velocidade
-3
especfica de produo (Pmax). O fator de converso encontrado foi 1,1x10 para os dois
-1
meios. A mxima velocidade especfica de produo (Pmax), foi 0,16 h e 0,13 h-1 para
os meios 2xTy e TB, respectivamente.

Palavras-chave: antgeno recombinante, induo, eletroforese

INTRODUO
A leishmaniose foi relatada no Brasil em
1936, primeiramente na regio Nordeste
(Evans et al., 1992). De acordo com a espcie
podem produzir manifestaes cutneas,
cutneas difusas, mucocutneas e viscerais
(Dossi, 2006). A Leishmaniose Visceral
Americana

causada
pela
espcie
Leishmania chagasi, um parasita intracelular
obrigatrio (Martins et al., 2006).
Comumente chamada de calazar, a
leishmaniose, atinge cerca de duas mil
pessoas por ano no Brasil, sendo que cerca de
92% dos casos ocorrem no Nordeste (S,
2006). Devido ao alto custo e a alta toxidade
das drogas atualmente usadas na cura da
leishmaniose faz-se necessria a busca de
tratamentos alternativos mais eficazes e
menos agressivos ao organismo (Rath et al.,
2003). Por isso h um interesse especial na
produo
de
antgenos
atravs
de
microrganismos
recombinantes
para
a

produo de protenas heterlogas de

interesse (Cha et al., 2005), visando sua
aplicao em soros e vacinas.
A Escherichia coli , atualmente, o
microrganismo mais conhecido e estudado. O
conhecimento de sua fisiologia permitiu o
desenvolvimento de tcnicas de manipulao
gentica, visando produo de protenas
recombinantes de interesse, como por
exemplo, antgeno de Leishmania chagasi
(Liria, 1995; Choi & Lee, 2004; Makrides,
1996).
O antgeno Kinetoplastid membrane
protein-11 (KMP-11) uma protena presente
na superfcie da membrana em todos os
membros da famlia Kinetoplastidae. Devido a
sua alta conservao, um antgeno
promissor
para
utilizao
em
vacina
(Jardim,1995a,
Jardim,
1995b;
Berberich,1998).
Neste contexto o presente trabalho tem
por objetivo, avaliar o perfil da cintica de
crescimento de E. coli recombinante, nos

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meios de cultivo 2xTY e TB (Terrific B roth).

Verificar a capacidade de expresso do
antgeno KMP-11 de Leishmania chagasi,
quando o microrganismo submetido
induo, tendo como molcula indutora o
isopropilbetatiogalactosdeo (IPTG).

MATERIAL E MTODOS

O inculo foi obtido em seguida

ativao, em incubador rotativo, seguindo as
mesmas condies de cultivo adotadas na
ativao. A fermentao para a obteno do
inculo teve uma durao de 8 horas e uma
taxa de inoculao de 10% (v/v), sendo o
volume final contido no erlenmeyer de 50mL.

Microorganismo Utilizado

Fermentao

Nesse
trabalho
o
microrganismo
utilizado foi o clone de Escherichia coli, KMP11, contendo o vetor pQE que apresenta uma
cauda (tag) de seis resduos de histidina
como fuso e permite a purificao das
2+
protenas em colunas quelantes de Ni .

A fermentao para o acompanhamento

da cintica de crescimento foi realizada,
assepticamente, em seguida adio do
inculo, sob as mesmas condies de cultivo e
mesma taxa de inoculao. Os pontos foram
retirados a cada duas horas at que o
microrganismo atingisse a fase estacionria,
sendo a verificao feita pela medida da
absorbncia a 590nm.

Meios de Cultivo
Para a preparao dos meios de cultivo
foi utilizada gua destilada e depois de
completa homogeneizao dos componentes,
o mesmo foi reservado em frascos de
erlenmeyer de 250mL. Em seguida foi
realizada esterilizao em autoclave a 120C
por 20 minutos. Os mesmos foram
suplementados com antibiticos Kanamicina e
Ampicilina nas concentraes de 100g/mL e
25 g/mL, respectivamente. A composio dos
meios 2xTY e TB, em quantidade suficiente
para 1L de gua destilada, est apresentada
na Tabela 1.
Tabela 1 Composio dos meios de
cultivo testados
Meios de cultivo
Composio
2xTy
TB
Triptona (g)
16
12
Extrato de
10
24
Levedura (g)
NaCl (g)
5
KH2PO4 (g)
2,31
K2HPO4 (g)
12,54
Glicerol (mL)
4,0
Ativao do Clone
O clone utilizado nesse trabalho foi
conservado a -20C, em um microtubo de 2
mL em meio Luria-Bertani (LB), sendo que
para a ativao do mesmo foi realizada uma
fermentao de 12 horas, nos meios 2xTY e
TB, em incubador rotativo (Tecnal), utilizando
erlenmeyer de 250mL os quais continham
50mL dos respectivos meios, sob as seguintes
condies: 200 rpm, 37 C e pH inicial 7,0.
Inculo

Induo
A induo foi realizada uma hora aps o
incio da fermentao, o que corresponde ao
incio da fase exponencial de crescimento do
microrganismo. Como molcula indutora
utilizou-se
o
isopropilbetatiogalactosdeo
(IPTG), que tem por finalidade promover a
expresso do antgeno KMP-11. O indutor foi
utilizado numa concentrao final de 1mM.
Concentrao
Substrato

Celular

Consumo

de

A concentrao celular foi determinada

utilizando a metodologia de massa seca. As
amostras, de 2mL, foram retiradas em
duplicata. A anlise do consumo de substrato
foi realizada pelo mtodo do carbono orgnico
total (TOC 5000A Total organic carbon
analyzer Shimadzu).
Quantificao e Verificao da Expresso
do antgeno KMP-11
A quantificao do material extracelular
e intracelular (aps lise celular com tampo de
Urea 8M) foi realizada utilizando o mtodo
de Lowry (Lowry et al, 1951), aps purificao
do material em coluna de afinidade contendo a
resina Ni-SepharoseTM 6 Fast Flow. A
expresso do antgeno foi verificada atravs
de eletroforese em sistema desnaturante SDSPAGE (Laemmli, 1970).

RESULTADOS E DISCUSSO
A avaliao do crescimento de E. coli
recombinante feita a partir de ensaios sem

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induo permitiu a elaborao das curvas de

crescimento, bem como do consumo de
substrato em ambos os meios. As curvas
permitem observar que h ausncia de fase
lag durante o crescimento microbiano. Como
mostram as Figura 1 e 2.

4,0

12,0

[S]

3,5

11,5

3,0

11,0

2,5

10,5

2,0

10,0

1,5

9,5

1,0

9,0
0

10

12

14

16

18

Consumo de Substrato (g/L)

[X]

Concentrao Celular (g/L)

A avaliao dos ensaios, nos meios

2xTY e TB, com induo possibilitou a
verificao da expresso do antgeno KMP-11,
como mostrado na Figura 3.

Figura 3 Verificao da expresso do

antgeno KMP-11, nos meios 2xTY e TB.

20

Tempo (h)

Figura 1 Curva de concentrao celular e

consumo de substrato E. coli, no meio
2xTY sem induo.
18,5

7,5

[S]

18,0

Concentrao Celular (g/L)

6,5

17,5

6,0

17,0

5,5
16,5
5,0
16,0
4,5
15,5
4,0
15,0

3,5
3,0

14,5

2,5

14,0

Concentrao de Substrato (g/L)

[X]

7,0

O ponto 4 mostra a banda protica

intracelular aps a purificao, indicada pela
seta, o ponto 5 corresponde ao extrato bruto
intracelular, ambos expressos no meio 2xTY.
O ponto 8 mostra a banda protica intracelular
aps purificao, indicada pela seta, o ponto 9
corresponde ao extrato bruto intracelular,
ambos expresso no meio TB. Os pontos 2, 3, 6
e 7 correspondem ao material extracelular
aps purificao, onde no foi detectada
nenhuma banda protica.
A curva de concentrao de protena
intracelular, no meio 2xTY, mostrada na
Figura 4

0,040

13,5

2,0
0

10

12

14

16

18

20

Figura 2 Curva de concentrao celular e

consumo de substrato, E. coli no meio TB
sem induo.
Os parmetros cinticos calculados
nessa etapa foram o fator de converso de
substrato em clulas (YX/S) e a mxima
velocidade especfica de crescimento (xmx).
O xmx foi obtido a partir da linearizao da
fase exponencial da curva de concentrao
celular. Para os dois meios estudados foi
-1
obtido xmx = 0,1h . O fator de converso
encontrado foi YX/S = 0,81 e 0,83 para os
meios 2xTY e TB respectivamente. O fator
calculado pela Equao 1

YX / S =

X
t

(1)

Conc. protena intracelular (g/L)

Tempo (h)
0,036

0,032

0,028

0,024

0,020
0

10

12

Tempo (h)

Figura 4 Curva de concentrao de

protena intracelular, E. coli no meio 2xTY
com induo.
O perfil da curva mostra que a produo
est associada ao crescimento, visto que a
mesma se mostra crescente durante toda a
fase exponencial e o seu valor mximo
0,03168g/L, coincide com o final da mesma. O

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ponto referente ao momento de induo pode

ser desconsiderado, pois este consiste num
momento de elevado estresse para a clula e
passvel de erro.
Os parmetros cinticos avaliados
nesses ensaios foram o fator de converso de
substrato em produto (YP/S) e a mxima
velocidade especfica de produo (Pmx).
O Pmx representado pela Equao 2

Pmx =

1 dP
*
[ X ] dt

(2)

O valor encontrado para o meio 2xTY foi

-1
0,17 h . A Figura 5 mostra o perfil da curva de
crescimento no meio TB.

Conc. protena intracelular (g/L)

0,032

0,030

0,028

0,026

0,024

0,022
0

10

Tempo (h)

Figura 5 Curva de concentrao de

protena intracelular, E. coli no meio TB
com induo.
A curva de concentrao de protena, no
meio TB, mostra um perfil de produo
tambm associado ao crescimento, sendo o
valor mximo 0,02933g/L, quantificado pelo
mtodo de Lowry, e coincide com o fim da fase
exponencial de crescimento. O valor de Pmx
-1
encontrado para o meio TB foi 0,13 h .
A diferena no Pmx pode ser
observada quando so analisadas as bandas
proticas no resultado da eletroforese, Figura
3, que mostra uma banda mais espessa para o
meio 2xTY o que coerente com os valores
dos parmetros encontrados.
O fator de converso de substrato em
produto, obtido pela Equao 3.

YP / S =

S
t

(3)

Para os dois meios analisados o fator de

converso encontrado foi o mesmo, YP/S =
-3
1,1*10 .

Panda et al. 1999, estudaram a cintica

da expresso de hormnio ovino de
crescimento e a alta densidade celular, em
batelada e batelada alimentada, expresso por
Escherichia coli. Os parmetros cinticos
apresentados neste trabalho esto em
concordncia com os valores de concentrao
de hormnio de crescimento 400 mg/L e xmx
= 0,15 h-1 obtidos em seu estudo.
Ma et al, 2006, estudaram a influncia
do meio TB, na otimizao da expresso de
vetor funcional, expresso em E. coli, obtendo o
meio TB como um meio satisfatrio para o
crescimento microbiano, da mesma forma que
neste estudo tambm verificou-se o meio TB
como o meio mais satisfatrio para o
crescimento microbiano.
Khan et al. 2009, estudaram o
melhoramento da produo e regenerao de
hormnio caprino de crescimento expresso por
E. coli. Em seu estudo obteve a concentrao
de hormnio igual a 337 mg/L a concentrao
obtida no presente trabalho est em
concordncia com a obtida em seu estudo.
No entanto, na literatura, no h
trabalhos de bioprocessos com utilizao de
clones de E. coli recombinante visando a
produo de antgenos de Leishmania
chagasi.
Os resultados supracitados esto
coerentes com dissertaes de mestrado
desenvolvidas no Laboratrio de Engenharia
Bioqumica da Universidade Federal do Rio
grande do Norte.
Vaz 2008, estudou os parmetros
cinticos da produo dos antgenos eIF e
Lack expressos em E. coli. Os resultados dos
parmetros cinticos aqui calculados esto de
acordo com os apresentados em sua
dissertao.
Da mesma forma avaliao feita neste
trabalho est em concordncia com os
resultados apresentados por Chaves 2009, no
cultivo de E. coli recombinante para produo
do antgeno P36 de Leishmania chagasi.

CONCLUSES
As curvas de crescimento nos dois
meios no apresentaram fase lag, mostrando
uma excelente adaptao do microrganismo
aos meios estudados.
No houve diferenas significativas nos
resultados dos parmetros cinticos avaliados,
houve apenas uma diferena no Pmx, onde o
meio 2xTY apresentou uma maior velocidade
especfica de produo.
A eletroforese mostrou que os meios
2xTY e TB expressaram de forma satisfatria
o antgeno KMP-11, sendo a banda protica

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mais espessa no meio 2xTY, sendo a

produo predominantemente intracelular.
O meio 2xTY se mostrou o mais
promissor, para o cultivo de E.coli
recombinante quanto a expresso do antgeno
KMP-11 de Leishmania chagasi.

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AGRADECIMENTOS
Agradecimento, ao CNPq pelo apoio
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