Profa.

Michely Diniz
Roteiro para aula prática Assunto: Eletroforese em gel de agarose

Concentração de agarose

A eletroforese em gel de agarose permite a separação de moléculas de DNA em função de seu

tamanho. Dependendo da faixa de separação requerida, utilizam-se diferentes concentrações de
agarose, variando em geral de 0,5 a 3%. Assim, para uma boa separação de fragmentos variando de 0,5
a 10 kb, emprega-se uma concentração de 0,8 - 1,0%. Para fragmentos maiores pode-se utilizar uma
concentração menor, de até 0,5%. Nessa concentração o gel já adquire uma consistência muito mole,
dificultando sua manipulação. Para a separação de fragmentos pequenos, de 50 a 500 pb, recomenda-se
uma malha mais fina através do uso de uma concentração alta, de 2 a 3 % de agarose.

Tampão

Para manter o pH pouco alterado ao longo da corrida eletroforética e garantir a formação de um

campo elétrico, utiliza-se uma solução de TBE (Tris/Borato/EDTA) ou de TAE (Tris/Acetato/EDTA) em pH
alcalino. Essas soluções são preparadas concentradas 5X ou 10X e 50X, respectivamente, e são diluídas
no momento do uso. Na nossa prática iremos utilizar o TBE.

Condições de corrida

Normalmente emprega-se tensão (medida em Volts) constante, num valor que varia em função
do comprimento do gel e distância entre os eletrodos da cuba. De modo geral os fabricantes da cuba
sugerem os valores ideais, que variam na faixa de 50 a 150 V, dependendo do tamanho da cuba (8-10 V
por cm).

Metodologia

1. Preparar a cuba utilizando os espaçadores e o pente.

2. Pesar a quantidade de agarose necessária para a preparação do gel, o que depende do volume e
concentração do mesmo. Transferir o conteúdo para um erlenmeyer.
OBS.: Para um gel 1%, iremos fazer metade de um gel que deverá ter 80 ml de volume e, portanto,
composto de 0,8 g de agarose.
3. Diluir em água bidestilada o tampão TBE 10x ou TBE 5X para uma concentração de 0,5X e transferir
para o erlenmeyer contendo a agarose.
4. Levar ao forno de microondas e aquecer até a total dissolução da agarose.
5. Manter o forno ligado até o início da fervura. Daí por diante ligar por períodos curtos a fim de evitar a
fervura e borbulhamento.
6. Deixar a solução esfriar até cerca de 55º C e adicionar o corante brometo de etídeo (EtBr) na
concentração final de 0,5 μg/ml no gel e no tampão. Normalmente utiliza-se uma diluição 1:20.000 de
uma solução 10 mg/ml de brometo de etídeo. Por exemplo, para um gel de 80 ml, utilizar 4,0 μl da
solução de brometo de etídeo.
OBS.: Para um gel de 25mL, utilizar 1,0 μl da solução de brometo de etídeo.
Homogeneizar bem o gel, mas tomando o cuidado de não formar bolhas de ar.
Atenção:

Brometo de etídeo é altamente tóxico, mutagênico e carcinogênico!! Sempre usar luvas e não
permitir nenhum contato físico com o reagente. Em caso de contato, lavar abundantemente com
água.

7. Verter o gel cuidadosamente na cuba, procurando não formar bolhas de ar.

8. Colocar o pente no espaço apropriado na cuba.
9. Deixar o gel esfriar e solidificar por pelo menos 30 minutos.
10. Retirar o pente da cuba e cobrir o gel com tampão TBE 0,5X.
11. Preparar as amostras de DNA + 1/5 do volume de tampão de amostra. O tampão de amostra é
composto, entre outros componentes, de azul de bromofenol e glicerol. O primeiro funciona como corante
indicador da migração das amostras durante a eletroforese. O glicerol confere uma maior densidade às
amostras, permitindo que elas se depositem no fundo dos poços durante a aplicação. (10 ul de amostra +
2 uL do tampão de amostra)
12. Aplicar as amostras cuidadosamente nos poços do gel, uma de cada vez, evitando o vazamento de
material.
13. Conectar a cuba numa fonte de força e iniciar a eletroforese. A eletroforese deve ser interrompida
quando a mancha do azul de bromofenol atingir o final do gel.
14. Remover o gel com cuidado e colocá-lo em cima de um transiluminador de luz UV. Observar e
fotografar se necessário.

O seu relatório deve conter respostas para essas perguntas:

1- Qual as aplicações da técnica de eletroforese?

2- Quais são os tipos de eletroforese?
3- Qual a função do EtBr e do transiluminador?
4- Descreva, colocando a imagem, o resultado da extração de S.cerevisae.
Como você avalia a qualidade e quantidade do material extraído? Por que as bandas ficaram na
parte superior do gel e não na inferior?